引用本文： 于璐, 孟存仁, 張朝霞. 聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷價值的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2014, 14(6): 698-706. doi: 10.7507/1672-2531.20140119 復制
20世紀40年代以來，利福平、鏈霉素、異煙肼等抗結核藥物的廣泛使用，導致結核病的發病率和死亡率大幅下降。但由于耐藥結核，特別是耐多藥結核（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）和廣泛耐藥結核（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）的出現，給結核病的防控帶來嚴峻的挑戰[1]。目前，國內外已報道結核分支桿菌耐利福平是由于編碼細菌RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因發生突變所致，從而使利福平與細菌RNA聚合酶的親和力明顯降低，導致結核分支桿菌對利福平耐藥[2, 3]。因此，有人提出rpoB基因的突變可作為結核分支桿菌利福平耐藥的監測標志。
傳統體外藥敏實驗使用改良羅氏培養基分離培養，通過比例法或絕對濃度法進行結核分枝桿菌藥物敏感性檢測。常規結核分枝桿菌的藥敏試驗檢測時間較長，遠滯后于臨床診治的需求。隨著分子生物學技術的發展，更為快速的檢測MDR-TB的分子診斷技術被用于臨床試驗中。聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性（PCR-single-strand conformational polymorphism，PCR-SSCP）是一種快速、簡便、直接的基因突變分析方法，已用于結核分支桿菌的耐藥性基因突變的研究[4, 5]。目前已有較多文獻報道PCR-SSCP檢測結核分支桿菌基因突變的診斷價值[6-8]，但其研究樣本量不大，且使用的判讀參考標準、引物設計、標本類型、擴增長度也不盡相同。為此，本研究全面檢索PCR-SSCP診斷結核分支桿菌rpoB基因突變的相關文獻，采用Meta分析方法進行定量綜合，探討PCR-SSCP對結核分支桿菌rpoB基因突變的診斷價值。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
國內外已公開發表的關于應用PCR-SSCP方法進行MTB耐利福平rpoB基因突變檢測的診斷試驗。文種限定中、英文。
1.1.2 研究對象
①經細菌培養及鑒定的結核分枝桿菌；②經臨床藥敏試驗，包括細菌學藥敏（絕對濃度法、比例法和BACTEC藥敏檢測法）發現耐利福平的結核分支桿菌或敏感菌；③能獲得PCR-SSCP獨立篩查結核分枝桿菌耐利福平ropB基因突變的真陽性值（TP）、假陽性值（FP）、假陰性值（FN）、真陰性值（TN）等原始測量數據。
1.1.3 診斷方法
待評價試驗為PCR-SSCP法。以常規體外藥敏試驗結果為金標準。
1.1.4 結局指標
敏感度（sensitivity，SEN）、特異度（specificity，SPE）、陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）、診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）、匯總受試者工作特征曲線（summary receiver operating characteristic curve，SROC curve）和曲線下面積（area under the curve，AUC）。
1.1.5 排除標準
①會議報告、綜述、評論；②未描述具體診斷標準、未經金標準診斷的文獻；③數據提供不完整無法利用的文獻；④重復發表的文獻；⑤同一個機構兩個研究報告了相同的目標結果時，納入質量更好的報道；⑥排除僅文題涉及PCR-SSCP和結核分枝桿菌耐利福平rpoB基因突變，而與PCR-SSCP診斷結核分枝桿菌耐利福平rpoB基因突變無關的研究；⑦回顧性研究。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、Web of Science、CBM、The Cochrane Library（2014年第2期）、VIP和WanFang Data，查找PCR-SSCP檢測結核分支桿菌rpoB基因突變的診斷性研究，檢索時限均為從建庫至2014年1月。同時通過Google搜索引擎在互聯網上查找相關文獻，并手工檢索1980年至今的《中華檢驗醫學雜志》、《中華微生物學和免疫學》、《中華結核和呼吸雜志》和《中華流行病學雜志》。
中文檢索詞包括結核分枝、rpoB、PCR-SSCP、單鏈構象多態性，英文檢索詞包括rifampin、 rifampicin、rpoB、polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism、PCR-SSCP、 tuberculosis。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
框?1 ?PubMed檢索策略
polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism PCR-SSCP rpoB tuberculosis #l OR #2 #5 AND #3 AND #4
1.3 文獻篩選、資料提取與質量評價
由2位評價員按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料和評價納入研究的方法學質量。如遇分歧則討論解決或交由第三方協助裁定。
制定數據提取表提取資料，提取內容主要包括作者姓名、發表時間、研究國家、菌株數量、金標準、檢測方法、真陽性值、假陽性值、真陰性值和假陰性值。
納入研究的方法學質量根據Whiting等[9, 10]制訂的QUADAS量表 14條標準進行評價，對每個研究給予“是”、“否”或“不清楚”的評價。“是”為滿足此條標準，“否”為不滿足，部分滿足或從文獻中無法得到足夠信息的計為“不清楚”。
1.4 統計分析
采用Meta-DiSc 1.4軟件進行異質性分析，包括閾值效應和非閾值效應引起的異質性。若存在閾值效應，則最佳的合并數據方法是擬合sROC曲線和計算AUC，或應用其他統計量如Q指數；若異質性是由非閾值效應所致，則可嘗試采用隨機效應模型進行合并分析[11]，反之則采用固定效應模型進行Meta分析，計算合并的SEN、SPE、+LR、-LR和DOR，繪制SROC曲線，并計算AUC。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻257篇，經逐層篩選后，最終納入10個研究[12-21]，包括659例標本。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與質量評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的方法學質量評價
2.3 異質性檢驗
2.3.1 閾值效應
系統評價通過ROC曲線平面圖檢驗有無閾值效應，結果顯示不呈“肩臂狀”分布（圖 2），提示不存在閾值效應。進一步計算敏感度對數與（1-特異度）對數的Spearman相關系數=-0.055，P=0.881，b與0的差異不存在統計學意義，也表明不存在閾值效應。
圖2
納入研究精確估計量在ROC曲線平面圖的分布
2.3.2 非閾值效應
本系統評價通過SEN、SPE及DOR探討非閾值效應引起的異質性。結果顯示各研究之間SEN、SPE、+LR、-LR、DOR均存在異質性（χ2分別為19.78、37.11、36.79、19.25、19.68；P均 < 0.05；I2分別為54.5%、75.7%、75.5%、53.3%、54.3%）。同時，每一研究的精確估計值與合并值不呈同一直線（圖 3～圖 5），表明存在由非閾值效應引起的異質性。
圖3
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷SEN的Meta分析
圖4
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷SPE的Meta分析
圖5
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平DOR的Meta分析
2.4 Meta分析結果
2.4.1 合并統計量
各納入研究結果間存在由非閾值效應引起的異質性，因此采用隨機效應模型對納入研究進行Meta分析，結果顯示SEN合并=0.92［95%CI（0.90，0.94），P=0.019 3］、SPE合并=0.97［95%CI（0.95，0.98），P < 0.000 1］、+LR合并=23.68［95%CI（8.71，64.37），P < 0.000 1］、-LR合并=0.10［95%CI（0.06，0.15），P=0.023 1］和DOR合并=257.16［95%CI（96.82，683.02），P=0.020 0］（圖 3～圖 7）。繪制SROC曲線，其AUC=0.971 5（SE=0.010 7），Q*=0.922 3（SE=0.017 7）（圖 8）。
圖6
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷+LR的Meta分析
圖7
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷–LR的Meta分析
圖8
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷Meta分析的SROC
2.4.2 亞組分析
由于上述方法證明納入研究結果間存在由非閾值效應引起的異質性，故按不同DNA擴增長度、DNA提取方式和標本類型分組行亞組分析。
2.4.2.1 按擴增片段長度分組
4個研究[16, 18-20]擴增長度為157 bp，3個研究[13, 14, 21]擴增長度 > 200 bp，≤300 bp。隨機效應模型Meta分析結果顯示：該亞組的各診斷指標合并值及其P/Q值詳見表 3。由于納入研究中擴增長度在157 bp～200 bp及 > 300 bp的研究較少，無法納入亞組分析。僅1個研究[17]的擴增長度在157 bp～200 bp，其SEN為0.96［95%CI（0.86，0.10）］、SPE為0.57［95%CI（0.18，0.90）］。2個研究[12, 15]的擴增長度 > 300 bp，其中1個研究[12]的SEN為0.83［95%CI（0.66，0.95）］、SPE為0.96［95%CI（0.81，0.10）］，另1個研究[15]的SEN為0.82［95%CI（0.70，0.90）］、SPE為0.92［95%CI（0.81，0.98）］。
表3
亞組分析結果（擴增長度）
2.4.2.2 按不同DNA抽提方式分組
7個研究[12, 15-18, 20, 21]采用酚-氯仿-戊異醇進行DNA的抽提，表 4顯示，其SEN、SPE、+LR仍存在顯著的異質性。根據Deville [22]方法分析和觀察圖 3、4、6、7后，發現2個研究[15, 17]是合并統計量后異質性產生的來源。剔除該2個研究后，結果顯示SEN、SPE、+LR的I2分別降至32.4%、2.8%、30.2%，該亞組的各診斷指標合并值及其P/Q值詳見表 4。僅有1個研究[19]采用CTBA-NaCl法提取DNA，其SEN為0.97［95%CI（0.92，0.95）］、SPE為1.000［95%CI（0.96，1.00）］；僅2個研究[12, 13]采用水煮法提取DNA，其中1個研究[12]的SEN為0.89［95%CI（0.66，0.95）］、SPE為0.96［95%CI（0.81，1.0）］，另1個研究[13]的SEN為0.91［95%CI（0.86，0.94）］、SPE為0.94［95%CI（0.88，0.97）］。
表4
亞組分析結果（DNA抽提方式）
2.4.2.3 納入研究根據標本類型分組
1個研究[13]同時使用痰標本和臨床分離株（TP、FP、FN、TN分別為36、3、6、49，130、5、10、67）。2個研究[13, 20]采用痰標本，其中1個研究[13]的SEN為0.86［95%CI（0.72，0.95）］、SPE為0.94［95%CI（0.84，0.99）］，另1個研究[20]的SEN為0.82［95%CI（0.57，0.96）］、SPE為1.00［95%CI（0.97，1.00）］。9個研究[12-19, 21]采用臨床分離株，該亞組的各診斷指標合并值及其P/Q值詳見表 5。
表5
亞組分析結果（標本類型）
2.4.3 敏感性分析
分別剔除樣本量 < 100的研究[12, 16-18, 21]、中文研究[12-14]及QUADAS評分 > 10分的研究[13, 16, 20]，然后行敏感性分析。結果顯示，剔除文獻后各診斷結果穩定，提示結論較為可靠（表 6）。
表6
敏感性分析的結果
2.4.4 發表偏倚評估
Begg’s檢驗發表偏倚結果提示z=0.98，Pr > |z|=0.325，提示差異無統計學意義；Egger’s檢驗偏倚t=1.48、P=0.175且95%CI為（-1.217 8，5.541 9），提示發表偏倚可能性不大（圖 9）。
圖9
發表偏倚評估
3 討論
近年來，MDR-TB及XDR-TB的產生與傳播是造成全球結核病嚴峻形勢的主要原因之一。據WHO統計，2011年全球約有31萬MDR-TB，其中約9%為XDR-TB。中國是全世界結核病第二高負擔國家，MDR-TB病例數居世界首位[22-23]。利福平作為主要抗結核藥物之一，耐藥性產生的原因是由于結核分枝桿菌RNA多聚酶β亞單位的編碼基因rpoB基因的81個堿基的核心區域突變所致。
傳統結核分枝桿菌利福平耐藥的檢測，主要依靠體外培養的方法進行，所需時間為6～12周，時間長，難以及時為臨床提供資料，延誤患者治療，不能滿足短程化療的需要。Bactec結核菌快速培養系統2～4周便可完成結核菌的分離培養，但儀器昂貴，限制了其廣泛應用。
PCR-SSCP根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化通過對照圖譜直接來檢測基因變異。因其簡便、快速、特異等優點，一般的分子生物學實驗室均具備這種條件，一次檢測可在1～2 d內完成，現已被普遍接受。
本研究共納入10個研究，采用Meta分析方法，綜合定量評價聚合酶連反應-單鏈構象多態性技術檢測結核分支桿菌利福平耐藥性的診斷價值。
3.1 質量評價結果分析
本系統評價納入的研究都與金標準進行了比較，納入樣本均由常規培養鑒定的陽性結核分支桿菌，說明在一定程度上控制了偏倚。納入研究均報告了待測評價試驗和金標準試驗的測試方法和所使用儀器的生產商，試驗操作的重復性較好。疾病譜及納入標準的描述較為清晰。納入研究僅有兩篇提及觀察試驗結果時采用“盲法”，說明存在測量偏倚的可能。
3.2 異質性檢驗結果分析
診斷性試驗因難以滿足隨機對照的試驗原則，同時不同的研究者在試驗結果的判讀中常采用不同的閾值，因此閾值效應是引起異質性的重要原因之一。本系統評價的SROC曲線平面圖上不呈典型“肩臂狀”點分布，計算SEN對數與（1-特異度）對數的Spearman相關系數也不呈正相關性，表明各研究間不存在閾值效應引起的異質性。而通過對SEN、SPE、DOR進行統計學檢驗分析表明存在由非閾值效應引起的異質性，考慮到研究地域、研究菌株數量、QUADAS評分高低與異質性有關，故對上述3個因素行敏感性分析，結果顯示上述因素與異質性的關聯不大。進一步行亞組分析異質性來源發現，PCR-SSCP對臨床標本直接檢測時因痰標本中雜DNA較多，會影響PCR擴增效果；其次已有研究表明核苷酸片段越小，檢測敏感度越高，不同長度或同種長度不同單鏈構象都會對檢測敏感度具有直接影響；同時，水煮法抽提DNA適用于對純度要求不高的PCR，而傳統法抽提DNA損失量較大產率低，CTAB-NaCl法抽提DNA純度較高，蛋白雜質較少。亞組分析結果顯示，有些亞組雖仍存在一定的異質性，但明顯下降，由此解釋了異質性的部分來源。
3.3 Meta分析結果分析
本系統評價結果顯示，采用PCR-SSCP技術檢測結核分支桿菌對利福平耐藥性，SEN合并為92%，SPE合并為97%，漏診率為8%，誤診率為3%。+LR合并為23.68，說明PCR-SSCP檢測rpoB基因發生突變可以診斷結核分枝桿菌發生了利福平耐藥，-LR合并為0.10，說明PCR-SSCP檢測rpoB基因未發生突變可以排除結核分枝桿菌發生了利福平耐藥。AUC=0.972 4（SE=0.007 4），Q*=0.923 8（SE=0.012 3），AUC越接近1.0，表明診斷真實性越好。Q*值為曲線上SEN等于SPE的點，其價值和曲線下面積類似，代表了此項試驗的綜合性能。
3.4 亞組結果分析
3.4.1 選擇DNA擴增長度為研究對象
當擴增長度為159 bp時合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0；擴增長度為200～300 bp時，合并的SEN、SPE、DOR值也均較高，但較擴增長度為159 bp低，說明擴增長度在159 bp診斷價值較大。擴增長度在157 bp～200 bp和 > 300 bp時僅納入1～2個研究，其結果需謹慎應用。
3.4.2 選擇DNA提取方式進行亞組分析
酚-氯仿-戊乙醇抽提DNA合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0。CTBA-NaCl和水煮法提取DNA時只納入1～2個研究，其結果需謹慎應用。
3.4.3 選擇標本類型進行亞組分析
2個研究采用痰標本，其結果需謹慎應用。而9個研究采用臨床分離株，合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0，提示采用臨床分離株作為研究對象診斷價值較大。
3.5 本研究的局限性和對未來研究的啟示
本研究上存在以下局限性：①雖通過各種途徑、盡可能全面收集有關研究文獻，由2位評價者獨立按預先制定的納入、排除標準篩選文獻并對最終納入的文獻數據進行提取，如遇分歧則協商解決，但仍可能存在一定程度的選擇性偏倚；②多數納入研究未對研究對象的質量控制進行詳細描述和說明；③納入研究中大部分使用的是臨床分離株，應更多采用臨床標本直接進行檢測，更具有臨床實用價值；④納入研究中僅有2個研究提及盲法，可能會導致結果產生測量偏倚。
有鑒于此，建議今后研究應：①盡量采用診斷實驗報告標準（standards for reporting of diagnostic accuracy，STARD），提供診斷性試驗的報告質量，使診斷性試驗的結果更準確，更有利于臨床決策[24]；②應明確規定研究對象的標準（納入和排除標準），詳細描述研究對象特征、試驗方法、質量控制、試驗的測量指標等，以便于他人重復性驗證或將試驗結果應用于實踐[25]；③在進行診斷時，應做到“盲法”評估，采用盲法可有效避免研究者和受試者的測量偏倚和主觀偏倚，以保證結果的客觀性。待評價試驗的結果（金標準試驗的結果）判讀在不知曉金標準試驗結果（待評價試驗的結果）的情況下進行。
綜上所述，用PCR-SSCP法檢測結核分枝桿菌rpoB基因突變導致利福平耐藥診斷價值較高。
20世紀40年代以來，利福平、鏈霉素、異煙肼等抗結核藥物的廣泛使用，導致結核病的發病率和死亡率大幅下降。但由于耐藥結核，特別是耐多藥結核（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）和廣泛耐藥結核（extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）的出現，給結核病的防控帶來嚴峻的挑戰[1]。目前，國內外已報道結核分支桿菌耐利福平是由于編碼細菌RNA聚合酶β亞單位的rpoB基因發生突變所致，從而使利福平與細菌RNA聚合酶的親和力明顯降低，導致結核分支桿菌對利福平耐藥[2, 3]。因此，有人提出rpoB基因的突變可作為結核分支桿菌利福平耐藥的監測標志。
傳統體外藥敏實驗使用改良羅氏培養基分離培養，通過比例法或絕對濃度法進行結核分枝桿菌藥物敏感性檢測。常規結核分枝桿菌的藥敏試驗檢測時間較長，遠滯后于臨床診治的需求。隨著分子生物學技術的發展，更為快速的檢測MDR-TB的分子診斷技術被用于臨床試驗中。聚合酶鏈反應-單鏈構象多態性（PCR-single-strand conformational polymorphism，PCR-SSCP）是一種快速、簡便、直接的基因突變分析方法，已用于結核分支桿菌的耐藥性基因突變的研究[4, 5]。目前已有較多文獻報道PCR-SSCP檢測結核分支桿菌基因突變的診斷價值[6-8]，但其研究樣本量不大，且使用的判讀參考標準、引物設計、標本類型、擴增長度也不盡相同。為此，本研究全面檢索PCR-SSCP診斷結核分支桿菌rpoB基因突變的相關文獻，采用Meta分析方法進行定量綜合，探討PCR-SSCP對結核分支桿菌rpoB基因突變的診斷價值。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
國內外已公開發表的關于應用PCR-SSCP方法進行MTB耐利福平rpoB基因突變檢測的診斷試驗。文種限定中、英文。
1.1.2 研究對象
①經細菌培養及鑒定的結核分枝桿菌；②經臨床藥敏試驗，包括細菌學藥敏（絕對濃度法、比例法和BACTEC藥敏檢測法）發現耐利福平的結核分支桿菌或敏感菌；③能獲得PCR-SSCP獨立篩查結核分枝桿菌耐利福平ropB基因突變的真陽性值（TP）、假陽性值（FP）、假陰性值（FN）、真陰性值（TN）等原始測量數據。
1.1.3 診斷方法
待評價試驗為PCR-SSCP法。以常規體外藥敏試驗結果為金標準。
1.1.4 結局指標
敏感度（sensitivity，SEN）、特異度（specificity，SPE）、陽性似然比（positive likelihood ratio，+LR）、陰性似然比（negative likelihood ratio，-LR）、診斷比值比（diagnostic odds ratio，DOR）、匯總受試者工作特征曲線（summary receiver operating characteristic curve，SROC curve）和曲線下面積（area under the curve，AUC）。
1.1.5 排除標準
①會議報告、綜述、評論；②未描述具體診斷標準、未經金標準診斷的文獻；③數據提供不完整無法利用的文獻；④重復發表的文獻；⑤同一個機構兩個研究報告了相同的目標結果時，納入質量更好的報道；⑥排除僅文題涉及PCR-SSCP和結核分枝桿菌耐利福平rpoB基因突變，而與PCR-SSCP診斷結核分枝桿菌耐利福平rpoB基因突變無關的研究；⑦回顧性研究。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、Web of Science、CBM、The Cochrane Library（2014年第2期）、VIP和WanFang Data，查找PCR-SSCP檢測結核分支桿菌rpoB基因突變的診斷性研究，檢索時限均為從建庫至2014年1月。同時通過Google搜索引擎在互聯網上查找相關文獻，并手工檢索1980年至今的《中華檢驗醫學雜志》、《中華微生物學和免疫學》、《中華結核和呼吸雜志》和《中華流行病學雜志》。
中文檢索詞包括結核分枝、rpoB、PCR-SSCP、單鏈構象多態性，英文檢索詞包括rifampin、 rifampicin、rpoB、polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism、PCR-SSCP、 tuberculosis。以PubMed為例，其具體檢索策略見框1。
框?1 ?PubMed檢索策略
polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism PCR-SSCP rpoB tuberculosis #l OR #2 #5 AND #3 AND #4
1.3 文獻篩選、資料提取與質量評價
由2位評價員按照納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料和評價納入研究的方法學質量。如遇分歧則討論解決或交由第三方協助裁定。
制定數據提取表提取資料，提取內容主要包括作者姓名、發表時間、研究國家、菌株數量、金標準、檢測方法、真陽性值、假陽性值、真陰性值和假陰性值。
納入研究的方法學質量根據Whiting等[9, 10]制訂的QUADAS量表 14條標準進行評價，對每個研究給予“是”、“否”或“不清楚”的評價。“是”為滿足此條標準，“否”為不滿足，部分滿足或從文獻中無法得到足夠信息的計為“不清楚”。
1.4 統計分析
采用Meta-DiSc 1.4軟件進行異質性分析，包括閾值效應和非閾值效應引起的異質性。若存在閾值效應，則最佳的合并數據方法是擬合sROC曲線和計算AUC，或應用其他統計量如Q指數；若異質性是由非閾值效應所致，則可嘗試采用隨機效應模型進行合并分析[11]，反之則采用固定效應模型進行Meta分析，計算合并的SEN、SPE、+LR、-LR和DOR，繪制SROC曲線，并計算AUC。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻257篇，經逐層篩選后，最終納入10個研究[12-21]，包括659例標本。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征與質量評價
表1
納入研究的基本特征
表2
納入研究的方法學質量評價
2.3 異質性檢驗
2.3.1 閾值效應
系統評價通過ROC曲線平面圖檢驗有無閾值效應，結果顯示不呈“肩臂狀”分布（圖 2），提示不存在閾值效應。進一步計算敏感度對數與（1-特異度）對數的Spearman相關系數=-0.055，P=0.881，b與0的差異不存在統計學意義，也表明不存在閾值效應。
圖2
納入研究精確估計量在ROC曲線平面圖的分布
2.3.2 非閾值效應
本系統評價通過SEN、SPE及DOR探討非閾值效應引起的異質性。結果顯示各研究之間SEN、SPE、+LR、-LR、DOR均存在異質性（χ2分別為19.78、37.11、36.79、19.25、19.68；P均 < 0.05；I2分別為54.5%、75.7%、75.5%、53.3%、54.3%）。同時，每一研究的精確估計值與合并值不呈同一直線（圖 3～圖 5），表明存在由非閾值效應引起的異質性。
圖3
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷SEN的Meta分析
圖4
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷SPE的Meta分析
圖5
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平DOR的Meta分析
2.4 Meta分析結果
2.4.1 合并統計量
各納入研究結果間存在由非閾值效應引起的異質性，因此采用隨機效應模型對納入研究進行Meta分析，結果顯示SEN合并=0.92［95%CI（0.90，0.94），P=0.019 3］、SPE合并=0.97［95%CI（0.95，0.98），P < 0.000 1］、+LR合并=23.68［95%CI（8.71，64.37），P < 0.000 1］、-LR合并=0.10［95%CI（0.06，0.15），P=0.023 1］和DOR合并=257.16［95%CI（96.82，683.02），P=0.020 0］（圖 3～圖 7）。繪制SROC曲線，其AUC=0.971 5（SE=0.010 7），Q*=0.922 3（SE=0.017 7）（圖 8）。
圖6
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷+LR的Meta分析
圖7
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷–LR的Meta分析
圖8
PCR-SSCP檢測rpoB基因突變對結核分支桿菌耐利福平診斷Meta分析的SROC
2.4.2 亞組分析
由于上述方法證明納入研究結果間存在由非閾值效應引起的異質性，故按不同DNA擴增長度、DNA提取方式和標本類型分組行亞組分析。
2.4.2.1 按擴增片段長度分組
4個研究[16, 18-20]擴增長度為157 bp，3個研究[13, 14, 21]擴增長度 > 200 bp，≤300 bp。隨機效應模型Meta分析結果顯示：該亞組的各診斷指標合并值及其P/Q值詳見表 3。由于納入研究中擴增長度在157 bp～200 bp及 > 300 bp的研究較少，無法納入亞組分析。僅1個研究[17]的擴增長度在157 bp～200 bp，其SEN為0.96［95%CI（0.86，0.10）］、SPE為0.57［95%CI（0.18，0.90）］。2個研究[12, 15]的擴增長度 > 300 bp，其中1個研究[12]的SEN為0.83［95%CI（0.66，0.95）］、SPE為0.96［95%CI（0.81，0.10）］，另1個研究[15]的SEN為0.82［95%CI（0.70，0.90）］、SPE為0.92［95%CI（0.81，0.98）］。
表3
亞組分析結果（擴增長度）
2.4.2.2 按不同DNA抽提方式分組
7個研究[12, 15-18, 20, 21]采用酚-氯仿-戊異醇進行DNA的抽提，表 4顯示，其SEN、SPE、+LR仍存在顯著的異質性。根據Deville [22]方法分析和觀察圖 3、4、6、7后，發現2個研究[15, 17]是合并統計量后異質性產生的來源。剔除該2個研究后，結果顯示SEN、SPE、+LR的I2分別降至32.4%、2.8%、30.2%，該亞組的各診斷指標合并值及其P/Q值詳見表 4。僅有1個研究[19]采用CTBA-NaCl法提取DNA，其SEN為0.97［95%CI（0.92，0.95）］、SPE為1.000［95%CI（0.96，1.00）］；僅2個研究[12, 13]采用水煮法提取DNA，其中1個研究[12]的SEN為0.89［95%CI（0.66，0.95）］、SPE為0.96［95%CI（0.81，1.0）］，另1個研究[13]的SEN為0.91［95%CI（0.86，0.94）］、SPE為0.94［95%CI（0.88，0.97）］。
表4
亞組分析結果（DNA抽提方式）
2.4.2.3 納入研究根據標本類型分組
1個研究[13]同時使用痰標本和臨床分離株（TP、FP、FN、TN分別為36、3、6、49，130、5、10、67）。2個研究[13, 20]采用痰標本，其中1個研究[13]的SEN為0.86［95%CI（0.72，0.95）］、SPE為0.94［95%CI（0.84，0.99）］，另1個研究[20]的SEN為0.82［95%CI（0.57，0.96）］、SPE為1.00［95%CI（0.97，1.00）］。9個研究[12-19, 21]采用臨床分離株，該亞組的各診斷指標合并值及其P/Q值詳見表 5。
表5
亞組分析結果（標本類型）
2.4.3 敏感性分析
分別剔除樣本量 < 100的研究[12, 16-18, 21]、中文研究[12-14]及QUADAS評分 > 10分的研究[13, 16, 20]，然后行敏感性分析。結果顯示，剔除文獻后各診斷結果穩定，提示結論較為可靠（表 6）。
表6
敏感性分析的結果
2.4.4 發表偏倚評估
Begg’s檢驗發表偏倚結果提示z=0.98，Pr > |z|=0.325，提示差異無統計學意義；Egger’s檢驗偏倚t=1.48、P=0.175且95%CI為（-1.217 8，5.541 9），提示發表偏倚可能性不大（圖 9）。
圖9
發表偏倚評估
3 討論
近年來，MDR-TB及XDR-TB的產生與傳播是造成全球結核病嚴峻形勢的主要原因之一。據WHO統計，2011年全球約有31萬MDR-TB，其中約9%為XDR-TB。中國是全世界結核病第二高負擔國家，MDR-TB病例數居世界首位[22-23]。利福平作為主要抗結核藥物之一，耐藥性產生的原因是由于結核分枝桿菌RNA多聚酶β亞單位的編碼基因rpoB基因的81個堿基的核心區域突變所致。
傳統結核分枝桿菌利福平耐藥的檢測，主要依靠體外培養的方法進行，所需時間為6～12周，時間長，難以及時為臨床提供資料，延誤患者治療，不能滿足短程化療的需要。Bactec結核菌快速培養系統2～4周便可完成結核菌的分離培養，但儀器昂貴，限制了其廣泛應用。
PCR-SSCP根據形成不同構象的等長DNA單鏈在中性聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率變化通過對照圖譜直接來檢測基因變異。因其簡便、快速、特異等優點，一般的分子生物學實驗室均具備這種條件，一次檢測可在1～2 d內完成，現已被普遍接受。
本研究共納入10個研究，采用Meta分析方法，綜合定量評價聚合酶連反應-單鏈構象多態性技術檢測結核分支桿菌利福平耐藥性的診斷價值。
3.1 質量評價結果分析
本系統評價納入的研究都與金標準進行了比較，納入樣本均由常規培養鑒定的陽性結核分支桿菌，說明在一定程度上控制了偏倚。納入研究均報告了待測評價試驗和金標準試驗的測試方法和所使用儀器的生產商，試驗操作的重復性較好。疾病譜及納入標準的描述較為清晰。納入研究僅有兩篇提及觀察試驗結果時采用“盲法”，說明存在測量偏倚的可能。
3.2 異質性檢驗結果分析
診斷性試驗因難以滿足隨機對照的試驗原則，同時不同的研究者在試驗結果的判讀中常采用不同的閾值，因此閾值效應是引起異質性的重要原因之一。本系統評價的SROC曲線平面圖上不呈典型“肩臂狀”點分布，計算SEN對數與（1-特異度）對數的Spearman相關系數也不呈正相關性，表明各研究間不存在閾值效應引起的異質性。而通過對SEN、SPE、DOR進行統計學檢驗分析表明存在由非閾值效應引起的異質性，考慮到研究地域、研究菌株數量、QUADAS評分高低與異質性有關，故對上述3個因素行敏感性分析，結果顯示上述因素與異質性的關聯不大。進一步行亞組分析異質性來源發現，PCR-SSCP對臨床標本直接檢測時因痰標本中雜DNA較多，會影響PCR擴增效果；其次已有研究表明核苷酸片段越小，檢測敏感度越高，不同長度或同種長度不同單鏈構象都會對檢測敏感度具有直接影響；同時，水煮法抽提DNA適用于對純度要求不高的PCR，而傳統法抽提DNA損失量較大產率低，CTAB-NaCl法抽提DNA純度較高，蛋白雜質較少。亞組分析結果顯示，有些亞組雖仍存在一定的異質性，但明顯下降，由此解釋了異質性的部分來源。
3.3 Meta分析結果分析
本系統評價結果顯示，采用PCR-SSCP技術檢測結核分支桿菌對利福平耐藥性，SEN合并為92%，SPE合并為97%，漏診率為8%，誤診率為3%。+LR合并為23.68，說明PCR-SSCP檢測rpoB基因發生突變可以診斷結核分枝桿菌發生了利福平耐藥，-LR合并為0.10，說明PCR-SSCP檢測rpoB基因未發生突變可以排除結核分枝桿菌發生了利福平耐藥。AUC=0.972 4（SE=0.007 4），Q*=0.923 8（SE=0.012 3），AUC越接近1.0，表明診斷真實性越好。Q*值為曲線上SEN等于SPE的點，其價值和曲線下面積類似，代表了此項試驗的綜合性能。
3.4 亞組結果分析
3.4.1 選擇DNA擴增長度為研究對象
當擴增長度為159 bp時合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0；擴增長度為200～300 bp時，合并的SEN、SPE、DOR值也均較高，但較擴增長度為159 bp低，說明擴增長度在159 bp診斷價值較大。擴增長度在157 bp～200 bp和 > 300 bp時僅納入1～2個研究，其結果需謹慎應用。
3.4.2 選擇DNA提取方式進行亞組分析
酚-氯仿-戊乙醇抽提DNA合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0。CTBA-NaCl和水煮法提取DNA時只納入1～2個研究，其結果需謹慎應用。
3.4.3 選擇標本類型進行亞組分析
2個研究采用痰標本，其結果需謹慎應用。而9個研究采用臨床分離株，合并的SEN、SPE、DOR值均較高，AUC接近1.0，提示采用臨床分離株作為研究對象診斷價值較大。
3.5 本研究的局限性和對未來研究的啟示
本研究上存在以下局限性：①雖通過各種途徑、盡可能全面收集有關研究文獻，由2位評價者獨立按預先制定的納入、排除標準篩選文獻并對最終納入的文獻數據進行提取，如遇分歧則協商解決，但仍可能存在一定程度的選擇性偏倚；②多數納入研究未對研究對象的質量控制進行詳細描述和說明；③納入研究中大部分使用的是臨床分離株，應更多采用臨床標本直接進行檢測，更具有臨床實用價值；④納入研究中僅有2個研究提及盲法，可能會導致結果產生測量偏倚。
有鑒于此，建議今后研究應：①盡量采用診斷實驗報告標準（standards for reporting of diagnostic accuracy，STARD），提供診斷性試驗的報告質量，使診斷性試驗的結果更準確，更有利于臨床決策[24]；②應明確規定研究對象的標準（納入和排除標準），詳細描述研究對象特征、試驗方法、質量控制、試驗的測量指標等，以便于他人重復性驗證或將試驗結果應用于實踐[25]；③在進行診斷時，應做到“盲法”評估，采用盲法可有效避免研究者和受試者的測量偏倚和主觀偏倚，以保證結果的客觀性。待評價試驗的結果（金標準試驗的結果）判讀在不知曉金標準試驗結果（待評價試驗的結果）的情況下進行。
綜上所述，用PCR-SSCP法檢測結核分枝桿菌rpoB基因突變導致利福平耐藥診斷價值較高。
