引用本文： 田躍軍, 郭琦, 陳朝暉, 陶燕, 王志平, 洪梅. 缺氧誘導因子-1α蛋白表達與腎細胞癌風險相關性的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2015, 15(9): 1035-1041. doi: 10.7507/1672-2531.20150173 復制
腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）簡稱腎癌，是一種起源于腎小管上皮細胞的泌尿系惡性腫瘤，主要的病理類型為透明細胞癌。腎細胞癌占人類惡性腫瘤的2%～3%，在全球的發病率和死亡率均呈增長趨勢 [1, 2]。手術治療是目前最佳手段，但術后約有20%～30%的患者出現復發和轉移，晚期腎細胞癌患者無法進行手術治療。由于腎癌對放、化療均不敏感，所以臨床上缺乏有效的治療手段 [3]。因而，探索腎癌發生、發展的分子機制，尋找有效的治療靶點對提高腎細胞癌患者的生存率和生活質量顯得尤為重要。已有研究發現，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤血管生成、DNA修復等生命活動中發揮著重要作用，并與多種惡性腫瘤的形成機制密切相關，其在腎細胞癌中的過表達影響著腎癌的發生發展，其可能成為腎細胞癌臨床治療的一個潛在靶點 [4-6]。
近年來，國內外學者針對HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌及其不同臨床和病理特征之間的相關性開展了較多研究，但樣本量偏少，且研究結果不一。為此，本研究對相關研究結果進行了系統評價和Meta分析，以明確HIF-1α蛋白表達水平與腎細胞癌的相關性，為腎細胞癌的診斷治療和預后提供循證醫學依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
國內外公開發表的評價HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌及其臨床病理特征相關性的病例-對照研究。
1.1.2 研究對象
所有病例均有完整的臨床病理資料，取材前均未經放療、化療和腫瘤藥物治療，全部病例診斷均經病理結果證實；所有納入人群均不受年齡、種族、國籍限制。
1.1.3 暴露因素
HIF-1α蛋白表達為暴露因素。HIF-1α的檢測方法為鏈霉菌親生物素-過氧化物酶連結法（SP法），評定標準采用半定量記分法。
1.1.4 結局指標
采用免疫組化SP法檢測腎細胞癌和正常腎組織中HIF-1α蛋白表達。
1.1.5 排除標準
① 未提供病例及正常對照來源；② 病例診斷標準不明確；③ HIF-1α的蛋白表達陽性判斷界值不一致；④ 重復發表的文獻；⑤ 僅有摘要而未找到全文的文獻。
1.2 檢索策略
計算機檢索The Cochrane Library、PubMed、EMbase、Ovid、CNKI、VIP、CBM及WanFang Data，搜集國內外公開發表的所有關于HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌及其臨床病理特征關系的病例-對照研究，檢索時限均為從建庫至2015年6月。采用主題詞和自由詞相結合的方式進行檢索。中文檢索詞包括缺氧誘導因子、HIF-1α、蛋白表達、腎癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌；英文檢索詞包括renal cell cancer、renal cancer、kidney cancer、renal carcinoma、renal clear cell carcinoma、HIF-1α。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
框 1 PubMed檢索策略
#1 renal cell cancer #2 renal cancer #3 kindey cancer #4 #1 OR #2 OR #3 #5 renal neoplasm #6 kindey neoplasm #7 #6 OR #5 #8 renal tumor #9 tumor of kindey #10 #9 OR #8 #11 renal carcinoma #12 carcinoma of kindey #13 #11 OR #12 #14 renal clear cell carcinoma #15 clear cell carcinoma of kindey #16 #14 OR #15 #17 #4 AND #7 AND #10 AND #13 AND #16 #18 HIF-1 #19 HIF-1 #20 hypoxia inducide factor-1 #21 #17 AND (#18 OR #19 OR #20)
1.3 文獻篩選、資料提取與納入研究的偏倚風險評價
由2位評價員獨立篩選文獻、提取資料和評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對，如遇分歧，則咨詢第三方協助判斷，缺乏的資料盡量與原作者聯系予以補充。資料提取內容主要包括：① 納入研究的基本信息，包括研究題目、第一作者、發表年限、原始文獻出處等；② 研究對象的基線特征和關注結局，包括各組的樣本數、患者的年齡、性別和腎細胞癌及其淋巴結轉移、臨床分期、病理學分級及HIF-1α陽性判定標準等。③ 偏倚風險評價的關鍵要素。采用NOS量表對納入研究的偏倚風險進行評價。
1.4 統計分析
采用RevMan 5.3軟件進行Meta分析。計數資料用相對危險度（RR）為效應指標，計量資料采用均數差（MD）為效應指標，各效應量均給出其點估計值和95%CI。納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗進行分析（檢驗水準為α=0.1），同時結合I2定量判斷異質性的大小。若各研究結果間無統計學異質性，則采用固定效應模型進行Meta分析；若各研究結果間存在統計學異質性，則進一步分析異質性來源，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機隨機效應模型進行Meta分析。明顯的臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析等方法進行處理，或只行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻156篇，經逐層篩選后，最終納入8個病例-對照研究 [7-14]，包括429個腎細胞癌組織、130個癌旁正常組織。所有納入研究均為中文文獻。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征和偏倚風險評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的偏倚風險評價
2.3 Meta分析結果
2.3.1 腎細胞癌組 vs. 正常組
7個研究 [7-10, 12-14]報告了腎細胞癌組與正常腎組織組的HIF-1α蛋白表達情況，其中腎細胞癌組429例，正常腎組織組130例。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌組的HIF-1α蛋白表達高于正常組，其差異有統計學意義[OR=16.76，95%CI（8.53，32.92），P＜0.000 01]（圖 2）。
圖2
腎細胞癌組與正常腎組織組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.2 伴淋巴結轉移組 vs. 無淋巴結轉移組
7個研究 [8-14]報告了有無淋巴結轉移的HIF-1α蛋白表達情況。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌伴淋巴結轉移組HIF-1α蛋白表達明顯高于無淋巴結轉移組，其差異有統計學意義[OR=4.33，95%CI（2.53，7.39），P＜0.000 01]（圖 3）。
圖3
腎細胞癌伴淋巴結轉移組與不伴淋巴結轉移組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.3 臨床Ⅰ～Ⅱ期組 vs. 臨床Ⅲ～Ⅳ期組
5個研究 [7, 9-11, 13]報告了不同臨床分期的HIF-1α蛋白表達情況，其中腎細胞癌臨床Ⅰ～Ⅱ期組196例，臨床Ⅲ～Ⅳ期組100例。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌臨床Ⅲ～Ⅳ期組的HIF-1α蛋白表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組，其差異有統計學意義[OR=0.30，95%CI（0.18，0.51），P＜0.000 1]（圖 4）。
圖4
腎細胞癌臨床Ⅰ～Ⅱ期組與Ⅲ～Ⅳ期組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.4 病理G1+G2期組 vs. G3+G4期組
4個研究 [7, 9, 11, 14]報告了不同組織學分級腫瘤的HIF-1α蛋白表達情況，其中腎細胞癌G1+G2期組145例，低分化G3+G4期組68例。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌G3+G4期組的HIF-1α蛋白表達明顯高于G1+G2期組，其差異有統計學意義[OR=0.54，95%CI（0.29，0.98），P=0.04]（圖 5）。
圖5
腎細胞癌病理G1+G2期組與G3+G4期組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.5 年齡≥50歲組 vs. 年齡＜50歲組
3個研究 [7-9]報告了腎細胞癌年齡≥ 50歲組與＜50歲組的HIF-1α蛋白表達情況，其中≥ 50歲組73例，＜50歲組60例。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組HIF-1α蛋白表達差異無統計學意義[OR=1.09，95%CI（0.54，2.19），P=0.82]（圖 6）。
圖6
腎細胞癌年齡≥ 50歲組與＜50歲組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.6 男性組 vs. 女性組
6個研究 [7-12]報告了腎細胞癌男性組與女性組的HIF-1α蛋白表達情況，其中男性組213例，女性組106例。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組HIF-1α蛋白表達差異無統計學意義[OR=0.77，95%CI（0.48，1.25），P=0.29]（圖 7）。
圖7
腎細胞癌男性組與女性組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
3 討論
HIF-1α作為一種調節體內氧穩態平衡的核轉錄因子，除參與介導的基因適應低氧環境外，同時也參與正常氧環境下細胞的各種生理和病理過程。如正常組織和腫瘤生長、細胞生存和死亡，以及應激反應等，當HIF-1α的活性下調時，能夠阻止血管生成，從而降低缺氧或炎癥組織的存活能力 [15]。目前通過下調HIF-1α作為各類腫瘤治療靶點的研究也越來越多，如肺癌 [16]、乳腺癌 [17]、結腸癌 [18]、卵巢癌 [19]等。
在腎細胞癌中，VHL基因突變，使其相應的蛋白產物pVHL缺乏，HIF-1α得不到降解，同時腫瘤細胞快速生長而缺氧，兩種因素導致HIF-1α在細胞內大量聚積，引起血管內皮生長因子（VEGF）、表皮因子（EGF）、血小板衍化生長因子（PDGF）過度表達，刺激血管生成，增強腫瘤生長和轉移能力 [20]。目前用于臨床的單克隆抗體貝伐單抗（bevacizumab），一種HIF-1α的靶基因，通過沉默VEGF的表達，使腫瘤細胞生長得到顯著抑制，已得到廣泛臨床應用 [21-23]。此外，mTORC1是一個蛋白激酶復合物，在腎細胞癌中存在過度活化，激活mTOR信號通路可提高HIF-1α的表達水平，而抑制mTOR信號通路的小分子量藥物坦西莫司（temsirolimus）和依維莫司（everolimus）也已經應用于臨床 [24]。研究HIF-1α相關蛋白在腎細胞癌中表達及預后的關系，也可為今后腎細胞癌的靶向治療提供更多客觀依據。
本Meta分析結果顯示，腎細胞癌組HIF-1α蛋白表達高于正常腎組織組，提示HIF-1α的高表達可能與腎細胞癌相關。腫瘤淋巴結轉移、臨床分期、組織病理學分級等都是腫瘤發病的重要因素。本研究結果顯示HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌淋巴結轉移有顯著關聯，提示HIF-1α在腎細胞癌的淋巴結內轉移及浸潤中起重要作用；而腎細胞癌中HIF-1α蛋白表達水平與臨床分期和組織病理學分級呈正相關，說明HIF-1α在腎細胞癌中可能起到癌基因的作用。
當然，本研究也存在一定的局限性：納入研究均為中文文獻；納入研究數和樣本量均偏少，部分合并分析納入研究數僅3個，樣本量僅數十例；未能進行調整數據的Meta分析。這些局限性均可能產生偏倚，而影響本次Meta分析結果的可靠性。
綜上所述，當前證據顯示，腎細胞癌與正常腎組織中HIF-1α蛋白表達存在明顯差異，其表達與腎細胞癌淋巴結轉移、不同臨床分期及組織學分級存在明顯關聯，但與患者年齡、性別無明顯相關性。鑒于納入研究質量和數量所限，本研究結論尚需開展更多設計嚴謹、高質量的病例-對照研究進一步驗證。
腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）簡稱腎癌，是一種起源于腎小管上皮細胞的泌尿系惡性腫瘤，主要的病理類型為透明細胞癌。腎細胞癌占人類惡性腫瘤的2%～3%，在全球的發病率和死亡率均呈增長趨勢 [1, 2]。手術治療是目前最佳手段，但術后約有20%～30%的患者出現復發和轉移，晚期腎細胞癌患者無法進行手術治療。由于腎癌對放、化療均不敏感，所以臨床上缺乏有效的治療手段 [3]。因而，探索腎癌發生、發展的分子機制，尋找有效的治療靶點對提高腎細胞癌患者的生存率和生活質量顯得尤為重要。已有研究發現，缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）在細胞增殖、分化、凋亡、腫瘤血管生成、DNA修復等生命活動中發揮著重要作用，并與多種惡性腫瘤的形成機制密切相關，其在腎細胞癌中的過表達影響著腎癌的發生發展，其可能成為腎細胞癌臨床治療的一個潛在靶點 [4-6]。
近年來，國內外學者針對HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌及其不同臨床和病理特征之間的相關性開展了較多研究，但樣本量偏少，且研究結果不一。為此，本研究對相關研究結果進行了系統評價和Meta分析，以明確HIF-1α蛋白表達水平與腎細胞癌的相關性，為腎細胞癌的診斷治療和預后提供循證醫學依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
國內外公開發表的評價HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌及其臨床病理特征相關性的病例-對照研究。
1.1.2 研究對象
所有病例均有完整的臨床病理資料，取材前均未經放療、化療和腫瘤藥物治療，全部病例診斷均經病理結果證實；所有納入人群均不受年齡、種族、國籍限制。
1.1.3 暴露因素
HIF-1α蛋白表達為暴露因素。HIF-1α的檢測方法為鏈霉菌親生物素-過氧化物酶連結法（SP法），評定標準采用半定量記分法。
1.1.4 結局指標
采用免疫組化SP法檢測腎細胞癌和正常腎組織中HIF-1α蛋白表達。
1.1.5 排除標準
① 未提供病例及正常對照來源；② 病例診斷標準不明確；③ HIF-1α的蛋白表達陽性判斷界值不一致；④ 重復發表的文獻；⑤ 僅有摘要而未找到全文的文獻。
1.2 檢索策略
計算機檢索The Cochrane Library、PubMed、EMbase、Ovid、CNKI、VIP、CBM及WanFang Data，搜集國內外公開發表的所有關于HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌及其臨床病理特征關系的病例-對照研究，檢索時限均為從建庫至2015年6月。采用主題詞和自由詞相結合的方式進行檢索。中文檢索詞包括缺氧誘導因子、HIF-1α、蛋白表達、腎癌、腎細胞癌、腎透明細胞癌；英文檢索詞包括renal cell cancer、renal cancer、kidney cancer、renal carcinoma、renal clear cell carcinoma、HIF-1α。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
框 1 PubMed檢索策略
#1 renal cell cancer #2 renal cancer #3 kindey cancer #4 #1 OR #2 OR #3 #5 renal neoplasm #6 kindey neoplasm #7 #6 OR #5 #8 renal tumor #9 tumor of kindey #10 #9 OR #8 #11 renal carcinoma #12 carcinoma of kindey #13 #11 OR #12 #14 renal clear cell carcinoma #15 clear cell carcinoma of kindey #16 #14 OR #15 #17 #4 AND #7 AND #10 AND #13 AND #16 #18 HIF-1 #19 HIF-1 #20 hypoxia inducide factor-1 #21 #17 AND (#18 OR #19 OR #20)
1.3 文獻篩選、資料提取與納入研究的偏倚風險評價
由2位評價員獨立篩選文獻、提取資料和評價納入研究的偏倚風險，并交叉核對，如遇分歧，則咨詢第三方協助判斷，缺乏的資料盡量與原作者聯系予以補充。資料提取內容主要包括：① 納入研究的基本信息，包括研究題目、第一作者、發表年限、原始文獻出處等；② 研究對象的基線特征和關注結局，包括各組的樣本數、患者的年齡、性別和腎細胞癌及其淋巴結轉移、臨床分期、病理學分級及HIF-1α陽性判定標準等。③ 偏倚風險評價的關鍵要素。采用NOS量表對納入研究的偏倚風險進行評價。
1.4 統計分析
采用RevMan 5.3軟件進行Meta分析。計數資料用相對危險度（RR）為效應指標，計量資料采用均數差（MD）為效應指標，各效應量均給出其點估計值和95%CI。納入研究結果間的異質性采用χ2檢驗進行分析（檢驗水準為α=0.1），同時結合I2定量判斷異質性的大小。若各研究結果間無統計學異質性，則采用固定效應模型進行Meta分析；若各研究結果間存在統計學異質性，則進一步分析異質性來源，在排除明顯臨床異質性的影響后，采用隨機隨機效應模型進行Meta分析。明顯的臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析等方法進行處理，或只行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻156篇，經逐層篩選后，最終納入8個病例-對照研究 [7-14]，包括429個腎細胞癌組織、130個癌旁正常組織。所有納入研究均為中文文獻。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征和偏倚風險評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的偏倚風險評價
2.3 Meta分析結果
2.3.1 腎細胞癌組 vs. 正常組
7個研究 [7-10, 12-14]報告了腎細胞癌組與正常腎組織組的HIF-1α蛋白表達情況，其中腎細胞癌組429例，正常腎組織組130例。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌組的HIF-1α蛋白表達高于正常組，其差異有統計學意義[OR=16.76，95%CI（8.53，32.92），P＜0.000 01]（圖 2）。
圖2
腎細胞癌組與正常腎組織組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.2 伴淋巴結轉移組 vs. 無淋巴結轉移組
7個研究 [8-14]報告了有無淋巴結轉移的HIF-1α蛋白表達情況。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌伴淋巴結轉移組HIF-1α蛋白表達明顯高于無淋巴結轉移組，其差異有統計學意義[OR=4.33，95%CI（2.53，7.39），P＜0.000 01]（圖 3）。
圖3
腎細胞癌伴淋巴結轉移組與不伴淋巴結轉移組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.3 臨床Ⅰ～Ⅱ期組 vs. 臨床Ⅲ～Ⅳ期組
5個研究 [7, 9-11, 13]報告了不同臨床分期的HIF-1α蛋白表達情況，其中腎細胞癌臨床Ⅰ～Ⅱ期組196例，臨床Ⅲ～Ⅳ期組100例。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌臨床Ⅲ～Ⅳ期組的HIF-1α蛋白表達明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組，其差異有統計學意義[OR=0.30，95%CI（0.18，0.51），P＜0.000 1]（圖 4）。
圖4
腎細胞癌臨床Ⅰ～Ⅱ期組與Ⅲ～Ⅳ期組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.4 病理G1+G2期組 vs. G3+G4期組
4個研究 [7, 9, 11, 14]報告了不同組織學分級腫瘤的HIF-1α蛋白表達情況，其中腎細胞癌G1+G2期組145例，低分化G3+G4期組68例。固定效應模型Meta分析結果顯示，腎細胞癌G3+G4期組的HIF-1α蛋白表達明顯高于G1+G2期組，其差異有統計學意義[OR=0.54，95%CI（0.29，0.98），P=0.04]（圖 5）。
圖5
腎細胞癌病理G1+G2期組與G3+G4期組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.5 年齡≥50歲組 vs. 年齡＜50歲組
3個研究 [7-9]報告了腎細胞癌年齡≥ 50歲組與＜50歲組的HIF-1α蛋白表達情況，其中≥ 50歲組73例，＜50歲組60例。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組HIF-1α蛋白表達差異無統計學意義[OR=1.09，95%CI（0.54，2.19），P=0.82]（圖 6）。
圖6
腎細胞癌年齡≥ 50歲組與＜50歲組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
2.3.6 男性組 vs. 女性組
6個研究 [7-12]報告了腎細胞癌男性組與女性組的HIF-1α蛋白表達情況，其中男性組213例，女性組106例。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組HIF-1α蛋白表達差異無統計學意義[OR=0.77，95%CI（0.48，1.25），P=0.29]（圖 7）。
圖7
腎細胞癌男性組與女性組HIF-1α蛋白表達比較的Meta分析
3 討論
HIF-1α作為一種調節體內氧穩態平衡的核轉錄因子，除參與介導的基因適應低氧環境外，同時也參與正常氧環境下細胞的各種生理和病理過程。如正常組織和腫瘤生長、細胞生存和死亡，以及應激反應等，當HIF-1α的活性下調時，能夠阻止血管生成，從而降低缺氧或炎癥組織的存活能力 [15]。目前通過下調HIF-1α作為各類腫瘤治療靶點的研究也越來越多，如肺癌 [16]、乳腺癌 [17]、結腸癌 [18]、卵巢癌 [19]等。
在腎細胞癌中，VHL基因突變，使其相應的蛋白產物pVHL缺乏，HIF-1α得不到降解，同時腫瘤細胞快速生長而缺氧，兩種因素導致HIF-1α在細胞內大量聚積，引起血管內皮生長因子（VEGF）、表皮因子（EGF）、血小板衍化生長因子（PDGF）過度表達，刺激血管生成，增強腫瘤生長和轉移能力 [20]。目前用于臨床的單克隆抗體貝伐單抗（bevacizumab），一種HIF-1α的靶基因，通過沉默VEGF的表達，使腫瘤細胞生長得到顯著抑制，已得到廣泛臨床應用 [21-23]。此外，mTORC1是一個蛋白激酶復合物，在腎細胞癌中存在過度活化，激活mTOR信號通路可提高HIF-1α的表達水平，而抑制mTOR信號通路的小分子量藥物坦西莫司（temsirolimus）和依維莫司（everolimus）也已經應用于臨床 [24]。研究HIF-1α相關蛋白在腎細胞癌中表達及預后的關系，也可為今后腎細胞癌的靶向治療提供更多客觀依據。
本Meta分析結果顯示，腎細胞癌組HIF-1α蛋白表達高于正常腎組織組，提示HIF-1α的高表達可能與腎細胞癌相關。腫瘤淋巴結轉移、臨床分期、組織病理學分級等都是腫瘤發病的重要因素。本研究結果顯示HIF-1α蛋白表達與腎細胞癌淋巴結轉移有顯著關聯，提示HIF-1α在腎細胞癌的淋巴結內轉移及浸潤中起重要作用；而腎細胞癌中HIF-1α蛋白表達水平與臨床分期和組織病理學分級呈正相關，說明HIF-1α在腎細胞癌中可能起到癌基因的作用。
當然，本研究也存在一定的局限性：納入研究均為中文文獻；納入研究數和樣本量均偏少，部分合并分析納入研究數僅3個，樣本量僅數十例；未能進行調整數據的Meta分析。這些局限性均可能產生偏倚，而影響本次Meta分析結果的可靠性。
綜上所述，當前證據顯示，腎細胞癌與正常腎組織中HIF-1α蛋白表達存在明顯差異，其表達與腎細胞癌淋巴結轉移、不同臨床分期及組織學分級存在明顯關聯，但與患者年齡、性別無明顯相關性。鑒于納入研究質量和數量所限，本研究結論尚需開展更多設計嚴謹、高質量的病例-對照研究進一步驗證。
