547例Dravet綜合征患兒<i>SCN1A</i>基因突變與遺傳特點研究_《癲癇雜志》

作者：

 田小娟 ¹ ,  張月華 ¹ , 楊小玲 ¹ , 許小菁 ² , 劉愛杰 ¹ , 劉曉燕 ¹ , 楊志仙 ¹ , 吳曄 ¹ , 姜玉武 ¹ , 吳希如 ¹

1. 北京大學第一醫院兒科, 北京, 100034;
2. 北京中日友好醫院兒科, 北京, 100029;

關鍵詞：

Dravet綜合征 SCN1A基因新生突變遺傳性突變突變嵌合體

DOI：

10.7507/2096-0247.20160001

視頻：

導出 下載 收藏 掃碼 引用

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的研究Dravet綜合征(Dravet syndrome, DS)患兒SCN1A基因突變與遺傳特點, 分析家系成員臨床表型方法收集2005年2月-2015年4月在北京大學第一醫院兒科就診的DS患兒及其家系成員的臨床資料及外周血DNA, 采用Sanger測序和多重連接依賴的探針擴增技術(Multiple ligation-dependent probe amplification, MLPA)進行SCN1A基因突變篩查。結果共收集547例DS患兒, 有379例(69.3%)發現SCN1A基因突變, 其中錯義突變179例(47.2%), 無義突變78例(20.6%), 移碼突變77例(20.3%), 剪切位點突變37例(9.8%), 基因片段缺失或重復8例(2.1%)。379例SCN1A突變陽性的DS患兒中, 354例均獲得其父母外周血DNA, 證實新生突變占92.9%(329/354), 遺傳性突變占7.1%(25/354), 遺傳性突變包括5例父母一方為突變嵌合體。25例攜帶突變的父母一方中有1例表型為DS, 11例表型為熱性驚厥附加癥, 9例表型為熱性驚厥, 4例表型正常。結論 DS患兒SCN1A基因突變陽性率高, 突變類型以錯義突變和截斷突變(包括無義突變和移碼突變)為主, 少數患兒為該基因片段缺失或重復; DS患兒SCN1A基因突變以新生突變為主, 少數為遺傳性突變, 父母一方可為該基因突變嵌合體; 攜帶突變的父母一方表型輕重不等, 父母一方為突變嵌合體者臨床表型輕或正常。

引用本文： 田小娟, 張月華, 楊小玲, 許小菁, 劉愛杰, 劉曉燕, 楊志仙, 吳曄, 姜玉武, 吳希如. 547例Dravet綜合征患兒SCN1A基因突變與遺傳特點研究. 癲癇雜志, 2016, 2(1): 3-8. doi: 10.7507/2096-0247.20160001 復制

Dravet綜合征(Dravet syndrome，DS)是一種難治性癲癇綜合征，屬于癲癇性腦病。1978年由法國醫生Dravet首次報道，既往又稱嬰兒嚴重肌陣攣癲癇(Severe myoclonic epilepsy of infancy，SMEI)，2001年國際抗癲癇聯盟(ILAE)將本病命名為Dravet綜合征，該病1歲以內主要表現為發熱誘發的發作，1歲后逐漸出現多種形式的無熱發作，但發作仍具有熱敏感性，且易出現癲癇持續狀態，有不同程度的智力損害，對抗癲癇藥物(AEDs)治療效果差^[1]。文獻報道其死亡率明顯高于其他癲癇綜合征^[2]。SCN1A基因是DS的主要致病基因，該基因編碼電壓門控鈉離子通道α1亞單位。文獻報道，在DS患兒中該基因突變率約為70%^[3]，其中90%～95%為新生突變，5%～10%為遺傳性突變^{[4, 5]}。本研究對DS患兒SCN1A基因突變類型、遺傳特點及家系受累成員臨床表型進行總結，為遺傳咨詢提供指導。

資料與方法

1 研究對象

收集2005年2月-2015年4月在北京大學第一醫院兒科就診的DS患兒及其家系成員的臨床資料和外周血DNA，該項研究獲得北京大學第一醫院倫理委員會的批準，所有患兒及其家系成員均簽署知情同意書。

對每例患兒均建立臨床登記表，內容包括姓名、性別、出生日期、民族、發病年齡、發作表現、輔助檢查結果、用藥史、圍產期情況、既往史、家族史。根據ILAE有關癲癇綜合征的分類并參照Baulac等^[6]描述的DS臨床特點進行診斷，診斷標準為：①1歲以內常以熱性驚厥起病(高峰年齡為生后6個月)；②1 ~ 4歲出現多種形式的無熱驚厥，包括全面性或半側陣攣或強直陣攣發作、肌陣攣發作、不典型失神、部分性發作等；③發作具有熱敏感的特點；④易發生癲癇持續狀態；⑤1歲以內智力運動發育正常，以后逐漸出現精神運動發育落后或倒退；可有共濟失調和錐體束征；⑥腦電圖( EEG)在1歲以前多正常，1歲以后出現全導棘慢波、多棘慢波或局灶性、多灶性癇樣放電；⑦多數患兒對抗癲癇藥物(AEDs)療效差。家系中其他成員表型診斷根據2010年ILAE的癲癇發作和癲癇綜合征修訂標準^[7]進行診斷。

2 研究方法

2.1 患兒SCN1A基因檢測

收集患兒及家系成員的外周血，提取DNA。對患兒外周血DNA采用PCR擴增及Sanger測序法進行SCN1A基因檢測。測序結果應用DNA Star軟件包中的Segman^TM軟件進行序列對比分析，必要時以反向引物進行測序驗證。對Sanger測序法未發現SCN1A基因突變的患兒，采用多重連接依賴的探針擴增(Multiple ligation-dependent probe amplification，MLPA)方法，分析SCN1A基因片段缺失或重復。正常序列為GenBank中SCN1A全基因組序列(NC_000002)，編碼區序列(CDS_AB093548)，蛋白質序列(P35498)。排除標準包括在家系和100個正常對照均存在的核苷酸變異，同義突變以及在HGMD專業版數據庫、Pubmed數據庫及UCSC數據庫中已標明的單核苷酸多態性(Single nucleotide polymophism SNP)。蛋白質家族結構域依據ScanProsite (http://www.Expasy.org/)數據庫(PRO_0000048489)，蛋白質保守性分析依據ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。

2.2 患兒父母SCN1A基因檢測

對存在SCN1A基因突變且可獲取家系成員外周血標本的患兒，進一步篩查父母SCN1A基因突變，分析其突變來源，并對攜帶突變的父母一方臨床表型進行分析。

結果

1 SCN1A基因突變分析

共收集547例DS患兒，男303例，女244例。有379例(69.3%)患兒發現SCN1A突變，168例(30.7%)患兒未發現SCN1A突變。其中采用PCR和Sanger測序法發現179例錯義突變(47.2%)，79例無義突變(20.6%)，77例移碼突變(20.3%)，37例剪切位點突變(9.8%)，采用MLPA方法分析發現8例(2.1%)，其中基因片段缺失7例，基因片段重復1例。

2 SCN1A基因突變來源分析結果

379例SCN1A陽性的DS患兒中，354例獲得父母外周血DNA，證實新生突變329例(92.9%)，遺傳性突變25例(7.1%，其中錯義突變18例，無義突變3例，剪切位點突變2例，堿基缺失導致移碼突變2例)。25例遺傳性突變的患兒中(表 1、2)，20例患兒其父母一方為SCN1A相同位點雜合突變，5例患兒其父母一方Sanger測序圖存在與先證者完全相同的堿基缺失，但其雜合峰較野生型峰低，表明其體細胞部分存在突變，屬于體細胞嵌合體，見圖 1、2。

表1 20例DS患兒SCN1A突變來自父母一方雜合突變的臨床資料分析 Table1. The clinical data of 20 SCN1A-positive DS families with one heterozygous transmitting parent

表選項

下載CSV

表1 20例DS患兒SCN1A突變來自父母一方雜合突變的臨床資料分析 Table1. The clinical data of 20 SCN1A-positive DS families with one heterozygous transmitting parent

家系 Pedigree	性別 Sex	起病年齡(月) Age of onset (Months)	發作類型 Seizure type	SE	熱敏感 Heat-sensitive	發育落后 Retardation	隨訪年齡(歲) Follow-up age (Year)	SCN1A突變位點 SCNIA mutation site	對應氨基酸改變 Related amino acid change	受累成員例數 Cases of involved members	其他受累成員表型 Phenotype of other involved members	攜帶SCN1A突變的父母一方表型(末次發作年齡，歲) Phenotype of parents carrying SCNIA mutation
1	女Female	7	GTCS、PS	-	+	+	7	c.1046A > G	Y349C	2	FS+	父Father：FS+(8)
2	男Male	8	PS、aTAS	-	+	+	10	c.4973C > T	T1658M	3	FS, EP	母 Mother：FS(5)
3	女Female	4	GTCS、PS、MS	+	+	+	8	c.2523_2524delGC	T841fsx842	2	FS+	父 Father：FS+(36)
4	男Male	5	GTCS	-	+	+	5	c.568T > C	W190R	1	/	母 Mother：正常	Normal
5	女Female	10	GTCS、PS	+	+	+	7	c.4168G > C	V1390L	3	FS+	父 Father：FS+(23)
6	男Male	6	GTCS、PS、aTAS	-	+	-	7	c.1130G > A	R377Q	6	FS	母 Mother：正常	Normal
7	男Male	3	GTCS、PS	+	+	+	4	c.3661G > C	E1221Q	4	FS、FS+	父 Father：FS+(8)
8	男Male	5	GTCS、PS	+	+	+	2	c.2929G > A, c.4786C > T	V977M, R1596C	3	FS+、AGTCS	母 Mother：FS+(8)
9	男Male	2	GTCS、PS	+	+	+	2	c.695-1G > A	IVS6-1G > A	2	FS+	父 Father：FS+(12)
10	女Female	4	GTCS、PS	+	+	+	9	c.302G > A	R101Q	3	FS+、DS	母 Mother：FS+(9)
11	男Male	8	GTCS、PS	+	+	-	5	c.473+1G > C	IVS3+1G > C	2	FS	父 Father：FS(2)
12	男Male	12	GTCS、PS、MS	-	+	-	5	c.5780G > C	R1927T	3	FS+、EP	母 Mother:FS+(10)
13	女Female	6.5	GTCS、PS	+	+	-	2.5	c.2378C > T, c.3995G > A	T793M, G1332E	2	FS+	母 Mother：FS+(8)
14	女Female	7	GTCS、PS	+	+	-	4	c.3801G > T	M1267I	2	FS	父 Father：FS(6)
15	女Female	10	GTCS	+	+	-	3.5	c.3692G > A	S1231N	2	FS	父 Father：正常	Normal
16	男Male	7	GTCS、PS、aTAS	+	+	-	6	c.2603A > C	K868T	2	FS	父 Father：FS(5)
17	女Female	8	GTCS、PS、MS	+	+	-	4	c.2707A > T	I903F	1	/	母 Mother：正常	Normal
18	男Male	6	GTCS	-	+	-	8	c.1169T > C	L390P	2	DS	母 Mother：DS(43)
19	女Female	8	GTCS	-	+	+	5.5	c.391A > T, c.2878A > G	S131C, M966V	2	FS	母 Mother：FS(4)
20	男Male	7.5	GTCS、PS	+	+	-	2.5	c.314C > T	T105I	4	FS、FS+	父 Father：FS+(8)

表2 5例DS患兒SCN1A突變來自父母一方嵌合突變的臨床資料分析 Table2. The clinical data of 5 SCN1A-positive DS families with one mosaic transmitting parent

表選項

下載CSV

家系 Pedigree	性別 Sex	起病年齡(月) Age of onset (Months)	發作類型 Seizure type	SE	熱敏感 Heat-sensitive	發育落后 Retardation	隨訪年齡(歲) Follow-up age (Year)	SCN1A突變位點 SCNIA mutation site	對應氨基酸改變 Related amino acid change	受累成員例數 Cases of involved members	其他受累成員表型 Phenotype of other involved members	攜帶SCN1A突變的父母一方表型(末次發作年齡，歲) Phenotype of parents carrying SCNIA mutation
21	男Male	5	GTCS、PS、MS、aTAS	+	+	+	14	c.1118delT	L373fsX378	3	FS、FS+	父 Father：FS+(9)
22	男Male	3	GTCS、PS	+	+	+	7	c.2593C > T	R865X	9	FS	父 Father：FS(4)
23	男Male	7	GTCS、PS、MS	-	+	+	6	c.5003C > G	P1668R	2	FS	母 Mother：FS(5)
24	女Female	5	PS、MS	+	+	+	9	c.4302G > A	W1434X	3	FS、FS+	母 Mother：FS(3)
25	男Male	6	GTCS	-	+	+	8	c.5656C > T	R1886X	4	FS、FS+	母	Mother：FS(2)
注：GTCS：全面強直陣攣發作；PS：部分性發作；aTAS：不典型失神發作；MS：肌陣攣發作；SE：癲癇持續狀態；FS:熱性驚厥；FS+：熱性驚厥附加癥；DS：Dravet綜合征；AGTCS：無熱全面強直陣攣發作

圖1 5個嵌合突變遺傳家系的家系圖(箭頭示先證者，m表示突變型，＋表示野生型) Figure1. Pedigrees of 5 DS families with one mosaic parent

圖選項

下載全尺寸圖像

下載幻燈片

圖2 5個嵌合突變遺傳家系的SCN1A基因突變測序圖(箭頭示突變位點) Figure2. Sanger sequencing of 5 DS families with one mosaic parent

圖選項

下載全尺寸圖像

下載幻燈片

3 家系受累成員臨床表型

在20例父母一方為雜合突變的患兒中，10例患兒SCN1A突變來源于父親，10例來源于母親(表 1)。攜帶突變的父母一方中，1例母親表型為Dravet綜合征(家系18)，該患兒母親生后6個月出現反復抽搐發作，具有熱敏感性，9歲出現無熱抽搐，末次隨訪43歲，仍有反復無熱強直陣攣發作，10~12次/年，有智力障礙，臨床表型符合Dravet綜合征；10例攜帶突變的父母一方表型為熱性驚厥附加癥(FS+)，智力均正常(分別見家系1、家系3、家系5、家系7、家系8、家系9、家系10、家系12、家系13和家系20)；5例攜帶突變的父母一方表型為熱性驚厥(FS)，智力均正常(分別見家系2、家系11、家系14、家系16和家系19)。4例攜帶突變的父母一方表型正常(分別見家系4、家系6、家系15和家系17)。

在5例父母一方為突變嵌合體的患兒中，2例患兒SCN1A突變來源于父親，3例來源于母親(表 2、圖 1)，其中1例攜帶突變的父親表型為FS+(家系21)，智力正常。4例攜帶突變的父母一方表型為FS(家系22、家系23、家系24和家系25)，智力均正常。

討論

Dravet綜合征的主要致病基因為SCN1A，目前發現該基因是與癲癇發病相關的最重要的基因之一^[4]，其導致的癲癇臨床表型有DS、全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥(Generalised epilepsy with febrile seizures plus，GEFS+)、肌陣攣-失張力癲癇(Myoclonic-atonic epilepsy，MAE)等^{[3, 8, 9]}，該基因與DS臨床表型最為密切，陽性率在70%左右。目前國際上已報道超過900種SCN1A基因突變類型與DS表型相關(http://www.gzneurosci.com/scn1adata-base/scn1a_variant.php)，且無熱點突變。采用Sanger測序法發現錯義突變與截斷突變(包括無義突變和移碼突變)各占約40%，其余突變類型為剪切位點突變。在SCN1A基因Sanger測序檢測突變陰性的患兒中，采用MLPA方法發現SCN1A基因部分外顯子甚至整個基因缺失或重復導致的染色體重排^{[10, 11]}。本研究顯示547例DS患兒中，379例發現SCN1A基因突變，陽性率為69.3%，其中錯義突變47.2%，截斷突變40.9%(包括無義突變20.6%和移碼突變20.3%)，剪切位點突變9.8%，基因片段缺失或重復2.1%，與國際報道基本一致^[3]。本研究中有30.7%的患兒未發現SCN1A基因突變，不除外存在其他基因突變參與DS發病的可能，DS目前報道的基因突變有SCN1A、PCDH19、GABRG2、SCN1B、SCN9A、GABRA1等^[12-15]。本課題組下一步計劃對SCN1A陰性的DS患兒采用二代測序(Next generation sequencing)，進一步明確是否存在其他基因突變。

DS患兒多數為散發病例，少數患兒可有熱性驚厥或癲癇家族史，家系成員的臨床表型輕重不一。文獻報道SCN1A陽性的DS患兒中大多數突變為新生突變，少數為遺傳性突變，且父母一方可能為SCN1A突變嵌合體^[16-18]。Depienne等^[16]研究了177例SCN1A基因突變患兒父母的SCN1A基因，發現19例遺傳性突變，其中采用定量等位基因特異性PCR方法證實12例患兒的父母一方表現為體細胞突變嵌合體。該文獻顯示DS家系遺傳性突變中，部分可為嵌合突變遺傳，即攜帶SCN1A基因突變的父母一方為突變嵌合體，可以遺傳給子代，導致表型嚴重的DS。本研究中有25例患兒為遺傳性突變，其中5例父母一方為該基因突變嵌合體，突變定量需進一步研究。

另外由于Sanger測序存在檢測極限，本研究組計劃對329例新生突變家系進行實時定量測定，在部分“新生突變”家系可能發現Sanger測序圖不易發現的嵌合突變。對父親為突變嵌合體者，可進一步對其精子突變嵌合體進行定量分析，為遺傳咨詢及產前診斷提供更準確更可靠的指導。

在DS遺傳性突變家系中，攜帶SCN1A基因突變的家系成員臨床表型輕重不一，可表現為DS、FS+或FS，也可完全正常^{[5, 19]}。Depienne等^[16]報道的19例遺傳性突變導致的DS患兒中，10例攜帶突變的父母一方表型較輕，為FS、FS+、特發性全面性癲癇等，9例表型正常(其中7例為突變嵌合體遺傳)。本研究中，20例攜帶雜合突變的父母一方中，1例表型為DS，10例表型為FS+，5例表型為FS，4例表型正常。在5例攜帶嵌合突變的父母一方中，1例表型為FS+，4例表型為FS，與遺傳性雜合突變的父母相比，表型較輕，與國際報道一致。

DS是一種難治性癲癇綜合征，多數患兒預后不良，有智力損害，且癲癇猝死(Sudden unexpected death of epilepsy, SUDEP)發生率高^[20]。對疑似DS的患兒進行SCN1A基因突變檢測有利于早期明確診斷和指導選擇AEDs。對DS患兒SCN1A突變來源進行分析，可指導遺傳咨詢和產前診斷。