外傷后癲癇(Post-traumatic epilepsy, PTE)是創傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)后的一個主要的并發癥, 但遺傳變異在調節PTE發生中的作用尚不清楚。假設TBI誘導的炎癥可能是導致癲癇發生的原因, 對白細胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)基因的遺傳變異情況, 腦脊液和血清中IL-1β水平和IL-1β的腦脊液/血清比值能否預測TBI后PTE的發生進行了評估。共調查了256例中度至重度TBI后患PTE的成年白種人。對IL-1β標記和功能性單核苷酸多態性(SNPs)進行基因分型。對遺傳變異性和PTE的發生進行評估。在調查患者中抽取一部分患者(n=59)在其外傷后1周內收集血清和腦脊液的IL-1β, 并評估它們與IL-1β基因變異及PTE的關系。臨時配對IL-1β的腦脊液/血清比值以反映血清IL-1β水平對腦脊液IL-1β的影響。多變量分析顯示隨著時間推移, 高腦脊液/血清IL-1β比值與PTE風險增加有關(P=0.008)。rs1143634的多變量分析揭示了CT基因型與PTE風險增加有關(P=0.005)。CT基因型組其血清IL-1β水平較低(P=0.014), 腦脊液/血清IL-1β比值較高(P=0.093)。這是第一個揭示PTE風險中的IL-1β基因變異, 及TBI后IL-1β基因變異與血清IL-1β水平的關系和IL-1β比值與PTE風險的關系。根據這些發現, 提出基因和IL-1β比值與PTE的相關性可能歸因于TBI恢復期的血腦屏障完整性的生物變異性包括。為進一步的研究提供了理論依據, 驗證遺傳變異性對TBI后IL-1β產生的影響, 評估造成腦脊液/血清IL-1β比值與PTE相關性的基因介導的信號傳導機制, 及評估減少PTE的靶向IL-1β治療。
引用本文： 徐秦嵐, 楊華俊, 王群. 白細胞介素-1β與外傷后癲癇發生的聯系——一個遺傳學和生物標記物的隊列研究. 癲癇雜志, 2015, 1(3): 261-271. doi: 10.7507/2096-0247.20150044 復制
外傷后癲癇(Post-traumatic epilepsy，PTE)在人群中占癥狀性癲癇的20%和所有癲癇的5%。在貫通性頭外傷、硬膜下血腫(Subdural hematoma，SDH)或凹陷性顱骨骨折的患者中，超過20%患者出現了PTE。外傷至首次癲癇發作的時間差異很大，有報道在外傷后＞10年才出現臨床發作的病例。PTE患者與無PTE患者相比，其死亡率增加，死亡年齡提前。PTE患者在身體、認知和心理社會方面也處于明顯的劣勢，這對結局也產生了不利的影響。盡管有證據否定有效的PET預防性治療，創傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)的患者仍常常接受長期的抗驚厥治療，常導致有害的副作用，并且需要定期監測。因此，為癲癇發生和PTE風險預后確定可靠的生物標記物來對于TBI的治療和恢復具有顯著的臨床意義。
越來越多的證據表明，急性癇性發作后神經膠質細胞的激活及隨后細胞因子的產生在癲癇發生中起了重要的作用。有趣的是，在TBI后也觀察到了類似的神經膠質細胞和細胞因子反應。在癲癇發生中研究最廣泛的生物標記物之一就是白細胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)，IL-1β是一個促炎因子，在中樞神經系統由活化的小膠質細胞和星形膠質細胞產生，也在外周由巨噬細胞和其他免疫細胞產生。在TBI后，受損組織增加細胞外三磷酸腺苷，而三磷酸腺苷則介導中樞神經系統(Central nervous system，CNS)小膠質細胞活化及IL-1β加工和釋放。已有研究報道，TBI后1年內IL-1β表達增加，小膠質細胞活化和細胞死亡，提示IL-1β可能是慢性炎癥的一個有用的標記物，可促進和延續PTE風險。
TBI后IL-1β產生增加，通過可能導致癲癇發生的Ca2+、谷氨酸能和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)能機制提高中樞神經系統過度興奮性和興奮毒性。有趣的的是，在嚙齒類動物模型中，給予外源性IL-1β可增加各種致癇藥物誘發的癲癇發作。此外，通過IL-1β轉化酶(ICE/caspase-1)抑制劑阻斷IL-1β的生物合成途徑可導致化學誘導的首次癲癇發作的時間延遲，頻率減少。對熱性驚厥(FS)和顳葉癲癇(TLE)人群中血漿和腦脊液IL-1β水平的研究顯示了多種不同的結果，但的確暗示了IL-1β與病理學有關。然而，目前尚沒有研究來評估IL-1β水平與TBI后癲癇發生和PTE風險之間的相關性。
癲癇相關的遺傳變異是另一種預測PTE發生的可行的生物標記物途徑。先前研究已經確定了多個單核苷酸多態性(SNPs)與TBI后與癲癇發作的風險增加有關。編碼IL-1β的基因(IL-1β)位于2號染色體長臂的2q12-13區域。1個普遍研究的IL-1β單核苷酸多態性，rs16944，位于啟動子區域的-511位點，被報道可增加TLE常見類型的易感性。有趣的是，在這個相同SNP中的變異使脂多糖(LPS)誘導產生的IL-1β增加了2~3倍。基于IL-1β在炎癥和非外傷性癲癇風險中的已知作用，本研究的目的是為了確定在TBI人群中IL-1β基因的遺傳變異和腦脊液相對于血清中IL-1β生物標記物的概況是否與PTE風險有關。
方法
1 研究設計和受試者
本研究經匹茲堡大學機構審查委員會批準，并通過倫理審查委員會許可。本研究對單學術醫學中心354例受試者進行篩選，作為評估遺傳學和生物標記物對TBI患者結局影響的大型研究的一部分。基于從數據庫獲得的單核苷酸多態性(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)的等位基因頻率信息，本縱向回顧性隊列研究僅限于白種人，并且有32例受試者從分析中被排除。受試者均在18~70歲，有中度到重度的TBI[格拉斯哥昏迷(GCS)評分≤12]，有陽性CT結果明確TBI，并且TBI前無癲癇發作史。有13例受試者GCS＞12，但根據陽性的CT結果將其納入了中度TBI組。6例受試者篩選出TBI前有癲癇發作，將其排除。剩下的受試者(n=316)在種族、年齡、病史和損傷上符合入組標準，并根據PTE分析的標準進行進一步篩選。
2 IL-1β遺傳學人群
首次癲癇發作的時間是我們感興趣的主要變量，將隊列進一步限制為接近PTE的標準。PTE定義為外傷第1周以后的首次癲癇發作。因此，外傷后1周內出現首次發作(n=20)或死亡(n=40)的病例被排除。3例死亡病例在死亡前有PTE的記錄，因此將其納入分析。最終隊列由256例受試者組成。PTE發生的時間過程可因死亡狀態不同而多種多樣，且能影響與PTE狀態以及首次癲癇發作時間的遺傳學關系。除應用Kaplan-Meier(KM)方法評估首次癲癇發作時間之外，還通過雙變量類別分析，去除外傷1周后死亡但無癲癇發作的受試者，對死亡狀態進行處理，剩余206例幸存者。死亡時間通過多變量模型應用Cox回歸分析處理(見統計學方法)。
3 IL-1β水平人群
該組納入IL-1β遺傳學人群中59例受試者，這些受試者均在外傷后1周內有≥2份暫時性匹配的腦脊液與血清樣本可用于IL-1β定量(血清和腦脊液樣本量，n=143)。與IL-1β遺傳學隊列類似，去除1周后死亡但無發作的受試者，剩余幸存者46例進行IL-1β與PTE相關性的雙變量分析。在相關的多變量人群分析中對死亡時間進行調整。
另外，對健康成人對照組血清和腦脊液IL-1β水平進行了評估。在健康對照組中，腦脊液通過腰椎穿刺獲得(n=13)，血清通過靜脈穿刺獲得(n=11)。對照組年齡19~60歲，既往和目前無血液系統疾病、腦損傷及神經系統疾病病史。排除目前懷孕、服用口服避孕藥或使用激素替代治療的女性。
4 重度TBI的重癥監護管理
10年間將已評估的受試者收入神經創傷重癥監護室，并按照重型顱腦損傷的管理指南(Guidelines for the management of severe head injury)進行治療。標準治療包括最初的腦室外引流置管，中心靜脈和動脈置管。必要時對占位性病變行外科手術減壓。對臨床上可疑有癲癇活動的患者間斷行腦電圖(EEG)檢測。按照之前發表的研究，重度TBI患者在外傷后第1周給予PTE預防性治療。
5 人口統計學和損傷數據
對患者的人口統計學變量包括年齡和性別進行記錄。回顧醫療記錄和匹茲堡大學醫學中心(UPMC)創傷登記數據，提取有關GCS評分、損傷機制、凹陷性顱骨骨折、硬膜下血腫(Subdural hematoma，SDH)、創傷嚴重程度評分(ISS)、孤立顱腦損傷狀態(Isolated head injury，IHI)和患者的住院時間的臨床信息。對外傷后第一個24 h最高的GCS評分進行記錄。凹陷性顱骨骨折和/或SDH根據影像學報告確定。僅當醫療記錄中記錄用于癲癇預防時對有關抗癲癇藥物(AEDs)的信息進行記錄。
ISS和IHI根據簡明損傷量表(AIS)評分系統來確定，該評分系統根據特定損傷后的存活能力確定其損傷的嚴重程度。AIS將身體某個部位的損傷程度分成1~6，6代表損傷致命的幾率最高。ISS是衡量大腦結構損傷嚴重程度的方法，定義為3個受累最嚴重的身體區域的得分的平方和。IHI狀態基于頭部AIS得分來評定，≥3考慮為重度TBI。所有受試者的頭部AIS評分均≥3。孤立TBI(IHI)定義為頭部AIS評分≥3而除頭部外的3個損傷最重的身體區域的AIS評分均＜3。非孤立性TBI定義為頭部AIS評分≥3，除頭部外至少有一個身體區域的AIS評分≥3。
6 癲癇發作的評估
對電子醫療記錄中關于PTE和首次癲癇發作時間的信息進行回顧。從患者的病史和查體，急救車、急診室記錄，EEG報告及出院/轉院小結和住院/門診的病程記錄來確定患者是否患PTE。所有在外傷后第一周內提及癲癇發作、驚厥或癲癇持續狀態的均考慮為PTE的證據。PTE隨訪至外傷后3年停止，在隨訪期間所有受試者的PTE狀態均完全確定。在本研究中，受試者之間EEG采集和正常護理標準之間無差異。
7 DNA提取，SNP選擇和基因分型
從每例受試者的全血和腦脊液兩個來源之一中提取DNA。全血收集在乙二胺四乙酸(EDTA)真空管中，加工提取暗黃色表層，用簡易鹽析法提取DNA。腦脊液通過被動引流收集，應用用于從體液中提取的QIAamp DNA提取法提取白細胞中的DNA(Qiagen corporation venlo, 荷蘭，芬洛Qiagen公司)。標記單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)中的rs1143633, rs1143634和rs3136558，其中至少20%的較小等位基因頻率是基于人類基因組單體型圖數據庫(HapMap database)(International HapMap Project國際單體型測繪計劃：http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)和核苷酸多態性數據庫(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)數據篩選出來的。基于build 36中的數據，這些tSNPs捕獲到了基因變異，包括從5′游至啟動子區的1 000個堿基。rs1143634也被認為是一個功能性SNP。此外，功能性SNPs的rs1143627和rs16944也被篩選用于基因分型。
基因分型通過應用TaqMan等位基因分辨技術和市售的5′外切酶Assay-on-Demand TaqMan assays(Applied biosystems incorporated foster city, CA, USA加州福斯特城應用生物系統公司)來完成。運用AB17000和SDS 2.0軟件(Applied biosystems，應用生物系統公司)進行基因擴增和基因型的分配。每一個SNP均進行雙盲基因型分配，并應用原始數據或重新進行基因分型來處理每個差異。哈迪溫伯格平衡驗證了所有SNPs，表明基因型分布在預期的比例。每個SNP調用比值＞95%。
8 腦脊液和血清IL-1β收集和定量
腦脊液樣本在外傷后前6 d每隔12 h收集一次，血清每天收集一次。腦脊液樣本從腦室外引流(EVD)收集袋中獲得，血液樣本通過外周靜脈穿刺獲取。然后收集的樣本經離心、分裝，并保存于-80℃中，直至進行化驗。用Luminex微珠陣列技術(Milliplex Human High Sensitivity 9-plex; Millipore Billerica, MA, USA)來檢測腦脊液和血清中的IL-1β水平。對可用的腦脊液和血清樣本進行IL-1β水平檢測。IL-1β測定的方差系數＜10%。
9 統計學分析
運用SPSS20.0版本(Chicago, IL, USA，伊利諾伊州芝加哥市)和SAS(Cary, NC, USA，北卡羅來納州卡瑞鎮)進行統計學分析。匯總統計平均數、中位數、頻率及均數的標準差(SEM)。運用獨立樣本t檢驗，合適時應用曼-惠特尼檢驗來評估PTE組和連續變量間的差異。運用χ2分析，合適時應用Fisher精確檢驗來評估PTE與分類變量包括IL-1βSNP基因型間的差異。
為在PTE的環境下分析血清和腦脊液IL-1β，外傷后第一周根據每天的IL-1β水平計算出周平均值。每日數值＞3個標準差高于/低于總體均值被認為是異常值，排除在分析之外(腦脊液n=8，血清n=7)。考慮到外周單核細胞和中樞神經系統小膠質細胞均能誘導激活巨噬細胞，我們假設中樞神經系統IL-1β水平代表中樞神經系統生成的和外周生成轉運至中樞神經系統的IL-1β的總和。為了表達血清對CSF中IL-1β水平的相對貢獻，通過劃分暫時匹配的CSF/血清樣本計算IL-1β比值，而后每日比值取平均值獲得IL-1β的周比值。為確定基因和其它變量與細胞因子比例間的關系，通過多變量模型對顯著的雙變量相關性(P＜0.05)進行分析。
對于患PTE的受試者，運用Kaplan-meier生存分析，通過候選SNP變異來檢驗首次癲癇發作時間(8 d~3年)，并調整死亡時間。運用Cox比例風險模型檢驗IL-1β比值和在PTE風險方面顯著不同基因型的SNPs。在Cox模型中，首次癲癇發作時間8 d~3年為獨立變量，PTE發生率為感興趣的事件。多變量Cox模型檢驗IL-1β的SNPs并對在雙變量分析中與PTE狀態有顯著相關性的協變量進行調整。Cox模型對GCS和凹陷性顱骨骨折進行調整，考慮到它們明確與TBI嚴重程度和PTE有關。
結果
1 人群描述
1.1 IL-1β遺傳學人群
共有256例患中度至重度TBI且基因型信息符合PTE分析標準的成年患者。接近81.6%的受試者為男性，18.4%為女性。平均年齡±標準差為(35.0±0.93)歲。GCS評分中位數為6，重癥監護的住院時間(LOS)平均數為(22.5±0.68) d。最常見的損傷機制包括汽車事故(50.4%)，摩托車事故和跌落(11.3%)。249例(97.3%)給予AEDs來預防癲癇發作，其中42例發生PTE(16.4%)。確診為PTE的患者，其中51.2%患者至少有一份臨床發作時的EEG；34.1%患者在急性期治療期間至少有一份EEG。70.7%患者在外傷后的1周~3年訪視期間至少有一份EEG。
表 1提供了基于PTE狀態的人群分類列表。ISS評分較低的患者更易患PTE (P=0.026)。IHI狀態(P=0.033)和SDH (P=0.002)也與PTE有關。死亡率與PTE顯著相關，死亡患者的PTE發生率較低。因此創建了一個死亡率調整后的PTE人群(n=206)。未調整和死亡率調整后的PTE人群在損傷或人口統計學信息方面無明顯差異(數據未列出)。
表1
人口統計數據表
1.2 IL-1β水平人群
有59例中度至重度TBI及具急性細胞因子信息的患者，評估其IL-1β比值和PTE的影響因素(表 1)。相比于那些更嚴重的顱外創傷，IHI狀態與較高水平的IL-1β相關(P=0.047)。SDH也和較高水平的IL-1β比值有關(P=0.037)。較低水平的血清IL-1β與IHI狀態(P=0.007)及SDH (P=0.022)均具有相關性。較高的ISS和較高水平的血清IL-1β具有相關性(P=0.006)。在存活者中PTE患者(n=46)的IL-1β水平和比值比較在損傷和人口統計學信息方面未顯示出顯著差異(數據未列出)。
1.3 健康對照人群
健康對照人群成員均為白種人，其中61.5%為男性(n=8)。平均年齡為(24.62±11.16)歲。關于年齡和性別分布的敏感性分析顯示TBI與對照隊列之間有顯著差異。鑒于有報道稱TBI后的炎癥反應可能有性別差異，我們對對照組內是否存在性別差異進行評估，發現IL-1β在血清(女性0.361±0.230，男性0.072±0.036；P=0.257)，CSF(女性0.030±0.005，男性0.026±0.003；P=0.171)，和其比值(女性0.400±0.667，男性0.441±0.263；P=0.257)中均無顯著差異。在對照組內，年齡與IL-1β的血清，CSF，或比值水平無明顯相關(P=0.686，0.733，0.788)。
2 急性期IL-1β水平
對TBI存活者組和健康對照組的CSF和血清IL-1β的日平均值和周平均值進行比較。TBI組中CSF IL-1β水平的日平均值和周平均值高于對照組(所有比較中均為P≤0.001)(圖 1a)；外傷后第3天的CSF/血清IL-1β比值更高(P=0.025)，且周平均值水平相比于對照組有更高的趨勢(P=0.070)(圖 1b)；血清IL-1β水平與對照組無差異(圖 1c)。IL-1β的血清水平(女性0.377±0.543，男性0.550±1.719；P=0.722)，CSF水平(女性0.088±0.109，男性0.123±0.167；P=0.454)，和比值(女性0.766±0.565，男性1.699±3.771；P=0.589)的周平均值在性別上無明顯差異。
圖1
存活者(n=46)中IL-1β水平?a?與健康對照(n=13)相比較的CSF中IL-1β水平(各時間點P＜0.001)；b?與健康對照(n=11)相比較的CSF/血清IL-1β比值(第3日P=0.025, 周平均P=0.070);c?與健康對照(n)=11相比較的血清IL-1β比較(所有比較P＞0.05)
3 急性期IL-1β水平和PTE發生
在存活者中，PTE患者相比于無PTE者其周IL-1β比值更高(PTE=3.794±2.274；無PTE=0.8207±0.1495；P=0.020)，見圖 2a。血清IL-1β在PTE組更低[PTE=(0.200 7±0.129 0) pg/mL；無PTE=(0.723 9±0.3501) pg/mL；P=0.016], 見圖 2b。PTE組中的CSF IL-1β水平無差異(PTE=0.1964±0.0901；無PTE=0.0876±0.0159；P=0.864)，見圖 2c。表 1顯示了IL-1β水平人群的Cox模型，并對死亡時間、ISS、GCS、SDH和凹陷性顱骨骨折進行調整，顯示隨著時間的推移，高水平的IL-1β比值與PTE風險升高相關[風險比=1.341；可信區間(CI)(1.081-1.665)；P=0.008]，見表 3，圖 3a。類似的Cox模型顯示血清IL-1β和PTE風險無相關性(數據未列出)。
圖2
存活者(n=46)PTE狀態在外傷后第一周平均IL-1β水平?PET的CSF/血清IL-1β比值(P=0.020)；b?PTE的血清IL-1β水平(P=0.016);c?PTE的CSF IL-1β水平(P＞0.05)
表3
Cox比例風險
圖3
Cox比例風險累積PTE風險?a?基于平均CSF/血清IL-1β比值并針對死亡時間(以日記)、年齡、性別、ISS、GCS、SDH及凹陷性顱骨骨折進行調整(P=0.008)的Cox比例風險累積PET風險；b?針對死亡時間(以日記)、年齡、性別、ISS、GCS、SDH及凹陷性顱骨骨折進行調整的rs1143634基因型(P=0.005)的Cox比例風險累積PTE風險
4 rs1143634 S與PTE發生的相關性
表 2描述了所有SNP等位基因頻率和入組的所有人群中死亡率調整后亞組的雙變量相關性。不管是否進行死亡率調整，PTE和rs1143633，rs3136558，rs1143627，rs16944之間無明顯雙變量相關性。但是，雙變量評估顯示rs1143634和PTE風險相關。罹患PTE的患者中，17.6%為CC基因型，47.7%為CT基因型，無TT基因型(P=0.008)。與之前的研究一致，位于rs1143634上的TT基因型患者(n=13)只占所有患者中的很小的百分比。分組基因型分析顯示雜合子(CT)相比純合子患PTE的風險更大(P=0.005)。進行死亡率調整后的Kaplan-Meier生存分析顯示雜合子的首次癲癇發作時間比純合子更早[CT平均值為854.37 d，CI(759.28-949.46)；CC+TT平均值為1010.51 d，CI(959.40-1061.62)；P=0.006]。Cox比例風險模型針對死亡時間、年齡、性別、GCS、ISS、SDH和凹陷性顱骨骨折進行了調整，顯示CT基因型相比純合子與PTE風險增加相關[風險比=2.845；CI (1.372-5.900)；P=0.005，見表 3，圖 3b。
表2
雙變量IL-1β標記SNP結果
5 rs1143634和IL-1β水平的相關性
在死亡率調整后的IL-1β水平人群中，rs1143633、rs1143627、rs3136558和rs16944的受試者IL-1β比值，血清或CSF水平無明顯雙變量相關性。血清IL-1β水平有統計學差異(P=0.014)，且基于rs1143634基因型，IL-1β比值顯示出一個趨勢(P=0.093)。分組基因型分析顯示雜合子比純合子的血清IL-1β水平更低［CT平均值=(0.1571±0.0552) pg/mL；CC+TT平均值=(0.9661±0.5048) pg/mL；P=0.009]。雜合子比純合子的pIL-1β比值也更高[CT平均值=(2.615±1.583)；CC+TT平均值=(0.8251±0.2094)；P=0.062]。rs3136558傾向于和血清IL-1β水平相關(P=0.058)，但進一步分析顯示在我們的人群中rs3136558和rs1143634間存在高度的連鎖不平衡(P≤0.001)。
討論
PTE是TBI的主要并發癥，導致傷殘增加，且患者需長期AEDs治療。PTE和癲癇發生的潛在機制尚不清楚，盡管PTE有特征性的臨床危險因素，但并非所有存在這些危險因素的患者都發生PTE。在某些個體中，遺傳變異和TBI相關的生物反應可解釋增加的PTE發病率。最新的癲癇基準研究進展報告基于最新發表的研究結果將IL-1β列為癲癇潛在的生物標記物。我們實驗室此前的工作顯示每日服用左乙拉西坦，一種廣譜的AED，可減少實驗性TBI動物局部腦組織IL-1β的表達，這可能是其在TBI中抗癲癇作用潛在的原因。該觀察結果連同其它顯示IL-1β和非外傷性癲癇關系的資料，為研究IL-1β和PTE的發生提供了理論基礎。
IL-1β于中樞神經系統和外周產生。在健康個體中，CNS IL-1β水平很低，且有助于諸如記憶形成和睡眠等生理過程。而TBI與IL-1β表達增加相關，這種表達增加可在外傷后持續數月。IL-1β水平升高與早期神經元死亡和興奮性毒性有關，提示了在TBI恢復期IL-1β調控的重要性。基于這些研究結果及已知的IL-1β誘發癲癇的效應，我們假設TBI引起的早期IL-1β水平變化可能與PTE產生相關。鑒于TBI后血腦屏障(BBB)破壞和外周炎癥反應，以及CSF IL-1β水平很可能由CNS和外周產生的總產物，我們也發現CSF/血清IL-1β比值可作為反映血清IL-1β對CSF IL-1β水平貢獻的指標盡管我們的數據顯示PTE組CSF IL-1β水平升高，但是相比與對照組，PTE組和無PTE組的CSF IL-1β平均值均無明顯差異。血清IL-1β水平也與對照組無明顯差異。但是，PTE組血清IL-1β水平顯著低于無PTE組，表明兩組間血清IL-1β的相對差值轉移到了CNS中。有意思的是，外傷后第1周高CSF/血清IL-1β比值的患者其PTE風險顯著升高，表明盡管TBI后CSF IL-1β絕對值升高，但外周的IL-1β的相對貢獻是最終PTE發生最為敏感的測量指標。這個相關性很有趣，并且對于早期篩查有一定意義，但仍需要開展進一步工作來確定血清IL-1β和比值的關系是否/如何反映有關持續的外周炎癥狀態，第1年內中度至重度損傷臨床人群的特點，可能在長期過程中導致癲癇發作和PTE發生。多變量Cox模型顯示只有IL-1β比值與PTE風險顯著相關，表明CSF/血清比值似乎增加了外周炎癥對CNS病理的貢獻的特性。
有意思的是，在一報道中提到II型IL-1β轉運蛋白可通過涉及腦微血管內皮細胞的體外途徑穿過BBB將IL-1β由血液轉運至腦。盡管臨床TBI研究表明，某些細胞因子順腦到血液的轉運梯度進行轉運，但類似的研究并不能確定這樣的IL-1β轉運梯度。我們的結果顯示相對于CSF，在對IL-1β血液到腦梯度有提示意義的IL-1β水平的隊列中存在高血清IL-1β濃度(圖 1)。此外，PTE組中的高CSF/血清比值也支持IL-1β血液到腦轉運的假設(圖 2)。這一發現，與rs1143634和血清水平及比值的關系，也表明遺傳變異影響IL-1β轉運至CNS能力，可作為進一步探索IL-1β病理學如何影響PTE風險的合理的生物學機制。
但目前仍需要進一步研究來確證為何TBI后高IL-1β比例可以預測外傷后幾個月到幾年時間里PTE的發生。增強的急性炎癥反應可能可以預測可導致癲癇和PTE發生的長期慢性(CNS和外周)炎癥及BBB功能障礙。要強調的是，血清細胞因子水平在中度至重度TBI后其水平升高至少維持1年，可能繼而導致BBB功能障礙和持續的CNS炎癥。在某些細胞中，包括激活的小膠質細胞，IL-1β可誘導IL-1βmRNA產生，導致一個積極的反饋系統使CNS炎癥持續存在。有意思的是，臨床影像學研究表明在TBI后小膠質細胞的激活可持續數年，同時伴隨進行性白質變性。此外，研究表明TBI后多達1年的時間里都存在進行性細胞死亡，提示與細胞凋亡相關的細胞外ATP的升高可能慢性激活了產生IL-1β所需的炎癥小體。
PTE組中高急性期CSF/血清IL-1β比值可能預示著多種與慢性炎癥有關的長期生理變化，這些變化可促進癲癇發作。腦室內IL-1β可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經系統，減少外周細胞的免疫反應，抑制巨噬細胞分泌IL-1β。因此，正如本研究中報道，PTE患者中該神經免疫調節系統急性過度活化，導致血清IL-1β水平降低。研究顯示IL-1β升高和/或IL-1β受體拮抗劑減少(IL-1α)明顯的改變了化學誘發癲癇發作的頻率、持續時間和發作閾值。有關點燃模型研究中癲癇發作過程延遲抑制了神經生長因子(NGF)。值得注意的是，IL-1β同時上調體外和體內的NGF，在TBI大鼠模型中應用IL-1α抑制了NGF-介導的可塑性。但仍需要進一步工作來辨別CSF/血清IL-1β比值是否能反應這些生理狀態的改變。
IL-1β基因變異分析顯示了rs1143634基因型，PTE，血清IL-1β水平和CSF/血清IL-1β比值的關系。rs1143634上為CT基因型的患者PTE風險明顯升高，且首次癲癇發作的時間明顯縮短(平均縮短5個月)，表明局部的變異促使了癲癇發生。盡管該SNP的最小等位基因頻率(MAF)為0.25，但僅有13例受試者為TT純合子。有意思的是，這幾位受試者均未患PTE。雖然TT組樣本量較小，可能受樣本偏差影響，但數據提示了TT純合子對PTE起相對保護作用，而CT雜合子則為獨特的風險組。而且，將來的驗證研究不太可能產生劑量反應與PTE風險的關系。
雜合子關聯分析出現編碼膜受體的基因變異，可導致多重作用影響有趣的表現型(如受體蛋白異二聚體對比二聚體膜運輸的差別效應)。我們之前的研究報道與PTE有關的rs10920573雜合子位于ADORA1基因位點。該基因雖然不是膜受體，但可推測不同的IL-1β亞型混合的細胞外環境，理論上對于靶受體結合、激活和導致PTE風險增加的炎癥途徑的下游信號可有不同的作用。考慮到rs1143634上的雜合子也和血清IL-1β減少有關，IL-1β可影響BBB滲透性，因此與IL-1β生理機制相關的位于rs1143634上的雜合子可不同程度促進血清IL-1β轉運至CSF。IL-1β調節其表達和BBB載體轉運蛋白如ATP結合盒式(ABC)轉運蛋白的流出功能，而在TBI中基因變異可能對于IL-1β水平和其他分子如皮質醇有差別效應。值得注意的是，ABC轉運蛋白也促進了激活的巨噬細胞釋放IL-1β，該作用可能與慢性激活的小膠質細胞12釋放IL-1β導致PTE發生特別相關。最后，TBI后主要的普遍的表觀遺傳修飾被人們所知，鑒于之前有關IL-1β啟動子如何產生表觀遺傳變異的報告，這可能是進一步研究rs1143634與PTE風險增加的相關機制的另一領域。
rs1143634的SNP位于IL-1β基因的外顯子5的編碼區域，但其功能仍然是有爭議的。研究表明等位基因T與IL-1β產生增加有關，而其他人發現IL-1β的釋放并無差異。rs1143634標記了2號染色體上IL-1β基因的將近1kb的區域，其中該區域也包括錯義的SNPs rs141525736，rs139843362和rs114640380(HapMap phase 3；hapmap.org)。但是這些SNPs并不是高度變異的，且尚無報道其相關功能文獻。此外，目前尚不清楚LD衰減位于rs1143634標記的哪個區域，因此代表rs1143634的DNA區額外的基因分型對更好的了解功能影響的變化包括該區域的雜合性可能有一定幫助。
ISS，IHI和SDH均與PTE有關。若患者ISS評分較低，或患有IHI、SDH更有可能患PTE。由于ISS是一種總體的解剖損傷嚴重程度評分，因此IHI患者同時ISS評分較低也不足為奇。但根據多變量分析，ISS或IHI并不是主要的PTE預測因素。我們的結果也支持先前顯示SDH能增加PTE風險的研究。
盡管有了IL-1β與PTE之間聯系的一些有前景的發現，也必須考慮到一些局限性。病歷資料摘要很難準確評估癲癇復發和PTE的嚴重性。因此，我們研究中沒有追蹤癲癇復發。此外，插管和鎮靜的受試者可能錯過其外傷1周以后的亞臨床發作或無抽搐發作。且本次研究的樣本只包含中度至重度損傷的白種人，從而限制了不同種族背景人群的普遍性。此外，總體的樣本大小適合遺傳相關的研究，但生物標志物和基因分析的人群是目前所能獲得的最大的中度至重度TBI人群。雖然如此，就目前所知，這是第一個研究報道提示血清IL-1β對CSF IL-1β水平有貢獻，以及PTE與IL-1β基因變異有關。但仍需要進一步在多個獨立的群體中來重復這些發現以更好的理解與這些關系相關的機制。這些研究結果如果被證實，可能激起進一步的研究來檢驗靶向IL-1β預防和治療PTE；也可支持未來工作配合EEG篩查和臨床護理途徑評估遺傳篩查的實用性，通過篩查進行風險分層的方式來治療和預防PTE。另外，探索基因變異和TBI引起的炎癥反應有關的其它生物標志物水平與PTE的發生也是十分必要的。
外傷后癲癇(Post-traumatic epilepsy，PTE)在人群中占癥狀性癲癇的20%和所有癲癇的5%。在貫通性頭外傷、硬膜下血腫(Subdural hematoma，SDH)或凹陷性顱骨骨折的患者中，超過20%患者出現了PTE。外傷至首次癲癇發作的時間差異很大，有報道在外傷后＞10年才出現臨床發作的病例。PTE患者與無PTE患者相比，其死亡率增加，死亡年齡提前。PTE患者在身體、認知和心理社會方面也處于明顯的劣勢，這對結局也產生了不利的影響。盡管有證據否定有效的PET預防性治療，創傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)的患者仍常常接受長期的抗驚厥治療，常導致有害的副作用，并且需要定期監測。因此，為癲癇發生和PTE風險預后確定可靠的生物標記物來對于TBI的治療和恢復具有顯著的臨床意義。
越來越多的證據表明，急性癇性發作后神經膠質細胞的激活及隨后細胞因子的產生在癲癇發生中起了重要的作用。有趣的是，在TBI后也觀察到了類似的神經膠質細胞和細胞因子反應。在癲癇發生中研究最廣泛的生物標記物之一就是白細胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)，IL-1β是一個促炎因子，在中樞神經系統由活化的小膠質細胞和星形膠質細胞產生，也在外周由巨噬細胞和其他免疫細胞產生。在TBI后，受損組織增加細胞外三磷酸腺苷，而三磷酸腺苷則介導中樞神經系統(Central nervous system，CNS)小膠質細胞活化及IL-1β加工和釋放。已有研究報道，TBI后1年內IL-1β表達增加，小膠質細胞活化和細胞死亡，提示IL-1β可能是慢性炎癥的一個有用的標記物，可促進和延續PTE風險。
TBI后IL-1β產生增加，通過可能導致癲癇發生的Ca2+、谷氨酸能和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)能機制提高中樞神經系統過度興奮性和興奮毒性。有趣的的是，在嚙齒類動物模型中，給予外源性IL-1β可增加各種致癇藥物誘發的癲癇發作。此外，通過IL-1β轉化酶(ICE/caspase-1)抑制劑阻斷IL-1β的生物合成途徑可導致化學誘導的首次癲癇發作的時間延遲，頻率減少。對熱性驚厥(FS)和顳葉癲癇(TLE)人群中血漿和腦脊液IL-1β水平的研究顯示了多種不同的結果，但的確暗示了IL-1β與病理學有關。然而，目前尚沒有研究來評估IL-1β水平與TBI后癲癇發生和PTE風險之間的相關性。
癲癇相關的遺傳變異是另一種預測PTE發生的可行的生物標記物途徑。先前研究已經確定了多個單核苷酸多態性(SNPs)與TBI后與癲癇發作的風險增加有關。編碼IL-1β的基因(IL-1β)位于2號染色體長臂的2q12-13區域。1個普遍研究的IL-1β單核苷酸多態性，rs16944，位于啟動子區域的-511位點，被報道可增加TLE常見類型的易感性。有趣的是，在這個相同SNP中的變異使脂多糖(LPS)誘導產生的IL-1β增加了2~3倍。基于IL-1β在炎癥和非外傷性癲癇風險中的已知作用，本研究的目的是為了確定在TBI人群中IL-1β基因的遺傳變異和腦脊液相對于血清中IL-1β生物標記物的概況是否與PTE風險有關。
方法
1 研究設計和受試者
本研究經匹茲堡大學機構審查委員會批準，并通過倫理審查委員會許可。本研究對單學術醫學中心354例受試者進行篩選，作為評估遺傳學和生物標記物對TBI患者結局影響的大型研究的一部分。基于從數據庫獲得的單核苷酸多態性(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)的等位基因頻率信息，本縱向回顧性隊列研究僅限于白種人，并且有32例受試者從分析中被排除。受試者均在18~70歲，有中度到重度的TBI[格拉斯哥昏迷(GCS)評分≤12]，有陽性CT結果明確TBI，并且TBI前無癲癇發作史。有13例受試者GCS＞12，但根據陽性的CT結果將其納入了中度TBI組。6例受試者篩選出TBI前有癲癇發作，將其排除。剩下的受試者(n=316)在種族、年齡、病史和損傷上符合入組標準，并根據PTE分析的標準進行進一步篩選。
2 IL-1β遺傳學人群
首次癲癇發作的時間是我們感興趣的主要變量，將隊列進一步限制為接近PTE的標準。PTE定義為外傷第1周以后的首次癲癇發作。因此，外傷后1周內出現首次發作(n=20)或死亡(n=40)的病例被排除。3例死亡病例在死亡前有PTE的記錄，因此將其納入分析。最終隊列由256例受試者組成。PTE發生的時間過程可因死亡狀態不同而多種多樣，且能影響與PTE狀態以及首次癲癇發作時間的遺傳學關系。除應用Kaplan-Meier(KM)方法評估首次癲癇發作時間之外，還通過雙變量類別分析，去除外傷1周后死亡但無癲癇發作的受試者，對死亡狀態進行處理，剩余206例幸存者。死亡時間通過多變量模型應用Cox回歸分析處理(見統計學方法)。
3 IL-1β水平人群
該組納入IL-1β遺傳學人群中59例受試者，這些受試者均在外傷后1周內有≥2份暫時性匹配的腦脊液與血清樣本可用于IL-1β定量(血清和腦脊液樣本量，n=143)。與IL-1β遺傳學隊列類似，去除1周后死亡但無發作的受試者，剩余幸存者46例進行IL-1β與PTE相關性的雙變量分析。在相關的多變量人群分析中對死亡時間進行調整。
另外，對健康成人對照組血清和腦脊液IL-1β水平進行了評估。在健康對照組中，腦脊液通過腰椎穿刺獲得(n=13)，血清通過靜脈穿刺獲得(n=11)。對照組年齡19~60歲，既往和目前無血液系統疾病、腦損傷及神經系統疾病病史。排除目前懷孕、服用口服避孕藥或使用激素替代治療的女性。
4 重度TBI的重癥監護管理
10年間將已評估的受試者收入神經創傷重癥監護室，并按照重型顱腦損傷的管理指南(Guidelines for the management of severe head injury)進行治療。標準治療包括最初的腦室外引流置管，中心靜脈和動脈置管。必要時對占位性病變行外科手術減壓。對臨床上可疑有癲癇活動的患者間斷行腦電圖(EEG)檢測。按照之前發表的研究，重度TBI患者在外傷后第1周給予PTE預防性治療。
5 人口統計學和損傷數據
對患者的人口統計學變量包括年齡和性別進行記錄。回顧醫療記錄和匹茲堡大學醫學中心(UPMC)創傷登記數據，提取有關GCS評分、損傷機制、凹陷性顱骨骨折、硬膜下血腫(Subdural hematoma，SDH)、創傷嚴重程度評分(ISS)、孤立顱腦損傷狀態(Isolated head injury，IHI)和患者的住院時間的臨床信息。對外傷后第一個24 h最高的GCS評分進行記錄。凹陷性顱骨骨折和/或SDH根據影像學報告確定。僅當醫療記錄中記錄用于癲癇預防時對有關抗癲癇藥物(AEDs)的信息進行記錄。
ISS和IHI根據簡明損傷量表(AIS)評分系統來確定，該評分系統根據特定損傷后的存活能力確定其損傷的嚴重程度。AIS將身體某個部位的損傷程度分成1~6，6代表損傷致命的幾率最高。ISS是衡量大腦結構損傷嚴重程度的方法，定義為3個受累最嚴重的身體區域的得分的平方和。IHI狀態基于頭部AIS得分來評定，≥3考慮為重度TBI。所有受試者的頭部AIS評分均≥3。孤立TBI(IHI)定義為頭部AIS評分≥3而除頭部外的3個損傷最重的身體區域的AIS評分均＜3。非孤立性TBI定義為頭部AIS評分≥3，除頭部外至少有一個身體區域的AIS評分≥3。
6 癲癇發作的評估
對電子醫療記錄中關于PTE和首次癲癇發作時間的信息進行回顧。從患者的病史和查體，急救車、急診室記錄，EEG報告及出院/轉院小結和住院/門診的病程記錄來確定患者是否患PTE。所有在外傷后第一周內提及癲癇發作、驚厥或癲癇持續狀態的均考慮為PTE的證據。PTE隨訪至外傷后3年停止，在隨訪期間所有受試者的PTE狀態均完全確定。在本研究中，受試者之間EEG采集和正常護理標準之間無差異。
7 DNA提取，SNP選擇和基因分型
從每例受試者的全血和腦脊液兩個來源之一中提取DNA。全血收集在乙二胺四乙酸(EDTA)真空管中，加工提取暗黃色表層，用簡易鹽析法提取DNA。腦脊液通過被動引流收集，應用用于從體液中提取的QIAamp DNA提取法提取白細胞中的DNA(Qiagen corporation venlo, 荷蘭，芬洛Qiagen公司)。標記單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)中的rs1143633, rs1143634和rs3136558，其中至少20%的較小等位基因頻率是基于人類基因組單體型圖數據庫(HapMap database)(International HapMap Project國際單體型測繪計劃：http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)和核苷酸多態性數據庫(dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP)數據篩選出來的。基于build 36中的數據，這些tSNPs捕獲到了基因變異，包括從5′游至啟動子區的1 000個堿基。rs1143634也被認為是一個功能性SNP。此外，功能性SNPs的rs1143627和rs16944也被篩選用于基因分型。
基因分型通過應用TaqMan等位基因分辨技術和市售的5′外切酶Assay-on-Demand TaqMan assays(Applied biosystems incorporated foster city, CA, USA加州福斯特城應用生物系統公司)來完成。運用AB17000和SDS 2.0軟件(Applied biosystems，應用生物系統公司)進行基因擴增和基因型的分配。每一個SNP均進行雙盲基因型分配，并應用原始數據或重新進行基因分型來處理每個差異。哈迪溫伯格平衡驗證了所有SNPs，表明基因型分布在預期的比例。每個SNP調用比值＞95%。
8 腦脊液和血清IL-1β收集和定量
腦脊液樣本在外傷后前6 d每隔12 h收集一次，血清每天收集一次。腦脊液樣本從腦室外引流(EVD)收集袋中獲得，血液樣本通過外周靜脈穿刺獲取。然后收集的樣本經離心、分裝，并保存于-80℃中，直至進行化驗。用Luminex微珠陣列技術(Milliplex Human High Sensitivity 9-plex; Millipore Billerica, MA, USA)來檢測腦脊液和血清中的IL-1β水平。對可用的腦脊液和血清樣本進行IL-1β水平檢測。IL-1β測定的方差系數＜10%。
9 統計學分析
運用SPSS20.0版本(Chicago, IL, USA，伊利諾伊州芝加哥市)和SAS(Cary, NC, USA，北卡羅來納州卡瑞鎮)進行統計學分析。匯總統計平均數、中位數、頻率及均數的標準差(SEM)。運用獨立樣本t檢驗，合適時應用曼-惠特尼檢驗來評估PTE組和連續變量間的差異。運用χ2分析，合適時應用Fisher精確檢驗來評估PTE與分類變量包括IL-1βSNP基因型間的差異。
為在PTE的環境下分析血清和腦脊液IL-1β，外傷后第一周根據每天的IL-1β水平計算出周平均值。每日數值＞3個標準差高于/低于總體均值被認為是異常值，排除在分析之外(腦脊液n=8，血清n=7)。考慮到外周單核細胞和中樞神經系統小膠質細胞均能誘導激活巨噬細胞，我們假設中樞神經系統IL-1β水平代表中樞神經系統生成的和外周生成轉運至中樞神經系統的IL-1β的總和。為了表達血清對CSF中IL-1β水平的相對貢獻，通過劃分暫時匹配的CSF/血清樣本計算IL-1β比值，而后每日比值取平均值獲得IL-1β的周比值。為確定基因和其它變量與細胞因子比例間的關系，通過多變量模型對顯著的雙變量相關性(P＜0.05)進行分析。
對于患PTE的受試者，運用Kaplan-meier生存分析，通過候選SNP變異來檢驗首次癲癇發作時間(8 d~3年)，并調整死亡時間。運用Cox比例風險模型檢驗IL-1β比值和在PTE風險方面顯著不同基因型的SNPs。在Cox模型中，首次癲癇發作時間8 d~3年為獨立變量，PTE發生率為感興趣的事件。多變量Cox模型檢驗IL-1β的SNPs并對在雙變量分析中與PTE狀態有顯著相關性的協變量進行調整。Cox模型對GCS和凹陷性顱骨骨折進行調整，考慮到它們明確與TBI嚴重程度和PTE有關。
結果
1 人群描述
1.1 IL-1β遺傳學人群
共有256例患中度至重度TBI且基因型信息符合PTE分析標準的成年患者。接近81.6%的受試者為男性，18.4%為女性。平均年齡±標準差為(35.0±0.93)歲。GCS評分中位數為6，重癥監護的住院時間(LOS)平均數為(22.5±0.68) d。最常見的損傷機制包括汽車事故(50.4%)，摩托車事故和跌落(11.3%)。249例(97.3%)給予AEDs來預防癲癇發作，其中42例發生PTE(16.4%)。確診為PTE的患者，其中51.2%患者至少有一份臨床發作時的EEG；34.1%患者在急性期治療期間至少有一份EEG。70.7%患者在外傷后的1周~3年訪視期間至少有一份EEG。
表 1提供了基于PTE狀態的人群分類列表。ISS評分較低的患者更易患PTE (P=0.026)。IHI狀態(P=0.033)和SDH (P=0.002)也與PTE有關。死亡率與PTE顯著相關，死亡患者的PTE發生率較低。因此創建了一個死亡率調整后的PTE人群(n=206)。未調整和死亡率調整后的PTE人群在損傷或人口統計學信息方面無明顯差異(數據未列出)。
表1
人口統計數據表
1.2 IL-1β水平人群
有59例中度至重度TBI及具急性細胞因子信息的患者，評估其IL-1β比值和PTE的影響因素(表 1)。相比于那些更嚴重的顱外創傷，IHI狀態與較高水平的IL-1β相關(P=0.047)。SDH也和較高水平的IL-1β比值有關(P=0.037)。較低水平的血清IL-1β與IHI狀態(P=0.007)及SDH (P=0.022)均具有相關性。較高的ISS和較高水平的血清IL-1β具有相關性(P=0.006)。在存活者中PTE患者(n=46)的IL-1β水平和比值比較在損傷和人口統計學信息方面未顯示出顯著差異(數據未列出)。
1.3 健康對照人群
健康對照人群成員均為白種人，其中61.5%為男性(n=8)。平均年齡為(24.62±11.16)歲。關于年齡和性別分布的敏感性分析顯示TBI與對照隊列之間有顯著差異。鑒于有報道稱TBI后的炎癥反應可能有性別差異，我們對對照組內是否存在性別差異進行評估，發現IL-1β在血清(女性0.361±0.230，男性0.072±0.036；P=0.257)，CSF(女性0.030±0.005，男性0.026±0.003；P=0.171)，和其比值(女性0.400±0.667，男性0.441±0.263；P=0.257)中均無顯著差異。在對照組內，年齡與IL-1β的血清，CSF，或比值水平無明顯相關(P=0.686，0.733，0.788)。
2 急性期IL-1β水平
對TBI存活者組和健康對照組的CSF和血清IL-1β的日平均值和周平均值進行比較。TBI組中CSF IL-1β水平的日平均值和周平均值高于對照組(所有比較中均為P≤0.001)(圖 1a)；外傷后第3天的CSF/血清IL-1β比值更高(P=0.025)，且周平均值水平相比于對照組有更高的趨勢(P=0.070)(圖 1b)；血清IL-1β水平與對照組無差異(圖 1c)。IL-1β的血清水平(女性0.377±0.543，男性0.550±1.719；P=0.722)，CSF水平(女性0.088±0.109，男性0.123±0.167；P=0.454)，和比值(女性0.766±0.565，男性1.699±3.771；P=0.589)的周平均值在性別上無明顯差異。
圖1
存活者(n=46)中IL-1β水平?a?與健康對照(n=13)相比較的CSF中IL-1β水平(各時間點P＜0.001)；b?與健康對照(n=11)相比較的CSF/血清IL-1β比值(第3日P=0.025, 周平均P=0.070);c?與健康對照(n)=11相比較的血清IL-1β比較(所有比較P＞0.05)
3 急性期IL-1β水平和PTE發生
在存活者中，PTE患者相比于無PTE者其周IL-1β比值更高(PTE=3.794±2.274；無PTE=0.8207±0.1495；P=0.020)，見圖 2a。血清IL-1β在PTE組更低[PTE=(0.200 7±0.129 0) pg/mL；無PTE=(0.723 9±0.3501) pg/mL；P=0.016], 見圖 2b。PTE組中的CSF IL-1β水平無差異(PTE=0.1964±0.0901；無PTE=0.0876±0.0159；P=0.864)，見圖 2c。表 1顯示了IL-1β水平人群的Cox模型，并對死亡時間、ISS、GCS、SDH和凹陷性顱骨骨折進行調整，顯示隨著時間的推移，高水平的IL-1β比值與PTE風險升高相關[風險比=1.341；可信區間(CI)(1.081-1.665)；P=0.008]，見表 3，圖 3a。類似的Cox模型顯示血清IL-1β和PTE風險無相關性(數據未列出)。
圖2
存活者(n=46)PTE狀態在外傷后第一周平均IL-1β水平?PET的CSF/血清IL-1β比值(P=0.020)；b?PTE的血清IL-1β水平(P=0.016);c?PTE的CSF IL-1β水平(P＞0.05)
表3
Cox比例風險
圖3
Cox比例風險累積PTE風險?a?基于平均CSF/血清IL-1β比值并針對死亡時間(以日記)、年齡、性別、ISS、GCS、SDH及凹陷性顱骨骨折進行調整(P=0.008)的Cox比例風險累積PET風險；b?針對死亡時間(以日記)、年齡、性別、ISS、GCS、SDH及凹陷性顱骨骨折進行調整的rs1143634基因型(P=0.005)的Cox比例風險累積PTE風險
4 rs1143634 S與PTE發生的相關性
表 2描述了所有SNP等位基因頻率和入組的所有人群中死亡率調整后亞組的雙變量相關性。不管是否進行死亡率調整，PTE和rs1143633，rs3136558，rs1143627，rs16944之間無明顯雙變量相關性。但是，雙變量評估顯示rs1143634和PTE風險相關。罹患PTE的患者中，17.6%為CC基因型，47.7%為CT基因型，無TT基因型(P=0.008)。與之前的研究一致，位于rs1143634上的TT基因型患者(n=13)只占所有患者中的很小的百分比。分組基因型分析顯示雜合子(CT)相比純合子患PTE的風險更大(P=0.005)。進行死亡率調整后的Kaplan-Meier生存分析顯示雜合子的首次癲癇發作時間比純合子更早[CT平均值為854.37 d，CI(759.28-949.46)；CC+TT平均值為1010.51 d，CI(959.40-1061.62)；P=0.006]。Cox比例風險模型針對死亡時間、年齡、性別、GCS、ISS、SDH和凹陷性顱骨骨折進行了調整，顯示CT基因型相比純合子與PTE風險增加相關[風險比=2.845；CI (1.372-5.900)；P=0.005，見表 3，圖 3b。
表2
雙變量IL-1β標記SNP結果
5 rs1143634和IL-1β水平的相關性
在死亡率調整后的IL-1β水平人群中，rs1143633、rs1143627、rs3136558和rs16944的受試者IL-1β比值，血清或CSF水平無明顯雙變量相關性。血清IL-1β水平有統計學差異(P=0.014)，且基于rs1143634基因型，IL-1β比值顯示出一個趨勢(P=0.093)。分組基因型分析顯示雜合子比純合子的血清IL-1β水平更低［CT平均值=(0.1571±0.0552) pg/mL；CC+TT平均值=(0.9661±0.5048) pg/mL；P=0.009]。雜合子比純合子的pIL-1β比值也更高[CT平均值=(2.615±1.583)；CC+TT平均值=(0.8251±0.2094)；P=0.062]。rs3136558傾向于和血清IL-1β水平相關(P=0.058)，但進一步分析顯示在我們的人群中rs3136558和rs1143634間存在高度的連鎖不平衡(P≤0.001)。
討論
PTE是TBI的主要并發癥，導致傷殘增加，且患者需長期AEDs治療。PTE和癲癇發生的潛在機制尚不清楚，盡管PTE有特征性的臨床危險因素，但并非所有存在這些危險因素的患者都發生PTE。在某些個體中，遺傳變異和TBI相關的生物反應可解釋增加的PTE發病率。最新的癲癇基準研究進展報告基于最新發表的研究結果將IL-1β列為癲癇潛在的生物標記物。我們實驗室此前的工作顯示每日服用左乙拉西坦，一種廣譜的AED，可減少實驗性TBI動物局部腦組織IL-1β的表達，這可能是其在TBI中抗癲癇作用潛在的原因。該觀察結果連同其它顯示IL-1β和非外傷性癲癇關系的資料，為研究IL-1β和PTE的發生提供了理論基礎。
IL-1β于中樞神經系統和外周產生。在健康個體中，CNS IL-1β水平很低，且有助于諸如記憶形成和睡眠等生理過程。而TBI與IL-1β表達增加相關，這種表達增加可在外傷后持續數月。IL-1β水平升高與早期神經元死亡和興奮性毒性有關，提示了在TBI恢復期IL-1β調控的重要性。基于這些研究結果及已知的IL-1β誘發癲癇的效應，我們假設TBI引起的早期IL-1β水平變化可能與PTE產生相關。鑒于TBI后血腦屏障(BBB)破壞和外周炎癥反應，以及CSF IL-1β水平很可能由CNS和外周產生的總產物，我們也發現CSF/血清IL-1β比值可作為反映血清IL-1β對CSF IL-1β水平貢獻的指標盡管我們的數據顯示PTE組CSF IL-1β水平升高，但是相比與對照組，PTE組和無PTE組的CSF IL-1β平均值均無明顯差異。血清IL-1β水平也與對照組無明顯差異。但是，PTE組血清IL-1β水平顯著低于無PTE組，表明兩組間血清IL-1β的相對差值轉移到了CNS中。有意思的是，外傷后第1周高CSF/血清IL-1β比值的患者其PTE風險顯著升高，表明盡管TBI后CSF IL-1β絕對值升高，但外周的IL-1β的相對貢獻是最終PTE發生最為敏感的測量指標。這個相關性很有趣，并且對于早期篩查有一定意義，但仍需要開展進一步工作來確定血清IL-1β和比值的關系是否/如何反映有關持續的外周炎癥狀態，第1年內中度至重度損傷臨床人群的特點，可能在長期過程中導致癲癇發作和PTE發生。多變量Cox模型顯示只有IL-1β比值與PTE風險顯著相關，表明CSF/血清比值似乎增加了外周炎癥對CNS病理的貢獻的特性。
有意思的是，在一報道中提到II型IL-1β轉運蛋白可通過涉及腦微血管內皮細胞的體外途徑穿過BBB將IL-1β由血液轉運至腦。盡管臨床TBI研究表明，某些細胞因子順腦到血液的轉運梯度進行轉運，但類似的研究并不能確定這樣的IL-1β轉運梯度。我們的結果顯示相對于CSF，在對IL-1β血液到腦梯度有提示意義的IL-1β水平的隊列中存在高血清IL-1β濃度(圖 1)。此外，PTE組中的高CSF/血清比值也支持IL-1β血液到腦轉運的假設(圖 2)。這一發現，與rs1143634和血清水平及比值的關系，也表明遺傳變異影響IL-1β轉運至CNS能力，可作為進一步探索IL-1β病理學如何影響PTE風險的合理的生物學機制。
但目前仍需要進一步研究來確證為何TBI后高IL-1β比例可以預測外傷后幾個月到幾年時間里PTE的發生。增強的急性炎癥反應可能可以預測可導致癲癇和PTE發生的長期慢性(CNS和外周)炎癥及BBB功能障礙。要強調的是，血清細胞因子水平在中度至重度TBI后其水平升高至少維持1年，可能繼而導致BBB功能障礙和持續的CNS炎癥。在某些細胞中，包括激活的小膠質細胞，IL-1β可誘導IL-1βmRNA產生，導致一個積極的反饋系統使CNS炎癥持續存在。有意思的是，臨床影像學研究表明在TBI后小膠質細胞的激活可持續數年，同時伴隨進行性白質變性。此外，研究表明TBI后多達1年的時間里都存在進行性細胞死亡，提示與細胞凋亡相關的細胞外ATP的升高可能慢性激活了產生IL-1β所需的炎癥小體。
PTE組中高急性期CSF/血清IL-1β比值可能預示著多種與慢性炎癥有關的長期生理變化，這些變化可促進癲癇發作。腦室內IL-1β可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經系統，減少外周細胞的免疫反應，抑制巨噬細胞分泌IL-1β。因此，正如本研究中報道，PTE患者中該神經免疫調節系統急性過度活化，導致血清IL-1β水平降低。研究顯示IL-1β升高和/或IL-1β受體拮抗劑減少(IL-1α)明顯的改變了化學誘發癲癇發作的頻率、持續時間和發作閾值。有關點燃模型研究中癲癇發作過程延遲抑制了神經生長因子(NGF)。值得注意的是，IL-1β同時上調體外和體內的NGF，在TBI大鼠模型中應用IL-1α抑制了NGF-介導的可塑性。但仍需要進一步工作來辨別CSF/血清IL-1β比值是否能反應這些生理狀態的改變。
IL-1β基因變異分析顯示了rs1143634基因型，PTE，血清IL-1β水平和CSF/血清IL-1β比值的關系。rs1143634上為CT基因型的患者PTE風險明顯升高，且首次癲癇發作的時間明顯縮短(平均縮短5個月)，表明局部的變異促使了癲癇發生。盡管該SNP的最小等位基因頻率(MAF)為0.25，但僅有13例受試者為TT純合子。有意思的是，這幾位受試者均未患PTE。雖然TT組樣本量較小，可能受樣本偏差影響，但數據提示了TT純合子對PTE起相對保護作用，而CT雜合子則為獨特的風險組。而且，將來的驗證研究不太可能產生劑量反應與PTE風險的關系。
雜合子關聯分析出現編碼膜受體的基因變異，可導致多重作用影響有趣的表現型(如受體蛋白異二聚體對比二聚體膜運輸的差別效應)。我們之前的研究報道與PTE有關的rs10920573雜合子位于ADORA1基因位點。該基因雖然不是膜受體，但可推測不同的IL-1β亞型混合的細胞外環境，理論上對于靶受體結合、激活和導致PTE風險增加的炎癥途徑的下游信號可有不同的作用。考慮到rs1143634上的雜合子也和血清IL-1β減少有關，IL-1β可影響BBB滲透性，因此與IL-1β生理機制相關的位于rs1143634上的雜合子可不同程度促進血清IL-1β轉運至CSF。IL-1β調節其表達和BBB載體轉運蛋白如ATP結合盒式(ABC)轉運蛋白的流出功能，而在TBI中基因變異可能對于IL-1β水平和其他分子如皮質醇有差別效應。值得注意的是，ABC轉運蛋白也促進了激活的巨噬細胞釋放IL-1β，該作用可能與慢性激活的小膠質細胞12釋放IL-1β導致PTE發生特別相關。最后，TBI后主要的普遍的表觀遺傳修飾被人們所知，鑒于之前有關IL-1β啟動子如何產生表觀遺傳變異的報告，這可能是進一步研究rs1143634與PTE風險增加的相關機制的另一領域。
rs1143634的SNP位于IL-1β基因的外顯子5的編碼區域，但其功能仍然是有爭議的。研究表明等位基因T與IL-1β產生增加有關，而其他人發現IL-1β的釋放并無差異。rs1143634標記了2號染色體上IL-1β基因的將近1kb的區域，其中該區域也包括錯義的SNPs rs141525736，rs139843362和rs114640380(HapMap phase 3；hapmap.org)。但是這些SNPs并不是高度變異的，且尚無報道其相關功能文獻。此外，目前尚不清楚LD衰減位于rs1143634標記的哪個區域，因此代表rs1143634的DNA區額外的基因分型對更好的了解功能影響的變化包括該區域的雜合性可能有一定幫助。
ISS，IHI和SDH均與PTE有關。若患者ISS評分較低，或患有IHI、SDH更有可能患PTE。由于ISS是一種總體的解剖損傷嚴重程度評分，因此IHI患者同時ISS評分較低也不足為奇。但根據多變量分析，ISS或IHI并不是主要的PTE預測因素。我們的結果也支持先前顯示SDH能增加PTE風險的研究。
盡管有了IL-1β與PTE之間聯系的一些有前景的發現，也必須考慮到一些局限性。病歷資料摘要很難準確評估癲癇復發和PTE的嚴重性。因此，我們研究中沒有追蹤癲癇復發。此外，插管和鎮靜的受試者可能錯過其外傷1周以后的亞臨床發作或無抽搐發作。且本次研究的樣本只包含中度至重度損傷的白種人，從而限制了不同種族背景人群的普遍性。此外，總體的樣本大小適合遺傳相關的研究，但生物標志物和基因分析的人群是目前所能獲得的最大的中度至重度TBI人群。雖然如此，就目前所知，這是第一個研究報道提示血清IL-1β對CSF IL-1β水平有貢獻，以及PTE與IL-1β基因變異有關。但仍需要進一步在多個獨立的群體中來重復這些發現以更好的理解與這些關系相關的機制。這些研究結果如果被證實，可能激起進一步的研究來檢驗靶向IL-1β預防和治療PTE；也可支持未來工作配合EEG篩查和臨床護理途徑評估遺傳篩查的實用性，通過篩查進行風險分層的方式來治療和預防PTE。另外，探索基因變異和TBI引起的炎癥反應有關的其它生物標志物水平與PTE的發生也是十分必要的。
