引用本文： 方玉蓮, 張瑞蘋, 支秀芳, 曹麗榮, 王懿征, 蔡春泉. MTHFD1 基因 G1958A 多態性與神經管缺陷易感性的 Meta 分析 . 中國循證醫學雜志, 2017, 17(4): 395-401. doi: 10.7507/1672-2531.201612098 復制
神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是指胚胎發育早期神經管閉合不完全而導致的一組先天性發育缺陷，主要包括脊柱裂、腦或腦脊膜膨出、無腦畸形等[1]。NTDs 是一種多因素疾病，由遺傳和環境共同作用導致，其發病機制仍不明確。有關研究報道 NTDs 患兒母親血漿中葉酸水平明顯降低而同型半胱氨酸的水平明顯升高[2]，且圍孕期母體補充葉酸制劑可使子代 NTDs 發生率降低 50%～75%[3]。因此，近年來許多研究都集中在葉酸-同型半胱氨酸代謝通路中。亞甲基四氫葉酸脫氫酶（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD1）是葉酸代謝通路中的關鍵酶，其在一碳單位的轉化和 DNA 合成中起著重要作用，該基因發生突變可導致該酶活性降低進而導致同型半胱氨酸水平升高、影響 DNA 合成。MTHFD1 基因位于人類染色體 14q23.3，存在多個基因多態性，而 1958G/A 是該基因中研究最多的位點。已有不少研究表明，MTHFD1 基因 1958G/A 多態性與 NTDs 的發生存在相關性[4,5]，但結論不盡相同[6,7]，且單個研究樣本量較小，得出可靠結論的可行性較低。故本研究采用 Meta 分析方法對雙親及患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性進行系統評價。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型 MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 易感性相關的病例-對照研究。
1.1.2 研究對象 病例組為臨床上明確診斷為 NTDs 的患者及其父母，對照組為正常人群。
1.1.3 暴露因素 MTHFD1 基因 G1958A 多態性。
1.1.4 結局指標 NTDs 的發病風險。
1.1.5 排除標準 ① 非中、英文文獻；② 重復發表的文獻；③ 原始數據無法提取的文獻；④ 綜述、會議或摘要等。
1.2 檢索策略
計算機檢索 PubMed、Web of Science、The Cochrane Library、CNKI、和 WanFang Data 數據庫，搜集MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 相關的病例-對照研究，檢索時限均為建庫至 2016 年 6 月。此外，追溯納入研究的參考文獻，以補充獲取相關文獻。英文檢索詞包括：variant、polymorphism、methylenetetrahydrofolate dehydrogenase、MTHFD1、neural tube defects、NTDs；中文檢索詞包括：神經管缺陷、亞甲基四氫葉酸脫氫酶、突變、基因多態性。以 PubMed 為例，具體檢索策略見框 1。
1.3 文獻篩選、資料提取與偏倚風險評價
由 2 名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對，如遇分歧，則討論解決，缺乏的資料盡量與作者聯系予以補充。文獻篩選時首先閱讀文題和摘要，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀全文，以確定最終是否納入。資料提取內容主要包括：第一作者、國家、發表時間、病例組和對照組樣本量、各基因型分布及其頻數，對照組 H-W 平衡定律（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）P 值及偏倚風險評價的關鍵要素等。采用 NOS 量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）評價納入研究的偏倚風險[8]。
1.4 統計分析
采用 Stata 12.0 軟件進行 Meta 分析。首先對納入研究的對照組基因型進行 H-W 平衡檢驗，若P<0.05，則對照組基因型不符合 H-W 平衡。隨后分別計算 5 種遺傳模型（AAvs. GG、AGvs. GG、AG+AAvs. GG、AAvs. AG+GG、Avs. G）下的基因型分布。采用 OR 值及 95%CI 作為合并分析的效應量，以α=0.05 為 Meta 分析的檢驗水準。運用Q 檢驗和I2 值來評估研究之間是否存在統計學異質性，若P>0.1，I2<50%，則表示研究間不存在統計學異質性，采用固定效應模型進行合并分析，否則采用隨機效應模型進行合并分析。此外，本研究通過剔除對照組中不符合遺傳平衡的研究進行敏感性分析，并采用 Begg’s 漏斗圖和 Egger’s 檢驗來評價發表偏倚。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初篩獲得相關文獻 96 篇，經過逐層篩選，最終獲得相關文獻 10 篇，共 13 個病例-對照研究[4-7,9-14]，其中 3 個研究[9-11]的對照組基因型不符合 H-W 平衡。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果 *所檢索的數據庫及檢出文獻數具體如下：PubMed（n=35）、Web of Science（n=57）、The Cochrance Library（n=0）、CNKI（n=3）、VIP（n=1）、WanFang Data（n=3）
2.2 納入研究的基本特征與偏倚風險評價
納入研究的基本特征和偏倚風險評價結果見表 1。
表1
納入研究的基本特征和偏倚風險評價結果
2.3 Meta 分析結果
2.3.1 患兒不同MTHFD1 基因型與 NTDs 發生的關聯 共納入 9 個研究[4-5,7,9-14]。Meta 分析結果顯示：① 與基因型 GG 比較，基因型 AA[OR=1.437，95%CI（1.100，1.878），P=0.008]和 AA+AG[OR=1.187，95%CI（1.031，1.367），P=0.017]增加 NTDs 的發病風險；而基因型 AG 與 NTDs 易感性無統計學差異[OR=1.108，95%CI（0.954，1.287），P=0.178]。敏感性分析結果發現，AGvs. GG 中，剔除 2 個[10,11]對照組基因型分布不符合 H-W 平衡的研究后其結果發生了改變[OR=1.295，95%CI（1.067，1.572），P=0.009]，而其它基因型結果穩定，均提示MTHFD1 基因與 NTDs 的發病相關。② 與等位基因 G 相比，等位基因 A 增加 NTDs 的發病風險[OR=1.210，95%CI（1.050，1.394），P=0.008]，提示患兒MTHFD1 基因 A1958G 多態性是 NTDs 發生的風險因素，具體結果見表 2。
表2
患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性
2.3.2 母親不同MTHFD1 基因型與子代 NTDs 發生的關聯 共納入 6 個研究[4,5,7,9-11]。Meta 分析結果顯示：與攜帶基因型 GG 相比，攜帶基因型 AA 的母親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.301，95%CI（1.081，1.565），P=0.005]；與攜帶基因型 AG+GG 相比，攜帶基因型 AA 的母親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.381，95%CI（1.186，1.608），P=0.000]；與攜帶等位基因 G 相比，攜帶等位基因 A 的母親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.126，95%CI（1.027，1.233），P=0.011]；但進一步敏感分析結果發現剔除 3 個[9-11]對照組基因型分布不符合 H-W 平衡的研究后，上述結果均發生改變（P均>0.05），提示母親MTHFD1 基因 A1958G 多態性與子代 NTDs 易感性無關，具體結果見表 3。
表3
母親MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性
2.3.3 父親不同MTHFD1 基因型與子代 NTDs 發生的關聯 共納入 4 個研究[4,5,10,11]。Meta 分析結果顯示：與攜帶基因型 AG+GG 相比，攜帶基因型 AA 的父親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.274，95%CI（1.030，1.576），P=0.026]，進一步剔除 2 個[10,11]對照組基因型分布不符合 H-W 平衡的研究結果顯示這種關聯性消失[OR=1.405，95%CI（0.739，2.674），P=0.300]，提示父親MTHFD1 基因 A1958G 多態性與子代 NTDs 易感性無關，具體結果見表 4。
表4
父親MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性
2.4 發表偏倚
采用 Begg’s 漏斗圖和 Egger’s 線性回歸模型進行發表偏倚分析。以 Avs. G 模型為例，漏斗圖結果顯示圖形對稱性較好（圖 2），Egger’s 線性回歸分析結果（P患兒=0.138，P母親=0.072，P父親=0.141）進一步證實無明顯發表偏倚。
圖2
A 等位基因發表偏倚漏斗圖 a：患兒 A 等位基因發表偏倚漏斗圖；b：母親 A 等位基因發表偏倚漏斗圖；c：父親 A 等位基因發表偏倚漏斗圖
3 討論
人類MTHFD1 基因編碼了一種具有三種酶（5，10-亞甲基四氫葉酸脫氫酶、5，10-次甲基四氫葉酸環化水解酶和 10-甲基四氫葉酸合成酶）活性的單一蛋白，這三種酶在四氫葉酸一碳單位衍生物的相互轉化過程中可催化三個連續反應[15]，生成的一碳單位用于嘌呤、胸苷酸、絲氨酸的合成，以及維持從同型半胱氨酸到蛋氨酸的再生成的甲基化循環[16]。若該基因發生突變，將導致該酶活性降低，進而影響 DNA 復制所需的一碳單位的生成，進而增加 NTDs 的發生危險。
MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 相關性研究備受關注，該位點在高加索人群 Meta 分析結果顯示，患兒及母親此位點多態性均與 NTDs 的發生具有相關性，但在患兒父親中未發現相關性[17]。但也有研究發現 NTDs 患兒的父親此位點與 NTDs 發生具有相關性[18]。本研究顯示患兒等位基因 A、基因型 AA 和基因型 AA+AG 相對于等位基因 G 和基因型 GG 均可增加 NTDs 發病風險。基因型 AG 與 NTDs 發病風險無關，但剔除不符合 H-W 平衡的研究后也顯示該基因型與 NTDs 發病相關，提示患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的易感性存在相關性；本研究還發現母親 AA 基因型和等位基因 A 與其子代 NTDs 發病風險增加相關；父親基因型 AA 相對于基因型 AG/GG 增加了子代 NTDs 發病風險，但剔除不符合 H-W 平衡的研究后其結果發生改變，這種關聯性均消失，提示母親和父親MTHFD1 基因 G1958A 多態性與子代 NTDs 易感性無相關性。
由于父親組納入研究間存在異質性較大，故進一步對其異質性來源進行探討發現在純合子、顯性和等位基因模型下剔除 Peasoona 等[5]研究后其異質性均顯著降低（I2=0.0%，I2=25.0% 和I2=0.0%）；在雜合子模型下剔除 Carroll 等[11]研究后其異質性顯著降低（I2=8.4%），說明 Peasoona 等[5]和 Carroll 等[11]這 2 個研究可能是造成父親組納入研究異質性較大的原因，但剔除后再次進行分析發現其結果未發生改變，說明該結論較為可靠。此外，本研究雖然納入了 13 個研究，但絕大多數研究為高加索人群，我們未進一步對人種進行分析。因此，將來的研究可進一步討論該多態性在特定種族人群 NTDs 發病機制的相關性。
本研究的局限性：① 本研究只納入公開發表的中英文文獻，未包含其他語種，可能存在語言偏倚；② 本研究未對 NTDs 的類型進行限制；③ 由于納入研究的限制，我們無法按人種進行亞組分析，將來還需要對亞組進一步探討。
綜上所述，患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性可增加 NTDs 發病風險。受納入研究數量和質量的限制，本研究的結論尚需展開更多高質量的研究予以驗證。
神經管缺陷（neural tube defects，NTDs）是指胚胎發育早期神經管閉合不完全而導致的一組先天性發育缺陷，主要包括脊柱裂、腦或腦脊膜膨出、無腦畸形等[1]。NTDs 是一種多因素疾病，由遺傳和環境共同作用導致，其發病機制仍不明確。有關研究報道 NTDs 患兒母親血漿中葉酸水平明顯降低而同型半胱氨酸的水平明顯升高[2]，且圍孕期母體補充葉酸制劑可使子代 NTDs 發生率降低 50%～75%[3]。因此，近年來許多研究都集中在葉酸-同型半胱氨酸代謝通路中。亞甲基四氫葉酸脫氫酶（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase，MTHFD1）是葉酸代謝通路中的關鍵酶，其在一碳單位的轉化和 DNA 合成中起著重要作用，該基因發生突變可導致該酶活性降低進而導致同型半胱氨酸水平升高、影響 DNA 合成。MTHFD1 基因位于人類染色體 14q23.3，存在多個基因多態性，而 1958G/A 是該基因中研究最多的位點。已有不少研究表明，MTHFD1 基因 1958G/A 多態性與 NTDs 的發生存在相關性[4,5]，但結論不盡相同[6,7]，且單個研究樣本量較小，得出可靠結論的可行性較低。故本研究采用 Meta 分析方法對雙親及患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性進行系統評價。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型 MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 易感性相關的病例-對照研究。
1.1.2 研究對象 病例組為臨床上明確診斷為 NTDs 的患者及其父母，對照組為正常人群。
1.1.3 暴露因素 MTHFD1 基因 G1958A 多態性。
1.1.4 結局指標 NTDs 的發病風險。
1.1.5 排除標準 ① 非中、英文文獻；② 重復發表的文獻；③ 原始數據無法提取的文獻；④ 綜述、會議或摘要等。
1.2 檢索策略
計算機檢索 PubMed、Web of Science、The Cochrane Library、CNKI、和 WanFang Data 數據庫，搜集MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 相關的病例-對照研究，檢索時限均為建庫至 2016 年 6 月。此外，追溯納入研究的參考文獻，以補充獲取相關文獻。英文檢索詞包括：variant、polymorphism、methylenetetrahydrofolate dehydrogenase、MTHFD1、neural tube defects、NTDs；中文檢索詞包括：神經管缺陷、亞甲基四氫葉酸脫氫酶、突變、基因多態性。以 PubMed 為例，具體檢索策略見框 1。
1.3 文獻篩選、資料提取與偏倚風險評價
由 2 名研究者獨立篩選文獻、提取資料并交叉核對，如遇分歧，則討論解決，缺乏的資料盡量與作者聯系予以補充。文獻篩選時首先閱讀文題和摘要，在排除明顯不相關的文獻后，進一步閱讀全文，以確定最終是否納入。資料提取內容主要包括：第一作者、國家、發表時間、病例組和對照組樣本量、各基因型分布及其頻數，對照組 H-W 平衡定律（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）P 值及偏倚風險評價的關鍵要素等。采用 NOS 量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）評價納入研究的偏倚風險[8]。
1.4 統計分析
采用 Stata 12.0 軟件進行 Meta 分析。首先對納入研究的對照組基因型進行 H-W 平衡檢驗，若P<0.05，則對照組基因型不符合 H-W 平衡。隨后分別計算 5 種遺傳模型（AAvs. GG、AGvs. GG、AG+AAvs. GG、AAvs. AG+GG、Avs. G）下的基因型分布。采用 OR 值及 95%CI 作為合并分析的效應量，以α=0.05 為 Meta 分析的檢驗水準。運用Q 檢驗和I2 值來評估研究之間是否存在統計學異質性，若P>0.1，I2<50%，則表示研究間不存在統計學異質性，采用固定效應模型進行合并分析，否則采用隨機效應模型進行合并分析。此外，本研究通過剔除對照組中不符合遺傳平衡的研究進行敏感性分析，并采用 Begg’s 漏斗圖和 Egger’s 檢驗來評價發表偏倚。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初篩獲得相關文獻 96 篇，經過逐層篩選，最終獲得相關文獻 10 篇，共 13 個病例-對照研究[4-7,9-14]，其中 3 個研究[9-11]的對照組基因型不符合 H-W 平衡。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果 *所檢索的數據庫及檢出文獻數具體如下：PubMed（n=35）、Web of Science（n=57）、The Cochrance Library（n=0）、CNKI（n=3）、VIP（n=1）、WanFang Data（n=3）
2.2 納入研究的基本特征與偏倚風險評價
納入研究的基本特征和偏倚風險評價結果見表 1。
表1
納入研究的基本特征和偏倚風險評價結果
2.3 Meta 分析結果
2.3.1 患兒不同MTHFD1 基因型與 NTDs 發生的關聯 共納入 9 個研究[4-5,7,9-14]。Meta 分析結果顯示：① 與基因型 GG 比較，基因型 AA[OR=1.437，95%CI（1.100，1.878），P=0.008]和 AA+AG[OR=1.187，95%CI（1.031，1.367），P=0.017]增加 NTDs 的發病風險；而基因型 AG 與 NTDs 易感性無統計學差異[OR=1.108，95%CI（0.954，1.287），P=0.178]。敏感性分析結果發現，AGvs. GG 中，剔除 2 個[10,11]對照組基因型分布不符合 H-W 平衡的研究后其結果發生了改變[OR=1.295，95%CI（1.067，1.572），P=0.009]，而其它基因型結果穩定，均提示MTHFD1 基因與 NTDs 的發病相關。② 與等位基因 G 相比，等位基因 A 增加 NTDs 的發病風險[OR=1.210，95%CI（1.050，1.394），P=0.008]，提示患兒MTHFD1 基因 A1958G 多態性是 NTDs 發生的風險因素，具體結果見表 2。
表2
患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性
2.3.2 母親不同MTHFD1 基因型與子代 NTDs 發生的關聯 共納入 6 個研究[4,5,7,9-11]。Meta 分析結果顯示：與攜帶基因型 GG 相比，攜帶基因型 AA 的母親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.301，95%CI（1.081，1.565），P=0.005]；與攜帶基因型 AG+GG 相比，攜帶基因型 AA 的母親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.381，95%CI（1.186，1.608），P=0.000]；與攜帶等位基因 G 相比，攜帶等位基因 A 的母親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.126，95%CI（1.027，1.233），P=0.011]；但進一步敏感分析結果發現剔除 3 個[9-11]對照組基因型分布不符合 H-W 平衡的研究后，上述結果均發生改變（P均>0.05），提示母親MTHFD1 基因 A1958G 多態性與子代 NTDs 易感性無關，具體結果見表 3。
表3
母親MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性
2.3.3 父親不同MTHFD1 基因型與子代 NTDs 發生的關聯 共納入 4 個研究[4,5,10,11]。Meta 分析結果顯示：與攜帶基因型 AG+GG 相比，攜帶基因型 AA 的父親會增加其子代 NTDs 的發病風險[OR=1.274，95%CI（1.030，1.576），P=0.026]，進一步剔除 2 個[10,11]對照組基因型分布不符合 H-W 平衡的研究結果顯示這種關聯性消失[OR=1.405，95%CI（0.739，2.674），P=0.300]，提示父親MTHFD1 基因 A1958G 多態性與子代 NTDs 易感性無關，具體結果見表 4。
表4
父親MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的相關性
2.4 發表偏倚
采用 Begg’s 漏斗圖和 Egger’s 線性回歸模型進行發表偏倚分析。以 Avs. G 模型為例，漏斗圖結果顯示圖形對稱性較好（圖 2），Egger’s 線性回歸分析結果（P患兒=0.138，P母親=0.072，P父親=0.141）進一步證實無明顯發表偏倚。
圖2
A 等位基因發表偏倚漏斗圖 a：患兒 A 等位基因發表偏倚漏斗圖；b：母親 A 等位基因發表偏倚漏斗圖；c：父親 A 等位基因發表偏倚漏斗圖
3 討論
人類MTHFD1 基因編碼了一種具有三種酶（5，10-亞甲基四氫葉酸脫氫酶、5，10-次甲基四氫葉酸環化水解酶和 10-甲基四氫葉酸合成酶）活性的單一蛋白，這三種酶在四氫葉酸一碳單位衍生物的相互轉化過程中可催化三個連續反應[15]，生成的一碳單位用于嘌呤、胸苷酸、絲氨酸的合成，以及維持從同型半胱氨酸到蛋氨酸的再生成的甲基化循環[16]。若該基因發生突變，將導致該酶活性降低，進而影響 DNA 復制所需的一碳單位的生成，進而增加 NTDs 的發生危險。
MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 相關性研究備受關注，該位點在高加索人群 Meta 分析結果顯示，患兒及母親此位點多態性均與 NTDs 的發生具有相關性，但在患兒父親中未發現相關性[17]。但也有研究發現 NTDs 患兒的父親此位點與 NTDs 發生具有相關性[18]。本研究顯示患兒等位基因 A、基因型 AA 和基因型 AA+AG 相對于等位基因 G 和基因型 GG 均可增加 NTDs 發病風險。基因型 AG 與 NTDs 發病風險無關，但剔除不符合 H-W 平衡的研究后也顯示該基因型與 NTDs 發病相關，提示患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性與 NTDs 的易感性存在相關性；本研究還發現母親 AA 基因型和等位基因 A 與其子代 NTDs 發病風險增加相關；父親基因型 AA 相對于基因型 AG/GG 增加了子代 NTDs 發病風險，但剔除不符合 H-W 平衡的研究后其結果發生改變，這種關聯性均消失，提示母親和父親MTHFD1 基因 G1958A 多態性與子代 NTDs 易感性無相關性。
由于父親組納入研究間存在異質性較大，故進一步對其異質性來源進行探討發現在純合子、顯性和等位基因模型下剔除 Peasoona 等[5]研究后其異質性均顯著降低（I2=0.0%，I2=25.0% 和I2=0.0%）；在雜合子模型下剔除 Carroll 等[11]研究后其異質性顯著降低（I2=8.4%），說明 Peasoona 等[5]和 Carroll 等[11]這 2 個研究可能是造成父親組納入研究異質性較大的原因，但剔除后再次進行分析發現其結果未發生改變，說明該結論較為可靠。此外，本研究雖然納入了 13 個研究，但絕大多數研究為高加索人群，我們未進一步對人種進行分析。因此，將來的研究可進一步討論該多態性在特定種族人群 NTDs 發病機制的相關性。
本研究的局限性：① 本研究只納入公開發表的中英文文獻，未包含其他語種，可能存在語言偏倚；② 本研究未對 NTDs 的類型進行限制；③ 由于納入研究的限制，我們無法按人種進行亞組分析，將來還需要對亞組進一步探討。
綜上所述，患兒MTHFD1 基因 G1958A 多態性可增加 NTDs 發病風險。受納入研究數量和質量的限制，本研究的結論尚需展開更多高質量的研究予以驗證。
