引用本文： 賈榮杰, 靳士豪. 孕期補充葉酸與其子代孤獨癥譜系障礙發病相關性的 Meta 分析. 中國循證醫學雜志, 2021, 21(10): 1141-1147. doi: 10.7507/1672-2531.202105058 復制
孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種神經發育障礙性疾病，其特征主要是社交互動減少、語言溝通障礙和重復刻板的行為模式等，其中社交障礙是孤獨癥最典型的缺陷[1-3]。根據美國疾病預防控制中心的孤獨癥和發育障礙監測網絡（Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network，ADDMN）報告，2016 年每 54 例美國兒童中就有 1 例被診斷為孤獨癥[4]。目前我國關于 ASD 患病率的研究尚缺乏全國性的調查，據報道我國兒童 ASD 患病率約為 11.8‰[5]，且各地區 ASD 患病率均有增高趨勢[6]。ASD 的發病可能與遺傳因素和環境因素的復雜相互作用相關[7]。目前，國內外已有較多臨床研究探索葉酸與 ASD 發生之間的關系。葉酸是人體必需的一種 B 族維生素，胎兒可通過臍帶從母體中獲得。葉酸代謝在神經發育過程中起關鍵作用[8]，也參與 DNA 和 RNA 前體的合成及某些甲基化反應，甲基化反應在大腦發育過程中具有維持大腦正常功能的重要作用[9]。已有研究顯示母親孕期補充葉酸會降低子代患 ASD 的風險[10]，但也有研究顯示二者無明顯相關性[11]。因此，本研究系統評價母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病風險的相關性，以期為 ASD 的早期預防提供更可靠的依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
病例-對照研究與隊列研究。
1.1.2 研究對象
病例-對照研究中病例組為確診 ASD 患兒，對照組為與患兒地區、年齡、性別相匹配的健康兒童。隊列研究中暴露組為孕期補充葉酸的孕婦，對照組為與其地區、年齡相匹配的未補充葉酸的孕婦。
1.1.3 暴露因素
母親孕期是否補充葉酸。
1.1.4 結局指標
子代 ASD 發病率。ASD 診斷標準為兒童期孤獨癥評定量表（childhood autism rating scale，CARS）得分≥30 分，或符合美國精神疾病診斷與統計手冊（the diagnostic and statistical manual of mental disorders，DSM）第 4 版（DSM-Ⅳ）或第 5 版（DSM-Ⅴ）標準。社交反應量表（social responsiveness scale，SRS）、普遍性發育問題分量表（the pervasive developmental problems subscale，PDP）、國際疾病分類（international classification of diseases，ICD）、孤獨癥診斷訪談量表修訂版（autism diagnostic interview-revised，ADI-R）、孤獨癥診斷觀察量表（autism diagnostic observation schedule，ADOS）、孤獨癥篩查量表（modified checklist for autism in toddlers，M-CHAT）得分用于癥狀評估，不作為 ASD 診斷標準。
1.1.5 排除標準
① 非中、英文文獻；② 研究質量較差（樣本量過小、偏倚風險較大等）；③ 無法提取所需數據；④ 未說明孕婦何時補充葉酸。
1.2 文獻檢索策略
計算機檢索 PubMed、EMbase、Web of Science、The Cochrane Library、Scopus、CNKI、WanFang Data、VIP 和 CBM 數據庫，搜集關于母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病相關性的病例-對照研究與隊列研究，檢索時限均從建庫至 2020 年 12 月 31 日。此外，追溯納入文獻的參考文獻，以補充獲取相關文獻。檢索采取主題詞和自由詞相結合的方式進行。英文檢索詞包括：FA、folate、folic acid、ASD、autism、autistic、case-control study、cohort study 等；中文檢索詞包括：葉酸、孤獨癥、自閉癥或孤獨癥譜系障礙、病例-對照研究、隊列研究等。以 PubMed 為例，其具體檢索策略見框 1。
圖1
1.3 文獻篩選和資料提取
由 2 名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對。如有分歧，則通過討論協商解決。文獻篩選時首先閱讀文題，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀摘要和全文以確定是否納入。如有需要，通過郵件、電話聯系原始研究作者獲取未確定但對本研究非常重要的信息。資料提取內容包括：① 納入研究的基本信息，包括研究題目、第一作者、發表雜志及時間、國家、研究類型、ASD 診斷標準等；② 研究對象的基線特征，包括各組的樣本數、患者年齡、性別和家庭狀況等；③ 暴露因素相關信息；④ 偏倚風險評價的關鍵要素；⑤ 所關注的結局指標和結果測量數據等。
1.4 納入研究的偏倚風險評價
由 2 名研究者獨立評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對結果。偏倚風險評價采用紐卡斯爾-渥太華量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）[12]。
1.5 統計分析
采用 RevMan 5.3 和 Stata 14.0 軟件進行 Meta 分析。采用比值比（odds ratio，OR）為效應分析統計量，各效應量均提供其 95% 可信區間（confidence interval，CI）。納入研究結果間的異質性采用 χ2 檢驗進行分析（檢驗水準為 α=0.1），同時結合 I2 定量判斷異質性大小。若各研究結果間無統計學異質性，則采用固定效應模型進行 Meta 分析；若各研究結果間存在統計學異質性，則進一步分析異質性來源，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機效應模型進行 Meta 分析。Meta 分析的水準設為 α=0.05[13]。明顯的臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析等方法探索異質性來源，或只行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻篩選流程及結果
初檢共獲得相關文獻 700 篇，經逐層篩選后，最終納入 17 個研究[10,11,14-28]，包括病例 10 812 例，對照 876 241 例。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
*所檢索的數據庫及檢出文獻數具體如下：PubMed（
2.2 納入研究的基本特征與偏倚風險評價結果
納入研究的基本特征見表 1，納入病例-對照研究和隊列研究的偏倚風險評價結果分別見表 2 和表 3。
表1
納入研究的基本特征
表2
納入病例-對照研究的偏倚風險評價結果（分）
表3
納入隊列研究的偏倚風險評價結果（分）
2.3 Meta 分析結果
共納入 17 個研究[10,11,14-28]。隨機效應模型 Meta 分析結果顯示，總體人群中，母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病之間無顯著相關性［OR=0.89，95%CI（0.77，1.03），P=0.13］（表4）。
表4
母親孕期補充葉酸與子代 ASD 發病相關性的亞組分析結果
2.4 亞組分析結果
按人群的不同地區來源進行亞組分析，結果顯示：亞洲人群母親孕期補充葉酸降低了其子代 ASD 發病風險［OR=0.71，95%CI（0.53，0.96），P=0.03］；但歐洲和美洲人群母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病之間無顯著相關性（表 4）。按不同研究類型進行亞組分析，結果顯示不論在病例-對照研究或隊列研究中，所有人群母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病風險之間均無顯著相關性（表 4）。
2.5 敏感性分析
采用逐一剔除單個研究的方法進行敏感性分析，結果顯示合并結果依然比較穩定。
3 討論
ASD 作為目前全球患病人數增長最快的精神殘障類疾病，已成為影響兒童生存與發展的重大公共衛生問題，是 5 歲以下兒童精神殘疾的主要原因[29]，其具體病因和發病機制目前尚不清楚[30]。因此除進行早期行為矯治和教育訓練外，如何通過科學的孕期保健降低子代 ASD 發病風險是當前面臨的重要醫學與社會問題。葉酸參與嘌呤和嘧啶核苷酸的合成，促進神經干細胞增殖及分化[31]，孕期補充葉酸可誘導 DNA 甲基化促進子代大腦神經發育[9,32,33]，而葉酸攝入或代謝異常則會直接影響神經系統的正常發育。動物研究也表明母親缺乏葉酸會導致子代 ASD 表型相關特征的發生[34]，孤獨癥模型 BTBR 小鼠在出生后早期補充葉酸會減少其重復刻板行為并改善社交、記憶和空間學習能力[35]。
有研究表明，孕期缺乏葉酸可能會增加子代患 ASD 的風險[36]，孕期補充葉酸可降低子代患 ASD 的風險[16,17,20]。孕婦在孕前 4 周至孕后 8 周補充葉酸對胎兒中樞神經系統發育的影響最為明顯[16,37]。有充足的證據表明孕期補充葉酸與子代認知功能之間存在正相關關系[38]。目前尚無針對孤獨癥治療的特效藥物[1]，但國內外研究證明，葉酸可能起到輔助治療與改善 ASD 患者病情的作用[39-41]，提示 ASD 兒童神經發育障礙可能與葉酸營養狀況有關。
本文采用 Meta 分析的方法，定量分析了孕期補充葉酸與子代 ASD 發病的相關性，結果表明總體人群中母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病無顯著相關性。考慮到地區人群不同及不同地區對補充葉酸或使用葉酸強化食品的政策和效益的不同[42-44]進行亞組分析，結果顯示，僅在亞洲人群中，母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病風險存在相關性。
不同區域人群中的研究結果不同，其原因可能與飲食習慣、種族差異有關系。葉酸廣泛存在于動物食品、蔬菜和水果中，歐美發達國家典型的膳食結構以動物性食物為主，而納入歐洲地區的研究集中在北歐地區，其飲食習慣注重植物性食物，葉酸基礎補充量相對較好，且部分國家有葉酸強化食品的使用[42-44]，所以推斷該類人群體內本身可能普遍不缺乏葉酸，孕期補充葉酸后預防子代 ASD 發病的效果不明顯。而本研究中亞洲人群主要來自于中國，我國目前沒有大規模普及強化葉酸食物的攝入，且傳統烹飪方法會造成天然食物中葉酸損失高達 50%～90%[45]。有研究表明中國育齡婦女葉酸缺乏現象比較嚴重，患病率為 1%～20% 不等[46]。這可能是亞洲人群在孕期服用葉酸補充劑后預防子代發生 ASD 的效果更為顯著的原因。此外，不同種族的人群中葉酸的代謝能力可能不同，亞甲基四氫葉酸還原酶基因的 C677T 位點多態性會直接影響孕婦吸收及代謝葉酸的效率[47]。不同人群在該基因位點多態性可能存在一定差異，也會對研究結果產生一定的影響。
本研究的局限性：① 納入研究中補充葉酸的時間較寬泛，且葉酸攝入量多為問卷調查所得，存在信息偏倚、回憶偏倚；② 納入研究數量較少，特別是某地區人群的研究數量不足以提供較高把握度的證據；③ 納入研究為觀察性研究，受研究設計所限，選擇、測量等偏倚無法避免；④ 不同納入研究結果間存在異質性，樣本量大小的不同、對照組采用不同的控制條件、不同的診斷標準及多種混雜因素的影響等均可能是產生異質性的原因，但受研究數量所限，無法開展更詳細的亞組分析。
綜上所述，當前證據顯示，在亞洲人群中，母親孕期補充葉酸可能降低其子代 ASD 發病風險。受納入研究數量和質量限制，上述結論尚需開展更多高質量研究予以驗證。
孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）是一種神經發育障礙性疾病，其特征主要是社交互動減少、語言溝通障礙和重復刻板的行為模式等，其中社交障礙是孤獨癥最典型的缺陷[1-3]。根據美國疾病預防控制中心的孤獨癥和發育障礙監測網絡（Autism and Developmental Disabilities Monitoring Network，ADDMN）報告，2016 年每 54 例美國兒童中就有 1 例被診斷為孤獨癥[4]。目前我國關于 ASD 患病率的研究尚缺乏全國性的調查，據報道我國兒童 ASD 患病率約為 11.8‰[5]，且各地區 ASD 患病率均有增高趨勢[6]。ASD 的發病可能與遺傳因素和環境因素的復雜相互作用相關[7]。目前，國內外已有較多臨床研究探索葉酸與 ASD 發生之間的關系。葉酸是人體必需的一種 B 族維生素，胎兒可通過臍帶從母體中獲得。葉酸代謝在神經發育過程中起關鍵作用[8]，也參與 DNA 和 RNA 前體的合成及某些甲基化反應，甲基化反應在大腦發育過程中具有維持大腦正常功能的重要作用[9]。已有研究顯示母親孕期補充葉酸會降低子代患 ASD 的風險[10]，但也有研究顯示二者無明顯相關性[11]。因此，本研究系統評價母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病風險的相關性，以期為 ASD 的早期預防提供更可靠的依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
病例-對照研究與隊列研究。
1.1.2 研究對象
病例-對照研究中病例組為確診 ASD 患兒，對照組為與患兒地區、年齡、性別相匹配的健康兒童。隊列研究中暴露組為孕期補充葉酸的孕婦，對照組為與其地區、年齡相匹配的未補充葉酸的孕婦。
1.1.3 暴露因素
母親孕期是否補充葉酸。
1.1.4 結局指標
子代 ASD 發病率。ASD 診斷標準為兒童期孤獨癥評定量表（childhood autism rating scale，CARS）得分≥30 分，或符合美國精神疾病診斷與統計手冊（the diagnostic and statistical manual of mental disorders，DSM）第 4 版（DSM-Ⅳ）或第 5 版（DSM-Ⅴ）標準。社交反應量表（social responsiveness scale，SRS）、普遍性發育問題分量表（the pervasive developmental problems subscale，PDP）、國際疾病分類（international classification of diseases，ICD）、孤獨癥診斷訪談量表修訂版（autism diagnostic interview-revised，ADI-R）、孤獨癥診斷觀察量表（autism diagnostic observation schedule，ADOS）、孤獨癥篩查量表（modified checklist for autism in toddlers，M-CHAT）得分用于癥狀評估，不作為 ASD 診斷標準。
1.1.5 排除標準
① 非中、英文文獻；② 研究質量較差（樣本量過小、偏倚風險較大等）；③ 無法提取所需數據；④ 未說明孕婦何時補充葉酸。
1.2 文獻檢索策略
計算機檢索 PubMed、EMbase、Web of Science、The Cochrane Library、Scopus、CNKI、WanFang Data、VIP 和 CBM 數據庫，搜集關于母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病相關性的病例-對照研究與隊列研究，檢索時限均從建庫至 2020 年 12 月 31 日。此外，追溯納入文獻的參考文獻，以補充獲取相關文獻。檢索采取主題詞和自由詞相結合的方式進行。英文檢索詞包括：FA、folate、folic acid、ASD、autism、autistic、case-control study、cohort study 等；中文檢索詞包括：葉酸、孤獨癥、自閉癥或孤獨癥譜系障礙、病例-對照研究、隊列研究等。以 PubMed 為例，其具體檢索策略見框 1。
圖1
1.3 文獻篩選和資料提取
由 2 名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對。如有分歧，則通過討論協商解決。文獻篩選時首先閱讀文題，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀摘要和全文以確定是否納入。如有需要，通過郵件、電話聯系原始研究作者獲取未確定但對本研究非常重要的信息。資料提取內容包括：① 納入研究的基本信息，包括研究題目、第一作者、發表雜志及時間、國家、研究類型、ASD 診斷標準等；② 研究對象的基線特征，包括各組的樣本數、患者年齡、性別和家庭狀況等；③ 暴露因素相關信息；④ 偏倚風險評價的關鍵要素；⑤ 所關注的結局指標和結果測量數據等。
1.4 納入研究的偏倚風險評價
由 2 名研究者獨立評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對結果。偏倚風險評價采用紐卡斯爾-渥太華量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）[12]。
1.5 統計分析
采用 RevMan 5.3 和 Stata 14.0 軟件進行 Meta 分析。采用比值比（odds ratio，OR）為效應分析統計量，各效應量均提供其 95% 可信區間（confidence interval，CI）。納入研究結果間的異質性采用 χ2 檢驗進行分析（檢驗水準為 α=0.1），同時結合 I2 定量判斷異質性大小。若各研究結果間無統計學異質性，則采用固定效應模型進行 Meta 分析；若各研究結果間存在統計學異質性，則進一步分析異質性來源，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機效應模型進行 Meta 分析。Meta 分析的水準設為 α=0.05[13]。明顯的臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析等方法探索異質性來源，或只行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻篩選流程及結果
初檢共獲得相關文獻 700 篇，經逐層篩選后，最終納入 17 個研究[10,11,14-28]，包括病例 10 812 例，對照 876 241 例。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
*所檢索的數據庫及檢出文獻數具體如下：PubMed（
2.2 納入研究的基本特征與偏倚風險評價結果
納入研究的基本特征見表 1，納入病例-對照研究和隊列研究的偏倚風險評價結果分別見表 2 和表 3。
表1
納入研究的基本特征
表2
納入病例-對照研究的偏倚風險評價結果（分）
表3
納入隊列研究的偏倚風險評價結果（分）
2.3 Meta 分析結果
共納入 17 個研究[10,11,14-28]。隨機效應模型 Meta 分析結果顯示，總體人群中，母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病之間無顯著相關性［OR=0.89，95%CI（0.77，1.03），P=0.13］（表4）。
表4
母親孕期補充葉酸與子代 ASD 發病相關性的亞組分析結果
2.4 亞組分析結果
按人群的不同地區來源進行亞組分析，結果顯示：亞洲人群母親孕期補充葉酸降低了其子代 ASD 發病風險［OR=0.71，95%CI（0.53，0.96），P=0.03］；但歐洲和美洲人群母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病之間無顯著相關性（表 4）。按不同研究類型進行亞組分析，結果顯示不論在病例-對照研究或隊列研究中，所有人群母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病風險之間均無顯著相關性（表 4）。
2.5 敏感性分析
采用逐一剔除單個研究的方法進行敏感性分析，結果顯示合并結果依然比較穩定。
3 討論
ASD 作為目前全球患病人數增長最快的精神殘障類疾病，已成為影響兒童生存與發展的重大公共衛生問題，是 5 歲以下兒童精神殘疾的主要原因[29]，其具體病因和發病機制目前尚不清楚[30]。因此除進行早期行為矯治和教育訓練外，如何通過科學的孕期保健降低子代 ASD 發病風險是當前面臨的重要醫學與社會問題。葉酸參與嘌呤和嘧啶核苷酸的合成，促進神經干細胞增殖及分化[31]，孕期補充葉酸可誘導 DNA 甲基化促進子代大腦神經發育[9,32,33]，而葉酸攝入或代謝異常則會直接影響神經系統的正常發育。動物研究也表明母親缺乏葉酸會導致子代 ASD 表型相關特征的發生[34]，孤獨癥模型 BTBR 小鼠在出生后早期補充葉酸會減少其重復刻板行為并改善社交、記憶和空間學習能力[35]。
有研究表明，孕期缺乏葉酸可能會增加子代患 ASD 的風險[36]，孕期補充葉酸可降低子代患 ASD 的風險[16,17,20]。孕婦在孕前 4 周至孕后 8 周補充葉酸對胎兒中樞神經系統發育的影響最為明顯[16,37]。有充足的證據表明孕期補充葉酸與子代認知功能之間存在正相關關系[38]。目前尚無針對孤獨癥治療的特效藥物[1]，但國內外研究證明，葉酸可能起到輔助治療與改善 ASD 患者病情的作用[39-41]，提示 ASD 兒童神經發育障礙可能與葉酸營養狀況有關。
本文采用 Meta 分析的方法，定量分析了孕期補充葉酸與子代 ASD 發病的相關性，結果表明總體人群中母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病無顯著相關性。考慮到地區人群不同及不同地區對補充葉酸或使用葉酸強化食品的政策和效益的不同[42-44]進行亞組分析，結果顯示，僅在亞洲人群中，母親孕期補充葉酸與其子代 ASD 發病風險存在相關性。
不同區域人群中的研究結果不同，其原因可能與飲食習慣、種族差異有關系。葉酸廣泛存在于動物食品、蔬菜和水果中，歐美發達國家典型的膳食結構以動物性食物為主，而納入歐洲地區的研究集中在北歐地區，其飲食習慣注重植物性食物，葉酸基礎補充量相對較好，且部分國家有葉酸強化食品的使用[42-44]，所以推斷該類人群體內本身可能普遍不缺乏葉酸，孕期補充葉酸后預防子代 ASD 發病的效果不明顯。而本研究中亞洲人群主要來自于中國，我國目前沒有大規模普及強化葉酸食物的攝入，且傳統烹飪方法會造成天然食物中葉酸損失高達 50%～90%[45]。有研究表明中國育齡婦女葉酸缺乏現象比較嚴重，患病率為 1%～20% 不等[46]。這可能是亞洲人群在孕期服用葉酸補充劑后預防子代發生 ASD 的效果更為顯著的原因。此外，不同種族的人群中葉酸的代謝能力可能不同，亞甲基四氫葉酸還原酶基因的 C677T 位點多態性會直接影響孕婦吸收及代謝葉酸的效率[47]。不同人群在該基因位點多態性可能存在一定差異，也會對研究結果產生一定的影響。
本研究的局限性：① 納入研究中補充葉酸的時間較寬泛，且葉酸攝入量多為問卷調查所得，存在信息偏倚、回憶偏倚；② 納入研究數量較少，特別是某地區人群的研究數量不足以提供較高把握度的證據；③ 納入研究為觀察性研究，受研究設計所限，選擇、測量等偏倚無法避免；④ 不同納入研究結果間存在異質性，樣本量大小的不同、對照組采用不同的控制條件、不同的診斷標準及多種混雜因素的影響等均可能是產生異質性的原因，但受研究數量所限，無法開展更詳細的亞組分析。
綜上所述，當前證據顯示，在亞洲人群中，母親孕期補充葉酸可能降低其子代 ASD 發病風險。受納入研究數量和質量限制，上述結論尚需開展更多高質量研究予以驗證。
