引用本文： 簡啟亮, 王芳, 丁楠, 杜宏, 黃山. 短時受精與常規受精在體外受精周期效果的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2014, 14(12): 1504-1509. doi: 10.7507/1672-2531.20140240 復制
隨著生活環境和生活方式的改變，不孕癥的發病率呈不斷上升的趨勢。據統計，中國不孕癥的發病率為6%～15% [1]。試管嬰兒技術即體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）是指將同一不孕不育夫婦的卵子和精子在實驗室使其自然結合、受精形成胚胎，并將形成的早期胚胎移植到女性的子宮內，孕育成嬰兒的技術。為獲得更高質量的胚胎和更好的IVF治療效果，需不斷優化IVF-ET技術。近年來，精卵體外共孵育時間的長短對受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率等的影響成為研究的熱點[2]。傳統受精方式主要采用常規過夜受精，即精卵共孵育時間一般為16～20小時。而近幾年，國內外一些生殖中心在不孕不育治療周期中通過短時受精方式進行體外受精，其結果顯示可明顯改善臨床治療效果[3, 4]，但也有報道發現短時受精并無此作用，甚至可能減少受精率，增加多精受精率[5-7]。由此可見，對于短時受精和常規受精對IVF結局的影響尚無統一定論。
另一方面，短時受精指將精卵共孵育時間縮短為2～6小時的受精方式[8]，但目前國內外研究通常實施短時受精時間多為1～6小時，且關于IVF治療中兩種受精方式效果比較的研究尚缺乏高質量證據。為此，本研究對IVF治療中采用短時受精（1～6小時）與常規受精（16～20小時）比較的隨機對照試驗（RCT）進行了系統評價，以期為臨床上IVF治療周期中受精方式的選擇提供更可靠的參考依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
RCT，無論是否采用盲法或分配隱藏。文種限中、英文。
1.1.2 研究對象
確診為需通過IVF-ET技術助孕的患者，且兩組患者年齡可比。
1.1.3 干預措施
試驗組采用短時受精，對照組采用常規受精。
1.1.4 結局指標
①受精率；②多精受精率；③優質胚胎率；④臨床妊娠率；⑤流產率。
1.1.5 排除標準
①短時受精后即刻脫顆粒細胞的研究；②納入研究報告資料不全或無法提取數據。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、The Cochrane Library（2014年第8期）、EMbase、CBM、CNKI、WanFang Data和VIP，檢索時限均為從建庫至2014年8月，同時追溯納入文獻的參考文獻。
采用主題詞與自由詞相結合的方式進行檢索。中文檢索詞包括體外受精-胚胎移植、短時受精、常規受精、受精率、妊娠率、優質胚胎率、隨機對照試驗等，英文檢索詞包括in vitro fertilization、short-term insemination、short-term fertilization、conventional fertilization、ferlization rate、clinical pregnancy rate、 randomized controlled trial等。以PubMed為例，具體檢索策略見框1。
框1 PubMed檢索策略
#1 short-term[All Fields] AND (“insemination”[MeSH Terms] OR “insemination”[All Fields]) #2 (((brief insemination) OR short co-incubation) OR reduced co-incubation) OR short-term insemination co-incubation of gametes [Title/Abstract] #3 ((long co-incubation[Title/Abstract]) OR prolonged culture[Title/Abstract] #4 ((occyte[Title/Abstract]) AND sperm[Title/Abstract]) OR gamete #5 #1 AND #2 AND #3 AND #4
1.3 文獻篩選、資料提取與質量評價
由2位評價者按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料和評價質量。如遇分歧則討論解決或交由第三方協助裁定。
采用自制的資料提取表提取資料，提取內容主要包括：①納入研究的基本信息，包括研究題目、第一作者、發表時間及發表雜志；②試驗組和對照組患者的基本信息，包括納入例數、平均年齡、所得卵子數目；③研究設計及干預措施；④結局指標。
采用Cochrane系統評價員手冊5.1.0 [9]推薦的RCT偏倚風險評估工具評價納入研究的偏倚風險。
1.4 統計分析
采用Cochrane協作網提供的RevMan 5.2軟件進行Meta分析。首先采用χ2檢驗分析各研究結果間的異質性，檢驗水準設為α=0.1，同時結合I2判斷異質性的大小。若P > 0.1且I2 < 50%，提示各研究結果間同質性較好，則采用固定效應模型進行Meta分析；若P≤0.1和/或I2≥50%，提示各研究結果間存在統計學異質性，若無明顯的臨床異質性來源，則采用隨機效應模型進行Meta分析。臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析進行處理，或僅行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻894篇，經逐層篩選后，最終納入6個RCT [4, 10-14]，共1 373例患者。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與質量評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的方法學質量評價
2.3 Meta分析結果
2.3.1 受精率
4個研究[4, 11, 12, 14]報告了受精率。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組受精率無明顯差異[OR=0.90，95%CI（0.80，1.02），P=0.09]（圖 2）。
圖2
兩組受精率比較的Meta分析
2.3.2 多精受精率
3個研究[4, 12, 13]報告了多精受精率。隨機效應模型Meta分析結果顯示，兩組多精受精率無明顯差異[OR=0.95，95%CI（0.64，1.41），P=0.81]（圖 3）。
圖3
兩組多精受精率比較的Meta分析
2.3.3 優質胚胎率
3個研究[4, 12, 14]報告了優質胚胎率。固定效應模型Meta分析結果顯示，短時受精在提高優質胚胎率方面優于常規受精，其差異具有統計學意義[OR=1.42，95%CI（1.18，1.70），P=0.000 2]（圖 4）。
圖4
兩組優質胚胎率比較的Meta分析
2.3.4 臨床妊娠率
6個研究[4, 10-14]報告了臨床妊娠率。固定效應模型進行Meta分析結果顯示，短時受精組臨床妊娠率高于常規受精組，其差異有統計學意義[OR=1.67，95%CI（1.33，2.09），P < 0.000 01]（圖 5）。
圖5
兩組臨床妊娠率比較的Meta分析
2.3.5 流產率
2個研究[10, 12]報告了流產率。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組流產率無明顯差異[OR=1.20，95%CI（0.33，4.34），P=0.78]（圖 6）。
圖6
兩組流產率比較的Meta分析
3 討論
在進行體外受精-胚胎移植治療過程中，影響其成功率的因素很多，而受精情況及胚胎質量的好壞直接關系到臨床治療結局，在受精方式的選擇方面，目前許多生殖中心仍沿用Harraway等[15]提出的常規受精方案。為了更加優化IVF-ET技術，提高臨床妊娠率，改善治療結局，近年來胚胎學家改善了受精方式，將精卵共孵育時間減少為1～6小時，結果顯示通過減少精卵共孵育的時間并不會影響受精率，反而可通過減少卵子與精子代謝產物的接觸時間，改善胚胎質量，提高臨床妊娠率[13, 16]。但亦有學者認為，短時受精非但不能提高優質胚胎率和總周期妊娠率，反而會明顯降低受精率[5, 17]。
本次Meta分析結果顯示：①受精率方面：與常規受精相比，短時受精的受精率并不會下降，兩種受精方式的受精率之間并無明顯差異。常規采用的IVF受精方式，即包裹大量顆粒細胞的卵丘卵母細胞復合物與大量精子在體外共同培養過夜（16～20小時），以充分保證精卵有足夠的受精時間，以期獲得理想的受精率。但近年來已有研究證明，短時受精并不會影響受精率[12, 13, 18]。Gianaroli等[10]的研究表明，在體外人類精子在15分鐘內即可進入卵丘細胞團，并完成受精過程，使得短時受精和常規受精的受精率無明顯差異，而本Meta分析結果也證實了這一點。②多精受精率方面：本次Meta分析結果顯示，短時受精并不會影響多精受精的發生，這與其他回顧性研究中短時受精會增加多精受精發生[7, 19]的結果不一致。考慮多精受精產生的原因可能與卵子不熟或過熟、透明帶功能缺陷、卵子皮質反應異常即卵子的質量有關。精子與卵子相遇時，精子在頂體酶的作用下發生頂體反應，開始受精過程。當1個精子進入卵子后，立即會阻斷Ca2+的流動，繼而發生皮質反應、透明帶反應、卵黃膜反應，從而阻止了其他精子的進入，上述反應過程瞬間即可完成，而不成熟卵子或過熟卵子透明帶及卵漿基質功能差，上述反應并不能正常發生，使多個精子有進入卵子的機會[20]。而短時受精并不會降低多精受精的主要原因可能與精卵孵育的時間有關。有研究表明，在體外受精中，人類精子15分鐘內即可進入卵丘細胞團[10]，而通常短時受精時間至少為1小時，精子有足夠時間接觸并穿透卵子，故當卵子質量不佳時短時受精同樣可形成多精受精而不會受受精方式的影響。③優質胚胎率和臨床妊娠率方面：本次Meta分析以及多個研究[4, 10-14]結果顯示，短時受精可提高優質胚胎率和臨床妊娠率。其原因可能在于：一方面，這些脫離了高密度精子而未脫落的顆粒細胞作為共培養細胞，可分泌一些對早期胚胎發育有利的物質，如生長因子、糖蛋白、氨基酸等，能促進胚胎發育提高胚胎質量[21]；另一方面，常規受精中卵子與高密度精子作用時間長，大量精子會消耗培養液的能量，使卵子處于營養不良環境中，同時精子代謝產物堆積，代謝產生的大量活性氧化物對胚胎發育不利，嚴重影響胚胎質量[22]。此外，精子代謝產生的大量過氧化物還可造成不飽和脂肪酸的過氧化，使細胞膜的流動性受到影響，從而使胞漿膜硬化，影響胚胎的分裂、發育、孵出與植入，降低胚胎種植率，從而影響臨床妊娠結局[23]。而短時受精在精卵結合后將其從授精液中移出，使其脫離這種不良環境，胚胎質量得到改善，提高了胚胎的種植潛能，獲得良好的妊娠結局[24, 25]。臨床妊娠率是評價試管嬰兒技術治療不孕癥療效的重要指標，而胚胎質量差是影響IVF成敗的主要原因之一，縮短精卵共孵育的時間有利于提高胚胎質量，從而提高胚胎種植潛能，提高臨床妊娠率[26, 27]。④流產率方面：本次Meta分析結果與其他研究[10, 12]結果一致，短時受精和常規受精的流產率無明顯差異，表明通過兩種受精方式獲得的胚胎在植入后發育潛力并無差異。實施IVF-ET技術后產生流產的原因可能是其他多種因素影響了胚胎種植的結果，諸如不孕癥的病因學以及通過雌激素測定所反映的卵巢反應性等[28]。
本系統評價的局限性：①納入研究數量和質量有限，部分研究僅提及隨機而未描述具體方法且所有研究均未報道分配隱藏方法；②多數結局指標納入研究較少，可能在一定程度上影響結果的可靠性；③多精受精率各納入研究結果間存在明顯的異質性，由于納入研究太少，而未進一步作亞組分析；④納入文種僅限于中、英文，存在語言偏倚的可能性。
綜上所述，當前證據顯示，在IVF-ET技術中，短時受精方法與常規受精方法相比，能提高優質胚胎率和臨床妊娠率，但并不會影響受精率、多精受精率和流產率。受納入研究數量及質量限制，上述結論尚需開展更多大樣本、高質量、長期隨訪的RCT來加以驗證。
隨著生活環境和生活方式的改變，不孕癥的發病率呈不斷上升的趨勢。據統計，中國不孕癥的發病率為6%～15% [1]。試管嬰兒技術即體外受精-胚胎移植技術（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）是指將同一不孕不育夫婦的卵子和精子在實驗室使其自然結合、受精形成胚胎，并將形成的早期胚胎移植到女性的子宮內，孕育成嬰兒的技術。為獲得更高質量的胚胎和更好的IVF治療效果，需不斷優化IVF-ET技術。近年來，精卵體外共孵育時間的長短對受精率、優質胚胎率、臨床妊娠率等的影響成為研究的熱點[2]。傳統受精方式主要采用常規過夜受精，即精卵共孵育時間一般為16～20小時。而近幾年，國內外一些生殖中心在不孕不育治療周期中通過短時受精方式進行體外受精，其結果顯示可明顯改善臨床治療效果[3, 4]，但也有報道發現短時受精并無此作用，甚至可能減少受精率，增加多精受精率[5-7]。由此可見，對于短時受精和常規受精對IVF結局的影響尚無統一定論。
另一方面，短時受精指將精卵共孵育時間縮短為2～6小時的受精方式[8]，但目前國內外研究通常實施短時受精時間多為1～6小時，且關于IVF治療中兩種受精方式效果比較的研究尚缺乏高質量證據。為此，本研究對IVF治療中采用短時受精（1～6小時）與常規受精（16～20小時）比較的隨機對照試驗（RCT）進行了系統評價，以期為臨床上IVF治療周期中受精方式的選擇提供更可靠的參考依據。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
RCT，無論是否采用盲法或分配隱藏。文種限中、英文。
1.1.2 研究對象
確診為需通過IVF-ET技術助孕的患者，且兩組患者年齡可比。
1.1.3 干預措施
試驗組采用短時受精，對照組采用常規受精。
1.1.4 結局指標
①受精率；②多精受精率；③優質胚胎率；④臨床妊娠率；⑤流產率。
1.1.5 排除標準
①短時受精后即刻脫顆粒細胞的研究；②納入研究報告資料不全或無法提取數據。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、The Cochrane Library（2014年第8期）、EMbase、CBM、CNKI、WanFang Data和VIP，檢索時限均為從建庫至2014年8月，同時追溯納入文獻的參考文獻。
采用主題詞與自由詞相結合的方式進行檢索。中文檢索詞包括體外受精-胚胎移植、短時受精、常規受精、受精率、妊娠率、優質胚胎率、隨機對照試驗等，英文檢索詞包括in vitro fertilization、short-term insemination、short-term fertilization、conventional fertilization、ferlization rate、clinical pregnancy rate、 randomized controlled trial等。以PubMed為例，具體檢索策略見框1。
框1 PubMed檢索策略
#1 short-term[All Fields] AND (“insemination”[MeSH Terms] OR “insemination”[All Fields]) #2 (((brief insemination) OR short co-incubation) OR reduced co-incubation) OR short-term insemination co-incubation of gametes [Title/Abstract] #3 ((long co-incubation[Title/Abstract]) OR prolonged culture[Title/Abstract] #4 ((occyte[Title/Abstract]) AND sperm[Title/Abstract]) OR gamete #5 #1 AND #2 AND #3 AND #4
1.3 文獻篩選、資料提取與質量評價
由2位評價者按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料和評價質量。如遇分歧則討論解決或交由第三方協助裁定。
采用自制的資料提取表提取資料，提取內容主要包括：①納入研究的基本信息，包括研究題目、第一作者、發表時間及發表雜志；②試驗組和對照組患者的基本信息，包括納入例數、平均年齡、所得卵子數目；③研究設計及干預措施；④結局指標。
采用Cochrane系統評價員手冊5.1.0 [9]推薦的RCT偏倚風險評估工具評價納入研究的偏倚風險。
1.4 統計分析
采用Cochrane協作網提供的RevMan 5.2軟件進行Meta分析。首先采用χ2檢驗分析各研究結果間的異質性，檢驗水準設為α=0.1，同時結合I2判斷異質性的大小。若P > 0.1且I2 < 50%，提示各研究結果間同質性較好，則采用固定效應模型進行Meta分析；若P≤0.1和/或I2≥50%，提示各研究結果間存在統計學異質性，若無明顯的臨床異質性來源，則采用隨機效應模型進行Meta分析。臨床異質性采用亞組分析或敏感性分析進行處理，或僅行描述性分析。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻894篇，經逐層篩選后，最終納入6個RCT [4, 10-14]，共1 373例患者。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與質量評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的方法學質量評價
2.3 Meta分析結果
2.3.1 受精率
4個研究[4, 11, 12, 14]報告了受精率。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組受精率無明顯差異[OR=0.90，95%CI（0.80，1.02），P=0.09]（圖 2）。
圖2
兩組受精率比較的Meta分析
2.3.2 多精受精率
3個研究[4, 12, 13]報告了多精受精率。隨機效應模型Meta分析結果顯示，兩組多精受精率無明顯差異[OR=0.95，95%CI（0.64，1.41），P=0.81]（圖 3）。
圖3
兩組多精受精率比較的Meta分析
2.3.3 優質胚胎率
3個研究[4, 12, 14]報告了優質胚胎率。固定效應模型Meta分析結果顯示，短時受精在提高優質胚胎率方面優于常規受精，其差異具有統計學意義[OR=1.42，95%CI（1.18，1.70），P=0.000 2]（圖 4）。
圖4
兩組優質胚胎率比較的Meta分析
2.3.4 臨床妊娠率
6個研究[4, 10-14]報告了臨床妊娠率。固定效應模型進行Meta分析結果顯示，短時受精組臨床妊娠率高于常規受精組，其差異有統計學意義[OR=1.67，95%CI（1.33，2.09），P < 0.000 01]（圖 5）。
圖5
兩組臨床妊娠率比較的Meta分析
2.3.5 流產率
2個研究[10, 12]報告了流產率。固定效應模型Meta分析結果顯示，兩組流產率無明顯差異[OR=1.20，95%CI（0.33，4.34），P=0.78]（圖 6）。
圖6
兩組流產率比較的Meta分析
3 討論
在進行體外受精-胚胎移植治療過程中，影響其成功率的因素很多，而受精情況及胚胎質量的好壞直接關系到臨床治療結局，在受精方式的選擇方面，目前許多生殖中心仍沿用Harraway等[15]提出的常規受精方案。為了更加優化IVF-ET技術，提高臨床妊娠率，改善治療結局，近年來胚胎學家改善了受精方式，將精卵共孵育時間減少為1～6小時，結果顯示通過減少精卵共孵育的時間并不會影響受精率，反而可通過減少卵子與精子代謝產物的接觸時間，改善胚胎質量，提高臨床妊娠率[13, 16]。但亦有學者認為，短時受精非但不能提高優質胚胎率和總周期妊娠率，反而會明顯降低受精率[5, 17]。
本次Meta分析結果顯示：①受精率方面：與常規受精相比，短時受精的受精率并不會下降，兩種受精方式的受精率之間并無明顯差異。常規采用的IVF受精方式，即包裹大量顆粒細胞的卵丘卵母細胞復合物與大量精子在體外共同培養過夜（16～20小時），以充分保證精卵有足夠的受精時間，以期獲得理想的受精率。但近年來已有研究證明，短時受精并不會影響受精率[12, 13, 18]。Gianaroli等[10]的研究表明，在體外人類精子在15分鐘內即可進入卵丘細胞團，并完成受精過程，使得短時受精和常規受精的受精率無明顯差異，而本Meta分析結果也證實了這一點。②多精受精率方面：本次Meta分析結果顯示，短時受精并不會影響多精受精的發生，這與其他回顧性研究中短時受精會增加多精受精發生[7, 19]的結果不一致。考慮多精受精產生的原因可能與卵子不熟或過熟、透明帶功能缺陷、卵子皮質反應異常即卵子的質量有關。精子與卵子相遇時，精子在頂體酶的作用下發生頂體反應，開始受精過程。當1個精子進入卵子后，立即會阻斷Ca2+的流動，繼而發生皮質反應、透明帶反應、卵黃膜反應，從而阻止了其他精子的進入，上述反應過程瞬間即可完成，而不成熟卵子或過熟卵子透明帶及卵漿基質功能差，上述反應并不能正常發生，使多個精子有進入卵子的機會[20]。而短時受精并不會降低多精受精的主要原因可能與精卵孵育的時間有關。有研究表明，在體外受精中，人類精子15分鐘內即可進入卵丘細胞團[10]，而通常短時受精時間至少為1小時，精子有足夠時間接觸并穿透卵子，故當卵子質量不佳時短時受精同樣可形成多精受精而不會受受精方式的影響。③優質胚胎率和臨床妊娠率方面：本次Meta分析以及多個研究[4, 10-14]結果顯示，短時受精可提高優質胚胎率和臨床妊娠率。其原因可能在于：一方面，這些脫離了高密度精子而未脫落的顆粒細胞作為共培養細胞，可分泌一些對早期胚胎發育有利的物質，如生長因子、糖蛋白、氨基酸等，能促進胚胎發育提高胚胎質量[21]；另一方面，常規受精中卵子與高密度精子作用時間長，大量精子會消耗培養液的能量，使卵子處于營養不良環境中，同時精子代謝產物堆積，代謝產生的大量活性氧化物對胚胎發育不利，嚴重影響胚胎質量[22]。此外，精子代謝產生的大量過氧化物還可造成不飽和脂肪酸的過氧化，使細胞膜的流動性受到影響，從而使胞漿膜硬化，影響胚胎的分裂、發育、孵出與植入，降低胚胎種植率，從而影響臨床妊娠結局[23]。而短時受精在精卵結合后將其從授精液中移出，使其脫離這種不良環境，胚胎質量得到改善，提高了胚胎的種植潛能，獲得良好的妊娠結局[24, 25]。臨床妊娠率是評價試管嬰兒技術治療不孕癥療效的重要指標，而胚胎質量差是影響IVF成敗的主要原因之一，縮短精卵共孵育的時間有利于提高胚胎質量，從而提高胚胎種植潛能，提高臨床妊娠率[26, 27]。④流產率方面：本次Meta分析結果與其他研究[10, 12]結果一致，短時受精和常規受精的流產率無明顯差異，表明通過兩種受精方式獲得的胚胎在植入后發育潛力并無差異。實施IVF-ET技術后產生流產的原因可能是其他多種因素影響了胚胎種植的結果，諸如不孕癥的病因學以及通過雌激素測定所反映的卵巢反應性等[28]。
本系統評價的局限性：①納入研究數量和質量有限，部分研究僅提及隨機而未描述具體方法且所有研究均未報道分配隱藏方法；②多數結局指標納入研究較少，可能在一定程度上影響結果的可靠性；③多精受精率各納入研究結果間存在明顯的異質性，由于納入研究太少，而未進一步作亞組分析；④納入文種僅限于中、英文，存在語言偏倚的可能性。
綜上所述，當前證據顯示，在IVF-ET技術中，短時受精方法與常規受精方法相比，能提高優質胚胎率和臨床妊娠率，但并不會影響受精率、多精受精率和流產率。受納入研究數量及質量限制，上述結論尚需開展更多大樣本、高質量、長期隨訪的RCT來加以驗證。
