引用本文： 張林, 劉萍, 林晶, 陳月潔, 吳微奇, 周衛東. γ-干擾素釋放分析試驗（TB-IGRA）在藏族結核病診斷中的價值. 中國循證醫學雜志, 2015, 15(6): 625-627. doi: 10.7507/1672-2531.20150104 復制
結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染病[1]。在我國，目前有500萬活動性肺結核患者，每年有5萬人死于結核病；每年新發耐多藥肺結核患者約12萬，病例數居世界首位[2, 3]。根據WHO統計，我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核感染導致的死亡人數是其他傳染性疾病總死亡人數的2倍以上[4]。我國是多民族國家，擁有56個民族，結核病在各民族間的感染率不一，其中藏族結核病的患病率明顯高于全國平均水平[1, 5]。藏族主要分布在西藏、青海、四川和云南等地，提高藏族結核病的診斷效率對于控制藏族結核病的傳播和防治具有重要的現實意義[6]。早期快速診斷與治療是控制結核病的關鍵。目前結核病確診的主要依據是細菌學檢查包括痰和支氣管鏡肺泡灌洗液培養、涂片和病理檢查等[7]，但MTB培養需要很長時間，且陽性率較低，限制了其在結核病診斷中的作用。結核菌素試驗（TST）所使用的抗原純化蛋白衍生物與卡介苗存在交叉免疫，有較高的假陽性，診斷的特異性較差，不適用于卡介苗廣泛接種的地區[8, 9]。核酸擴增技術具有較好的敏感性和特異性，而且可做出早期快速診斷，但此檢測方法對實驗環境和操作技術都有很高要求，僅適用于有較好實驗室條件的醫院。
尋找結核病發病機制中的關鍵因子用于輔助診斷結核病一直是結核病研究的熱點[10, 11]。近年來，有研究證實，γ-干擾素在結核病的感染免疫中起重要作用，其主要由激活的T淋巴細胞在結核特異性抗原刺激下產生。通過檢測γ-干擾素來診斷結核已被臨床證實，即γ-干擾素釋放試驗（TB-IGRA）[12, 13]。該方法通過使用結核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個核細胞，通過細胞因子γ-干擾素的分泌檢測抗原特異性T淋巴細胞的應答反應，其具有較高的敏感性和特異性。已有大量TB-IGRA針對漢族人群結核病的研究報告[14, 15]，但其針對藏族人群的診斷效果，國內外尚未見報道。我院近年來收治的結核病藏族患者日益增多，本研究首次對TB-IGRA在藏族結核病檢測中的價值做初步探討，以期為其臨床應用提供參考依據。
1 對象與方法
1.1 納入與排除標準
納入2014年1月至12月在成都市363醫院住院治療的藏族疑似肺結核患者，排除HIV、乙肝、丙肝病毒陽性及復發性結核患者。
1.2 診斷標準
結核病的診斷如下[16]：① 痰涂片、胸腹水涂片檢查顯示抗酸桿菌陽性至少１次，或支氣管鏡肺泡灌洗內查到抗酸桿菌，或病理檢查證實具有肺結核改變；② 抗酸桿菌檢查顯示陰性，但患者具有長期低熱、咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、乏力等典型癥狀，胸部CT提示明顯肺結核征象，抗結核治療明顯有效，抗炎治療無效；③ 胸腔積液患者穿刺檢查，穿刺液為滲出液，穿刺液標本檢查可見大量淋巴細胞，腺苷脫氨酶大于45 U/L。
1.3 檢測方法
1.3.1 TB-IGRA檢測
采用靜脈穿刺術，使用肝素抗凝的真空采血管（BD公司）采集患者超過4 mL靜脈血，立即輕柔顛倒混勻3次以上，使抗凝劑充分溶解。將采集到的全血分裝到3種不同的培養管中。其中，“ T ”為添加了結核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測試培養管；“ N ”為本底對照培養管；“ P ”為添加了非特異刺激抗原植物血球凝集素（PHA）的陽性對照培養管。每種培養管分裝1 mL，分裝前需顛倒混勻3次以上。分裝后輕柔顛倒培養管5次，立刻于37℃培養箱中靜置培養22 h。之后取出，離心收集上清液。采用北京萬泰生物藥業股份有限公司提供的TB-IGRA檢測試劑盒檢測IFN-γ的含量，嚴格按照說明書操作。顯色后10 min內用波長為450 nm的酶標儀檢測，用空白孔調零點后測定各孔（N、T、P）吸光度值，求出IFN-γ含量。結果判定按照參考說明書進行。
1.3.2 涂片查分枝桿菌檢查
留取清晨的深部咳嗽濃痰，置于無菌容器內送檢；胸腔、腹腔穿刺液標本至少3ml置于滅菌試管中送檢。
1.4 統計分析
采用SPSS 11.0軟件進行統計分析。計算TB-IGRA和涂片查分枝桿菌檢查診斷藏族結核病的敏感性、特異性、漏診率和誤診率。
2 結果
共納入77例藏族疑似結核患者，其中男42例，女35例；年齡13～75歲，平均42歲；病程3 d至6個月。
2.1 TB-IGRA檢測與涂片查抗酸桿菌診斷結核陽性率
根據結核病的診斷標準，最終診斷為結核病的患者共50例，非結核病患者27例。結核患者包括肺結核25例，肺外結核25例。所有患者的TB-IGRA和涂片查分枝桿菌檢查結果見表 1。
表1
TB-IGRA檢測與涂片查抗酸桿菌診斷結核陽性率
2.2 TB-IGRA診斷藏族肺結核方法學評價
50例結核病患者TB-IGRA檢測陽性為43例，陰性為7例；27例非結核患者TB-IGRA檢測陽性為5例，陰性為22例。TB-IGRA檢測藏族結核的敏感性為86%，特異性為81.5%，誤診率為18.5%，漏診率為14%。50例結核病患者涂片查抗酸桿菌檢測陽性為11例，陰性為39例；27例非結核患者TB-IGRA檢測陽性為0例，陰性為27例。涂片查抗酸桿菌檢測藏族結核的敏感性為22%，特異性為100%，誤診率為0%，漏診率為78%。TB-IGRA檢測在敏感性上顯著優于涂片查抗酸桿菌檢測，但特異性不及后者。
3 討論
當前，結核病的防控最大問題仍然是如何快速診斷結核患者。細菌學檢查目前仍是臨床上結核病診斷的“金標準”；雖然細菌學檢查的特異度好，但其敏感度較低，可能造成大量的漏診。TST雖然是臨床常用的篩查結核的方法，是傳統用來診斷結核感染方法[8, 15]，但其存在諸多缺陷，包括：在易受結核感染的免疫力低下人群中，其敏感性降低；在普遍接種BCG的地區造成非常高的“假陽性率”。為克服現有的細菌學檢查和結核菌素皮膚試驗檢測的局限，近年來發展了許多新的診斷技術，TB-IGRA便是其中一種較為快速，敏感度、特異性都較高的診斷技術。
機體對結核分枝桿菌的免疫反應主要是由T淋巴細胞發動的細胞免疫[10]。機體被結核分枝桿菌感染后體內T淋巴細胞被致敏而成為記憶性T淋巴細胞，當這些T細胞再受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激時，就會產生IFN-γ。正是基于這個原理，產生了以測定IFN-γ水平為基礎的結核病診斷方法，如TB-IGRA。TB-IGRA檢測原理是感染結核桿菌后產生的記憶T淋巴細胞將在人體內長期存在，當再次受到結核桿菌相關抗原刺激時，記憶T淋巴細胞迅速增殖成為效應T淋巴細胞[7]。效應T淋巴細胞可以分泌IFN-γ。利用特異結核分枝桿菌免疫原（ESAT-6和CFP-10）刺激結核病患者的T淋巴細胞將能夠分泌IFN-γ，來檢查患者是否受到結核分枝桿菌感染。由于TB-IGRA檢測使用的抗原是結核分枝桿菌RD1和RD16區編碼的蛋白，這些蛋白在BCG中缺失，所以TB-IGRA能夠較好地區別BCG接種和結核分枝桿菌感染[8]。
本研究結果顯示，在藏族結核病患者中，TB-IGRA檢測的診斷靈敏度為86.0%，特異度為81.5%，與國內該試劑的其他文獻報道略有差異[17]。這可能是其在不同種族之間存在明顯的差異。由于結核菌特異性抗原（ESAT-6和CFP-10）的應用，排除了BCG接種及大多數非結核分枝桿菌的影響，特異性提高，并且整個試驗操作相對簡單、快速，能較快得出結果，能夠早期提供靈敏、特異的結核感染證據幫助臨床醫師做出正確的病因學判斷。在本研究中，部分非結核患者出現了TB-IGRA陽性，其原因也可能與其他結核分枝桿菌感染有關。
雖然TB-IGRA具有快速、敏感性高、特異性高等優勢，但其結果不能代替微生物病原學檢查和病理學檢查，也不能作為臨床診斷的唯一標準。因此，建議采用TB-IGRA與其他試驗聯合，可大大提高結核病的檢出率。
總之，本研究首次對TB-IGRA在診斷藏族結核病的價值進行了報道，研究結果顯示TB-IGRA檢測對藏族結核病具有較高的診斷價值，值得臨床推廣。
結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性傳染病[1]。在我國，目前有500萬活動性肺結核患者，每年有5萬人死于結核病；每年新發耐多藥肺結核患者約12萬，病例數居世界首位[2, 3]。根據WHO統計，我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核感染導致的死亡人數是其他傳染性疾病總死亡人數的2倍以上[4]。我國是多民族國家，擁有56個民族，結核病在各民族間的感染率不一，其中藏族結核病的患病率明顯高于全國平均水平[1, 5]。藏族主要分布在西藏、青海、四川和云南等地，提高藏族結核病的診斷效率對于控制藏族結核病的傳播和防治具有重要的現實意義[6]。早期快速診斷與治療是控制結核病的關鍵。目前結核病確診的主要依據是細菌學檢查包括痰和支氣管鏡肺泡灌洗液培養、涂片和病理檢查等[7]，但MTB培養需要很長時間，且陽性率較低，限制了其在結核病診斷中的作用。結核菌素試驗（TST）所使用的抗原純化蛋白衍生物與卡介苗存在交叉免疫，有較高的假陽性，診斷的特異性較差，不適用于卡介苗廣泛接種的地區[8, 9]。核酸擴增技術具有較好的敏感性和特異性，而且可做出早期快速診斷，但此檢測方法對實驗環境和操作技術都有很高要求，僅適用于有較好實驗室條件的醫院。
尋找結核病發病機制中的關鍵因子用于輔助診斷結核病一直是結核病研究的熱點[10, 11]。近年來，有研究證實，γ-干擾素在結核病的感染免疫中起重要作用，其主要由激活的T淋巴細胞在結核特異性抗原刺激下產生。通過檢測γ-干擾素來診斷結核已被臨床證實，即γ-干擾素釋放試驗（TB-IGRA）[12, 13]。該方法通過使用結核分枝桿菌特異性抗原刺激外周血單個核細胞，通過細胞因子γ-干擾素的分泌檢測抗原特異性T淋巴細胞的應答反應，其具有較高的敏感性和特異性。已有大量TB-IGRA針對漢族人群結核病的研究報告[14, 15]，但其針對藏族人群的診斷效果，國內外尚未見報道。我院近年來收治的結核病藏族患者日益增多，本研究首次對TB-IGRA在藏族結核病檢測中的價值做初步探討，以期為其臨床應用提供參考依據。
1 對象與方法
1.1 納入與排除標準
納入2014年1月至12月在成都市363醫院住院治療的藏族疑似肺結核患者，排除HIV、乙肝、丙肝病毒陽性及復發性結核患者。
1.2 診斷標準
結核病的診斷如下[16]：① 痰涂片、胸腹水涂片檢查顯示抗酸桿菌陽性至少１次，或支氣管鏡肺泡灌洗內查到抗酸桿菌，或病理檢查證實具有肺結核改變；② 抗酸桿菌檢查顯示陰性，但患者具有長期低熱、咳嗽、咳痰、咯血、消瘦、乏力等典型癥狀，胸部CT提示明顯肺結核征象，抗結核治療明顯有效，抗炎治療無效；③ 胸腔積液患者穿刺檢查，穿刺液為滲出液，穿刺液標本檢查可見大量淋巴細胞，腺苷脫氨酶大于45 U/L。
1.3 檢測方法
1.3.1 TB-IGRA檢測
采用靜脈穿刺術，使用肝素抗凝的真空采血管（BD公司）采集患者超過4 mL靜脈血，立即輕柔顛倒混勻3次以上，使抗凝劑充分溶解。將采集到的全血分裝到3種不同的培養管中。其中，“ T ”為添加了結核特異性抗原ESAT-6、CFP-10的測試培養管；“ N ”為本底對照培養管；“ P ”為添加了非特異刺激抗原植物血球凝集素（PHA）的陽性對照培養管。每種培養管分裝1 mL，分裝前需顛倒混勻3次以上。分裝后輕柔顛倒培養管5次，立刻于37℃培養箱中靜置培養22 h。之后取出，離心收集上清液。采用北京萬泰生物藥業股份有限公司提供的TB-IGRA檢測試劑盒檢測IFN-γ的含量，嚴格按照說明書操作。顯色后10 min內用波長為450 nm的酶標儀檢測，用空白孔調零點后測定各孔（N、T、P）吸光度值，求出IFN-γ含量。結果判定按照參考說明書進行。
1.3.2 涂片查分枝桿菌檢查
留取清晨的深部咳嗽濃痰，置于無菌容器內送檢；胸腔、腹腔穿刺液標本至少3ml置于滅菌試管中送檢。
1.4 統計分析
采用SPSS 11.0軟件進行統計分析。計算TB-IGRA和涂片查分枝桿菌檢查診斷藏族結核病的敏感性、特異性、漏診率和誤診率。
2 結果
共納入77例藏族疑似結核患者，其中男42例，女35例；年齡13～75歲，平均42歲；病程3 d至6個月。
2.1 TB-IGRA檢測與涂片查抗酸桿菌診斷結核陽性率
根據結核病的診斷標準，最終診斷為結核病的患者共50例，非結核病患者27例。結核患者包括肺結核25例，肺外結核25例。所有患者的TB-IGRA和涂片查分枝桿菌檢查結果見表 1。
表1
TB-IGRA檢測與涂片查抗酸桿菌診斷結核陽性率
2.2 TB-IGRA診斷藏族肺結核方法學評價
50例結核病患者TB-IGRA檢測陽性為43例，陰性為7例；27例非結核患者TB-IGRA檢測陽性為5例，陰性為22例。TB-IGRA檢測藏族結核的敏感性為86%，特異性為81.5%，誤診率為18.5%，漏診率為14%。50例結核病患者涂片查抗酸桿菌檢測陽性為11例，陰性為39例；27例非結核患者TB-IGRA檢測陽性為0例，陰性為27例。涂片查抗酸桿菌檢測藏族結核的敏感性為22%，特異性為100%，誤診率為0%，漏診率為78%。TB-IGRA檢測在敏感性上顯著優于涂片查抗酸桿菌檢測，但特異性不及后者。
3 討論
當前，結核病的防控最大問題仍然是如何快速診斷結核患者。細菌學檢查目前仍是臨床上結核病診斷的“金標準”；雖然細菌學檢查的特異度好，但其敏感度較低，可能造成大量的漏診。TST雖然是臨床常用的篩查結核的方法，是傳統用來診斷結核感染方法[8, 15]，但其存在諸多缺陷，包括：在易受結核感染的免疫力低下人群中，其敏感性降低；在普遍接種BCG的地區造成非常高的“假陽性率”。為克服現有的細菌學檢查和結核菌素皮膚試驗檢測的局限，近年來發展了許多新的診斷技術，TB-IGRA便是其中一種較為快速，敏感度、特異性都較高的診斷技術。
機體對結核分枝桿菌的免疫反應主要是由T淋巴細胞發動的細胞免疫[10]。機體被結核分枝桿菌感染后體內T淋巴細胞被致敏而成為記憶性T淋巴細胞，當這些T細胞再受到結核分枝桿菌特異性抗原刺激時，就會產生IFN-γ。正是基于這個原理，產生了以測定IFN-γ水平為基礎的結核病診斷方法，如TB-IGRA。TB-IGRA檢測原理是感染結核桿菌后產生的記憶T淋巴細胞將在人體內長期存在，當再次受到結核桿菌相關抗原刺激時，記憶T淋巴細胞迅速增殖成為效應T淋巴細胞[7]。效應T淋巴細胞可以分泌IFN-γ。利用特異結核分枝桿菌免疫原（ESAT-6和CFP-10）刺激結核病患者的T淋巴細胞將能夠分泌IFN-γ，來檢查患者是否受到結核分枝桿菌感染。由于TB-IGRA檢測使用的抗原是結核分枝桿菌RD1和RD16區編碼的蛋白，這些蛋白在BCG中缺失，所以TB-IGRA能夠較好地區別BCG接種和結核分枝桿菌感染[8]。
本研究結果顯示，在藏族結核病患者中，TB-IGRA檢測的診斷靈敏度為86.0%，特異度為81.5%，與國內該試劑的其他文獻報道略有差異[17]。這可能是其在不同種族之間存在明顯的差異。由于結核菌特異性抗原（ESAT-6和CFP-10）的應用，排除了BCG接種及大多數非結核分枝桿菌的影響，特異性提高，并且整個試驗操作相對簡單、快速，能較快得出結果，能夠早期提供靈敏、特異的結核感染證據幫助臨床醫師做出正確的病因學判斷。在本研究中，部分非結核患者出現了TB-IGRA陽性，其原因也可能與其他結核分枝桿菌感染有關。
雖然TB-IGRA具有快速、敏感性高、特異性高等優勢，但其結果不能代替微生物病原學檢查和病理學檢查，也不能作為臨床診斷的唯一標準。因此，建議采用TB-IGRA與其他試驗聯合，可大大提高結核病的檢出率。
總之，本研究首次對TB-IGRA在診斷藏族結核病的價值進行了報道，研究結果顯示TB-IGRA檢測對藏族結核病具有較高的診斷價值，值得臨床推廣。
