引用本文： 喬珊, 韓濤, 李文娜, 王勝軍, 趙秀鶴, 蘇磊, 徐廣潤, 楊雪, 遲兆富, 劉學伍. 選擇性組蛋白脫乙酰酶抑制劑MS-275對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠的神經保護作用及機制研究. 癲癇雜志, 2015, 1(1): 48-53. doi: 10.7507/2096-0247.20150008 復制
癲癇可以通過多種途徑導致神經損傷，患者反復發作可出現認知及精神障礙，給家庭、社會帶來沉重負擔[1]。雖然在過去20年中，可用的抗癲癇藥物的數量大幅增加，但是仍有大約1/3的患者具有耐藥性，而且目前許多抗癲癇藥物(Atiepileptic drugs，AEDs)有一定的不良反應，如皮疹、認知功能障礙、重復發作、精神問題等。藥物的不良反應不僅會使早期癲癇治療的停藥率高達25%，而且會影響患者的依從性[2]。所以，研究癲癇的神經損傷機制，尋求高效的治療藥物，有非常重要的現實意義。
以往研究發現，多種疾病的發生、發展與基因轉錄的異常密切相關，轉錄、轉錄后修飾是治療疾病的重要手段，而組蛋白乙酰化在基因轉錄的調控過程中具有重要作用。組蛋白乙酰化狀態的轉化通過兩種酶催化來實現：組蛋白乙酰化酶(Histone acetylases,HATs)、組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)。HATs和HDACs 是一組相互作用的調節染色體轉錄活性的關鍵酶,在基因表達的調控中起著非常重要的作用。HATs可以使組蛋白乙酰化，促使染色體解螺旋,加強各類轉錄因子與DNA 特異性位點的結合,從而增強基因的轉錄活性； HDACs使組蛋白脫乙酰化,使染色體結構緊密，抑制基因的表達。組蛋白的乙酰化與脫乙酰化之間的平衡一旦失衡，會導致細胞的分化、死亡及炎癥反應[3, 4]。腦部疾病與蛋白的乙酰化失衡與轉錄障礙有著廣泛的關系。近年不少研究證實了HDAC抑制劑在中樞神經系統疾病如創傷性腦損傷[5]、亨廷頓氏病[6]等的積極作用。MS-275是一種選擇性HDACs I類抑制劑，對HDAC1和HDAC3有高效的抑制作用，對腦組織有特異的選擇性，而且血腦屏障通透性比較好。該化合物被證實在多種惡性腫瘤、周圍炎癥性病變的治療中有著積極作用[7]。但是，關于其對于癲癇所致腦損傷的作用的尚沒有研究。因此，本研究擬通過觀察各組大鼠行為學改變、海馬CA1及CA3區病理學改變及神經元存活情況、組蛋白乙酰化水平及認知功能改變情況，來研究MS-275在癲癇所致腦損傷中的作用。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物與分組
健康雄性Sprague-Dawley大鼠75只，體質量200~280 g，由山東大學實驗動物中心提供。在恒溫(22℃)恒濕(50%相對濕度)的環境中飼養。將實驗大鼠隨機分為5組(n=15)：① 對照組,致癇后30 min腹腔注射與MS-275等體積的二甲基亞砜；② 匹魯卡品組,致癇后7 d連續腹腔注與MS-275等量的二甲基亞砜,1次/d；③ 治療Ⅰ組，致癇后7d連續腹腔注射MS-275，20 mg/kg,1次/d；④ 治療Ⅱ組，致癇后7 d連續腹腔注射MS-275,40 mg/kg,1次/d；⑤ MS-275預處理組，在匹魯卡品注射前30 min腹腔注射MS-275，25 mg/kg。通過氯化鋰-匹魯卡品誘發癲癇持續狀態(status epilepticus,SE)。MS-275溶解于二甲基亞砜中。
1.2 主要試劑
氯化鋰、匹魯卡品、東莨菪堿、地西泮、MS-275均購自美國Sigma公司；Histostain-Plus及DAB試劑盒均購自北京中山金橋生物技術公司；抗組蛋白乙酰化抗體H3(K9，ab32129)購自英國Abcam公司。
2 實驗方法
2.1 制備氯化鋰-匹魯卡品大鼠癲癇模型
所有大鼠皆進行氯化鋰(127 mg/kg) 腹腔注射處理，20 h后除對照外，余大鼠均給予匹魯卡品30 mg/kg 腹腔注射，前30 min，給予氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg皮下注射處理。30 min后，若無0級以上發作,可每隔15 min注射一次，追加劑量10 mg /kg。SE 后1 h,地西泮10 mg /kg腹腔注射，終止SE。對照組用氯化鋰腹腔注射20 h后，用等體積的生理鹽水代替匹魯卡品。實驗動物癇性發作分級標準依照Racine(1972年)分級標準[8],達到Ⅳ級以上發作歸為實驗組。
2.2 制備組織石蠟切片
致癇后72 h，每組5只大鼠，灌注取大鼠大腦的視交叉、視乳頭間約2~5 mm3的組織塊，系列乙醇脫水，石蠟包埋。連續進行冠狀切片，固定厚度(10 μm： 尼氏染色，4.5 μm：免疫組織化學染色)。切片每隔10張取1張，每只大鼠共取5張。
2.3 尼氏染色
觀察大鼠海馬CA1、CA3區錐體細胞存活情況1%的甲苯胺藍行尼氏染色。顯微鏡下(×400)觀察大鼠海馬神經元的存活情況。Image-Pro Plus 6.0用于分析圖片，手繪工具限定死亡錐體細胞的面積(200μm×500μm，即0.1 mm2)。盲法計數雙側大腦半球海馬CA1、CA3區1 mm2范圍內存活的錐體細胞數，每個標本取3張相近部位的腦片,每張切片各部位隨機取5個視野，取平均值。
2.4 免疫組織化學檢測
測定大鼠海馬CA1、CA3區組蛋白乙酰化水平取前囟后3.80 mm和前囟后4.30 mm的切片。常規系列脫水，抗原修復。用H2O2對內源性過氧化物酶進行阻斷。置于3%山羊血清中，37℃的恒溫箱孵育20min，后用0.1 mol/L PBS洗三次，10 min/次。加一抗(抗組蛋白乙酰化H3(K9)抗體(1∶80，ab32129，Abcam公司，英國)，4℃恒溫箱孵育48h。用0.1 mol/L PBS漂洗四次，10 min/次后，加入二抗(山羊抗兔IgG，1∶500)，室溫下繼續孵育2 h。DAB底物試劑盒顯色，切片轉移到 0.1 mol/L PBS中，停止顯色反應。系列乙醇脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下(×400)觀察大鼠海馬CA1、CA3區的組蛋白乙酰化水平。對照組除無一抗孵育外，其余均相同。顯微鏡(×400)下手工計數大鼠海馬CA1及CA3區的陽性細胞，取平均值。陽性細胞計數方法同上。
2.5 Morris水迷宮評估大鼠的認知及行為能力
每組6只大鼠用于此項實驗。Morris水迷宮：通過強迫實驗動物學習、尋找水中平臺，評估實驗動物在學習記憶功能。該實驗實施于一個圓柱形的水池(直徑：180 cm、高：50 cm)中。以池底中心為中心，將迷宮分為四個象限。實驗開始，在池壁的不同象限，選四個入水點(相鄰兩個入水點間距離需≥25 cm)。SE后第7天存活的大鼠，進行該實驗，連續進行5 d。實驗開始前一日，讓各實驗大鼠，在水迷宮中自由游泳5 min，使其適應環境。從第1天起，每天測試3次，觀察并記錄大鼠尋找、成功爬上平臺所需時間(即大鼠的逃避潛伏期)。120 s內不能找到平臺，潛伏期記為120 s，3次測試時間間隔為5 min。
3 統計學方法
應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(
結果
1 MS-275預處理對大鼠行為學的影響
在匹羅卡品組,有14只大鼠誘導出SE發作，其中有4只大鼠在發作的72 h內死亡。在MS-275預處理組，11只動物誘發出SE 發作，該組大鼠在72h內無死亡。在治療Ⅰ組和治療Ⅱ組，分別有14和15只大鼠出現SE發作，分別有2只和1只在SE后72 h死亡。與匹魯卡品組相比，MS-275預處理組大鼠的SE發作潛伏期出現延長，而且，MS-275預處理組致癇大鼠的死亡率降低(P<0.05)。對照組無癲癇發作。見表 1。
表1
MS-275預處理對匹魯卡品致癲大鼠行為學影響(2 Nissl染色示MS-275處理對致癇后海馬區神經元的變性壞死有改善作用
對照組可見大鼠海馬CA1、CA3區見致密的錐體、顆粒細胞，細胞結構的清晰完整，胞漿內可見豐富的尼氏小體。神經元的胞核為圓形或橢圓形，核仁清晰，染色質分布均勻。匹魯卡品組：大鼠海馬CAl和CA3區的神經元排列紊亂，細胞破裂、變形，輪廓模糊；變性、壞死的神經元多為三角形，神經元的胞質深染、濃縮，胞漿內的尼氏小體減少；神經元的胞核固縮，見圖 1。與匹魯卡品組相比，對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組及MS-275預處理組的錐體細胞存活數目增高(P<0.05)，但治療Ⅰ組及治療Ⅱ組之間比較無統計學意義(P>0.05)，見圖 2。
圖1
SE后72 h各組大鼠海馬錐體神經細胞CAl及CA3區Nissl染色(×400，標尺=100 μm)
圖2
各組大鼠海馬CA1及CA3區Nissl染色存活的錐體細胞數(個／mm2)
3 免疫組織化學示MS-275處理對致癇大鼠海馬CA1、CA3區的組蛋白乙酰化水平的影響
顯微鏡下觀察到免疫標記物質為藍灰色，主要位于細胞核。與匹魯卡品組相比，治療Ⅰ組、治療Ⅱ組和MS-275預處理組的陽性細胞數高(P<0.05)，見圖 3、4。
圖3
SE后72 h各組大鼠海馬錐體神經細胞CAl及CA3區免疫組織化學 (×400，標尺=100 μm)
圖4
各組大鼠海馬的免疫組織化學陽性細胞數目(個／mm2)
4 Morris 水迷宮MS-275處理對大鼠認知功能的影響
實驗發現，各組大鼠的逃避潛伏期，隨訓練天數越來越短。但各組間逃避潛伏期，總體變化存在差異。與匹魯卡品組相比，對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組、MS-275預處理組的逃避潛伏期均縮短 (P<0.05)。治療Ⅰ組及治療Ⅱ組的逃避潛伏期的比較無統計學意義 (P>0.05)，見圖 5。
圖5
各組造模7 d后大鼠的逃避潛伏期
討論
癲癇反復發作會導致腦部神經元不同程度的損傷，但是其確切的發生、發展機制尚未研究透徹。乙酰化修飾是基因轉錄調控的重要機制，參與了癲癇的發生、發展過程。人類的HDACs共發現有18個亞型，分4類，其中I類HDACs包括HDAC1，2，3和8[9]，HDAC1和HDAC3可在小腦，海馬和杏仁核區出現高表達，且主要在神經元細胞核中表達[10]。癇性發作或癲癇持續狀態激發了神經元基因表達的急劇變化[11]。癲癇發作是對神經系統造成很大的刺激及嚴重的損害。這些刺激及損害會誘發癲癇相關基因通過改變組蛋白乙酰化狀態來參與癲癇發生和發展。
近幾年，HDACs抑制劑的神經保護作用被廣泛重視。目前研究主要涉及的HDACs抑制劑對神經系統病變的作用機制主要有：對神經細胞的保護作用、調節疾病相關蛋白作用等。Moskowitz等[12]證實HDAC抑制劑曲古霉素可對受到輕度缺血性腦損傷的缺血模型野生型小鼠起到一定的保護作用，使其腦缺血程度降低。而Dash等[13] 在一項創傷性腦損傷的研究中發現，HDAC抑制劑丁酸鈉對腦損傷后小鼠的學習和記憶能力有改善作用。這些發現都證實了HDACs抑制劑對神經系統疾病的干預治療的潛在價值。MS-275是一種選擇性HDAC1和HDAC3抑制劑，有良好的腦組織特異選擇性，并能通過血腦屏障。在本研究中，通過行為學觀察顯示，MS-275預處理可以明顯延緩匹羅卡品誘導的癲癇持續狀態的潛伏期，并且降低SE導致的死亡率。我們認為MS-275有一定的抗驚厥作用。癲癇發作會引起腦部神經元不同程度的損傷。在本實驗的病理學觀察中，我們可以看到，對照組大鼠海馬的CA1和CA3區見大量致密的錐體細胞和顆粒細胞，細胞結構清晰完整，胞漿內可見到豐富的尼氏小體。而匹魯卡品組大鼠海馬CAl、CA3區的神經元排列紊亂，疏松細胞腫脹；變性、壞死的神經元呈現為三角形，胞質濃縮、深染，胞漿內的尼氏小體減少。且治療Ⅰ組及治療Ⅱ組的錐體細胞存活數明顯高于匹魯卡品組(P<0.05)，這表明MS-275可減輕致癇大鼠海馬區神經元變性程度，并能減輕致癇大鼠海馬神經元的壞死程度，對癲癇導致的神經元損傷有一定的保護作用。以往研究證實，癲癇發作會導致大鼠海馬區的組蛋白乙酰化水平下降。在本實驗中，我們通過免疫組織化學實驗發現，匹魯卡品組的陽性細胞數明顯低于治療Ⅰ組及治療Ⅱ組和MS-275預處理組，即其組蛋白乙酰化水平低于這三組，表明MS-275可以提高海馬CA1及CA3區的組蛋白乙酰化水平。這可能在一定程度上說明MS-275對癲癇所致腦損傷有保護作用的機制進行了解釋。由于海馬與記憶能力，尤其是近記憶能力密切相關，所以，反復癲癇發作、癲癇持續狀態也會引起不同程度的認知能力下降。在本實驗中，通過Morris水迷宮行為測定表明，與匹魯卡品組相比，對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組、MS-275預處理組的逃避潛伏期均明顯縮短 (P<0.05)，即MS-275處理可縮短大鼠尋找平臺的潛伏期； MS-275可以對癲癇發作導致的認知能力下降起到一定的改善作用。上述研究進一步提示了MS-275對癲癇發作所致腦損傷的保護作用。
以往研究證實炎癥在癲癇的發生、發展的病理生理機制中發揮關鍵性作用，促炎分子的高表達，導致反應性星形細胞增生以及小膠質細胞激活，可加重癲癇發作[14]。HDACs抑制劑對多種炎癥因子有抑制作用，且有研究證實HDACs抑制劑在多種外周炎癥性疾病及中樞神經系統損傷模型中所表現出的抗炎作用，可顯著抑制小膠質細胞炎癥反應及炎癥因子的產生，從而抑制神經元變性而改善神經功能[15, 16]。我們認為，HDACs抑制劑MS-275對致癇后大鼠的神經保護作用可能與其抗炎作用相關。但是，這只能在一定程度上對這種保護機制進行解釋，仍需要進一步的研究。
綜上所述，HDACs抑制劑MS-275對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠的腦損傷有改善作用，其作用機制可能與其抗炎作用相關,仍需要深入研究。
癲癇可以通過多種途徑導致神經損傷，患者反復發作可出現認知及精神障礙，給家庭、社會帶來沉重負擔[1]。雖然在過去20年中，可用的抗癲癇藥物的數量大幅增加，但是仍有大約1/3的患者具有耐藥性，而且目前許多抗癲癇藥物(Atiepileptic drugs，AEDs)有一定的不良反應，如皮疹、認知功能障礙、重復發作、精神問題等。藥物的不良反應不僅會使早期癲癇治療的停藥率高達25%，而且會影響患者的依從性[2]。所以，研究癲癇的神經損傷機制，尋求高效的治療藥物，有非常重要的現實意義。
以往研究發現，多種疾病的發生、發展與基因轉錄的異常密切相關，轉錄、轉錄后修飾是治療疾病的重要手段，而組蛋白乙酰化在基因轉錄的調控過程中具有重要作用。組蛋白乙酰化狀態的轉化通過兩種酶催化來實現：組蛋白乙酰化酶(Histone acetylases,HATs)、組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases,HDACs)。HATs和HDACs 是一組相互作用的調節染色體轉錄活性的關鍵酶,在基因表達的調控中起著非常重要的作用。HATs可以使組蛋白乙酰化，促使染色體解螺旋,加強各類轉錄因子與DNA 特異性位點的結合,從而增強基因的轉錄活性； HDACs使組蛋白脫乙酰化,使染色體結構緊密，抑制基因的表達。組蛋白的乙酰化與脫乙酰化之間的平衡一旦失衡，會導致細胞的分化、死亡及炎癥反應[3, 4]。腦部疾病與蛋白的乙酰化失衡與轉錄障礙有著廣泛的關系。近年不少研究證實了HDAC抑制劑在中樞神經系統疾病如創傷性腦損傷[5]、亨廷頓氏病[6]等的積極作用。MS-275是一種選擇性HDACs I類抑制劑，對HDAC1和HDAC3有高效的抑制作用，對腦組織有特異的選擇性，而且血腦屏障通透性比較好。該化合物被證實在多種惡性腫瘤、周圍炎癥性病變的治療中有著積極作用[7]。但是，關于其對于癲癇所致腦損傷的作用的尚沒有研究。因此，本研究擬通過觀察各組大鼠行為學改變、海馬CA1及CA3區病理學改變及神經元存活情況、組蛋白乙酰化水平及認知功能改變情況，來研究MS-275在癲癇所致腦損傷中的作用。
材料與方法
1 材料
1.1 實驗動物與分組
健康雄性Sprague-Dawley大鼠75只，體質量200~280 g，由山東大學實驗動物中心提供。在恒溫(22℃)恒濕(50%相對濕度)的環境中飼養。將實驗大鼠隨機分為5組(n=15)：① 對照組,致癇后30 min腹腔注射與MS-275等體積的二甲基亞砜；② 匹魯卡品組,致癇后7 d連續腹腔注與MS-275等量的二甲基亞砜,1次/d；③ 治療Ⅰ組，致癇后7d連續腹腔注射MS-275，20 mg/kg,1次/d；④ 治療Ⅱ組，致癇后7 d連續腹腔注射MS-275,40 mg/kg,1次/d；⑤ MS-275預處理組，在匹魯卡品注射前30 min腹腔注射MS-275，25 mg/kg。通過氯化鋰-匹魯卡品誘發癲癇持續狀態(status epilepticus,SE)。MS-275溶解于二甲基亞砜中。
1.2 主要試劑
氯化鋰、匹魯卡品、東莨菪堿、地西泮、MS-275均購自美國Sigma公司；Histostain-Plus及DAB試劑盒均購自北京中山金橋生物技術公司；抗組蛋白乙酰化抗體H3(K9，ab32129)購自英國Abcam公司。
2 實驗方法
2.1 制備氯化鋰-匹魯卡品大鼠癲癇模型
所有大鼠皆進行氯化鋰(127 mg/kg) 腹腔注射處理，20 h后除對照外，余大鼠均給予匹魯卡品30 mg/kg 腹腔注射，前30 min，給予氫溴酸東莨菪堿1 mg/kg皮下注射處理。30 min后，若無0級以上發作,可每隔15 min注射一次，追加劑量10 mg /kg。SE 后1 h,地西泮10 mg /kg腹腔注射，終止SE。對照組用氯化鋰腹腔注射20 h后，用等體積的生理鹽水代替匹魯卡品。實驗動物癇性發作分級標準依照Racine(1972年)分級標準[8],達到Ⅳ級以上發作歸為實驗組。
2.2 制備組織石蠟切片
致癇后72 h，每組5只大鼠，灌注取大鼠大腦的視交叉、視乳頭間約2~5 mm3的組織塊，系列乙醇脫水，石蠟包埋。連續進行冠狀切片，固定厚度(10 μm： 尼氏染色，4.5 μm：免疫組織化學染色)。切片每隔10張取1張，每只大鼠共取5張。
2.3 尼氏染色
觀察大鼠海馬CA1、CA3區錐體細胞存活情況1%的甲苯胺藍行尼氏染色。顯微鏡下(×400)觀察大鼠海馬神經元的存活情況。Image-Pro Plus 6.0用于分析圖片，手繪工具限定死亡錐體細胞的面積(200μm×500μm，即0.1 mm2)。盲法計數雙側大腦半球海馬CA1、CA3區1 mm2范圍內存活的錐體細胞數，每個標本取3張相近部位的腦片,每張切片各部位隨機取5個視野，取平均值。
2.4 免疫組織化學檢測
測定大鼠海馬CA1、CA3區組蛋白乙酰化水平取前囟后3.80 mm和前囟后4.30 mm的切片。常規系列脫水，抗原修復。用H2O2對內源性過氧化物酶進行阻斷。置于3%山羊血清中，37℃的恒溫箱孵育20min，后用0.1 mol/L PBS洗三次，10 min/次。加一抗(抗組蛋白乙酰化H3(K9)抗體(1∶80，ab32129，Abcam公司，英國)，4℃恒溫箱孵育48h。用0.1 mol/L PBS漂洗四次，10 min/次后，加入二抗(山羊抗兔IgG，1∶500)，室溫下繼續孵育2 h。DAB底物試劑盒顯色，切片轉移到 0.1 mol/L PBS中，停止顯色反應。系列乙醇脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下(×400)觀察大鼠海馬CA1、CA3區的組蛋白乙酰化水平。對照組除無一抗孵育外，其余均相同。顯微鏡(×400)下手工計數大鼠海馬CA1及CA3區的陽性細胞，取平均值。陽性細胞計數方法同上。
2.5 Morris水迷宮評估大鼠的認知及行為能力
每組6只大鼠用于此項實驗。Morris水迷宮：通過強迫實驗動物學習、尋找水中平臺，評估實驗動物在學習記憶功能。該實驗實施于一個圓柱形的水池(直徑：180 cm、高：50 cm)中。以池底中心為中心，將迷宮分為四個象限。實驗開始，在池壁的不同象限，選四個入水點(相鄰兩個入水點間距離需≥25 cm)。SE后第7天存活的大鼠，進行該實驗，連續進行5 d。實驗開始前一日，讓各實驗大鼠，在水迷宮中自由游泳5 min，使其適應環境。從第1天起，每天測試3次，觀察并記錄大鼠尋找、成功爬上平臺所需時間(即大鼠的逃避潛伏期)。120 s內不能找到平臺，潛伏期記為120 s，3次測試時間間隔為5 min。
3 統計學方法
應用SPSS 19.0軟件進行統計分析，數據以均數±標準差(
結果
1 MS-275預處理對大鼠行為學的影響
在匹羅卡品組,有14只大鼠誘導出SE發作，其中有4只大鼠在發作的72 h內死亡。在MS-275預處理組，11只動物誘發出SE 發作，該組大鼠在72h內無死亡。在治療Ⅰ組和治療Ⅱ組，分別有14和15只大鼠出現SE發作，分別有2只和1只在SE后72 h死亡。與匹魯卡品組相比，MS-275預處理組大鼠的SE發作潛伏期出現延長，而且，MS-275預處理組致癇大鼠的死亡率降低(P<0.05)。對照組無癲癇發作。見表 1。
表1
MS-275預處理對匹魯卡品致癲大鼠行為學影響(2 Nissl染色示MS-275處理對致癇后海馬區神經元的變性壞死有改善作用
對照組可見大鼠海馬CA1、CA3區見致密的錐體、顆粒細胞，細胞結構的清晰完整，胞漿內可見豐富的尼氏小體。神經元的胞核為圓形或橢圓形，核仁清晰，染色質分布均勻。匹魯卡品組：大鼠海馬CAl和CA3區的神經元排列紊亂，細胞破裂、變形，輪廓模糊；變性、壞死的神經元多為三角形，神經元的胞質深染、濃縮，胞漿內的尼氏小體減少；神經元的胞核固縮，見圖 1。與匹魯卡品組相比，對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組及MS-275預處理組的錐體細胞存活數目增高(P<0.05)，但治療Ⅰ組及治療Ⅱ組之間比較無統計學意義(P>0.05)，見圖 2。
圖1
SE后72 h各組大鼠海馬錐體神經細胞CAl及CA3區Nissl染色(×400，標尺=100 μm)
圖2
各組大鼠海馬CA1及CA3區Nissl染色存活的錐體細胞數(個／mm2)
3 免疫組織化學示MS-275處理對致癇大鼠海馬CA1、CA3區的組蛋白乙酰化水平的影響
顯微鏡下觀察到免疫標記物質為藍灰色，主要位于細胞核。與匹魯卡品組相比，治療Ⅰ組、治療Ⅱ組和MS-275預處理組的陽性細胞數高(P<0.05)，見圖 3、4。
圖3
SE后72 h各組大鼠海馬錐體神經細胞CAl及CA3區免疫組織化學 (×400，標尺=100 μm)
圖4
各組大鼠海馬的免疫組織化學陽性細胞數目(個／mm2)
4 Morris 水迷宮MS-275處理對大鼠認知功能的影響
實驗發現，各組大鼠的逃避潛伏期，隨訓練天數越來越短。但各組間逃避潛伏期，總體變化存在差異。與匹魯卡品組相比，對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組、MS-275預處理組的逃避潛伏期均縮短 (P<0.05)。治療Ⅰ組及治療Ⅱ組的逃避潛伏期的比較無統計學意義 (P>0.05)，見圖 5。
圖5
各組造模7 d后大鼠的逃避潛伏期
討論
癲癇反復發作會導致腦部神經元不同程度的損傷，但是其確切的發生、發展機制尚未研究透徹。乙酰化修飾是基因轉錄調控的重要機制，參與了癲癇的發生、發展過程。人類的HDACs共發現有18個亞型，分4類，其中I類HDACs包括HDAC1，2，3和8[9]，HDAC1和HDAC3可在小腦，海馬和杏仁核區出現高表達，且主要在神經元細胞核中表達[10]。癇性發作或癲癇持續狀態激發了神經元基因表達的急劇變化[11]。癲癇發作是對神經系統造成很大的刺激及嚴重的損害。這些刺激及損害會誘發癲癇相關基因通過改變組蛋白乙酰化狀態來參與癲癇發生和發展。
近幾年，HDACs抑制劑的神經保護作用被廣泛重視。目前研究主要涉及的HDACs抑制劑對神經系統病變的作用機制主要有：對神經細胞的保護作用、調節疾病相關蛋白作用等。Moskowitz等[12]證實HDAC抑制劑曲古霉素可對受到輕度缺血性腦損傷的缺血模型野生型小鼠起到一定的保護作用，使其腦缺血程度降低。而Dash等[13] 在一項創傷性腦損傷的研究中發現，HDAC抑制劑丁酸鈉對腦損傷后小鼠的學習和記憶能力有改善作用。這些發現都證實了HDACs抑制劑對神經系統疾病的干預治療的潛在價值。MS-275是一種選擇性HDAC1和HDAC3抑制劑，有良好的腦組織特異選擇性，并能通過血腦屏障。在本研究中，通過行為學觀察顯示，MS-275預處理可以明顯延緩匹羅卡品誘導的癲癇持續狀態的潛伏期，并且降低SE導致的死亡率。我們認為MS-275有一定的抗驚厥作用。癲癇發作會引起腦部神經元不同程度的損傷。在本實驗的病理學觀察中，我們可以看到，對照組大鼠海馬的CA1和CA3區見大量致密的錐體細胞和顆粒細胞，細胞結構清晰完整，胞漿內可見到豐富的尼氏小體。而匹魯卡品組大鼠海馬CAl、CA3區的神經元排列紊亂，疏松細胞腫脹；變性、壞死的神經元呈現為三角形，胞質濃縮、深染，胞漿內的尼氏小體減少。且治療Ⅰ組及治療Ⅱ組的錐體細胞存活數明顯高于匹魯卡品組(P<0.05)，這表明MS-275可減輕致癇大鼠海馬區神經元變性程度，并能減輕致癇大鼠海馬神經元的壞死程度，對癲癇導致的神經元損傷有一定的保護作用。以往研究證實，癲癇發作會導致大鼠海馬區的組蛋白乙酰化水平下降。在本實驗中，我們通過免疫組織化學實驗發現，匹魯卡品組的陽性細胞數明顯低于治療Ⅰ組及治療Ⅱ組和MS-275預處理組，即其組蛋白乙酰化水平低于這三組，表明MS-275可以提高海馬CA1及CA3區的組蛋白乙酰化水平。這可能在一定程度上說明MS-275對癲癇所致腦損傷有保護作用的機制進行了解釋。由于海馬與記憶能力，尤其是近記憶能力密切相關，所以，反復癲癇發作、癲癇持續狀態也會引起不同程度的認知能力下降。在本實驗中，通過Morris水迷宮行為測定表明，與匹魯卡品組相比，對照組、治療Ⅰ組、治療Ⅱ組、MS-275預處理組的逃避潛伏期均明顯縮短 (P<0.05)，即MS-275處理可縮短大鼠尋找平臺的潛伏期； MS-275可以對癲癇發作導致的認知能力下降起到一定的改善作用。上述研究進一步提示了MS-275對癲癇發作所致腦損傷的保護作用。
以往研究證實炎癥在癲癇的發生、發展的病理生理機制中發揮關鍵性作用，促炎分子的高表達，導致反應性星形細胞增生以及小膠質細胞激活，可加重癲癇發作[14]。HDACs抑制劑對多種炎癥因子有抑制作用，且有研究證實HDACs抑制劑在多種外周炎癥性疾病及中樞神經系統損傷模型中所表現出的抗炎作用，可顯著抑制小膠質細胞炎癥反應及炎癥因子的產生，從而抑制神經元變性而改善神經功能[15, 16]。我們認為，HDACs抑制劑MS-275對致癇后大鼠的神經保護作用可能與其抗炎作用相關。但是，這只能在一定程度上對這種保護機制進行解釋，仍需要進一步的研究。
綜上所述，HDACs抑制劑MS-275對氯化鋰-匹魯卡品致癇大鼠的腦損傷有改善作用，其作用機制可能與其抗炎作用相關,仍需要深入研究。
