引用本文： 盧青純, 唐小燕, 熊恬園, 黃驥翀, 楊旻, 童翔, 范紅. T-SPOT.TB試驗在活動性結核診斷中的價值及其影響因素分析. 中國循證醫學雜志, 2014, 14(5): 522-526. doi: 10.7507/1672-2531.20140090 復制
結核病是危害人類健康的最主要傳染病之一。據世界衛生組織（WHO）統計，全球約有20億人感染結核分支桿菌，每年約有200萬人死于結核病[1, 2]。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核病患者數高居世界第二。結核病可累及全身各個系統，其臨床表現多樣，尤其是肺外結核病臨床癥狀往往不典型，易被誤診為其他疾病，給其診斷帶來極大困難。當前診斷結核病的方法為根據臨床表現、影像學檢查、痰培養及結核菌素試驗（TST）等多因素綜合判斷，但在常規接種卡介苗的國家中痰培養及結核菌素試驗的敏感度及特異度均較低[3]，僅憑臨床表現和影像學特征無法確診結核病。因此，尋找快速、準確的診斷方法對于早期診斷活動性結核至關重要。
T-SPOT.TB試劑盒（Oxford Immunotec，Abingdon，UK）是建立在酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）基礎上的商業化結核診斷方法，其本質為以T細胞免疫應答作為基礎的γ-干擾素釋放試驗，通過檢測結核分支桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10特異性效應T細胞從而用于結核桿菌的檢測和結核病的輔助診斷[4]。其已在歐美國家被廣泛應用，并已被證實對結核診斷具有較高的敏感度及特異度。
與TST相比，T-SPOT.TB試驗診斷活動性結核的敏感度有顯著提高，但多項研究報告的試驗敏感度和特異度并不一致[5-9]。而國內對T-SPOT.TB試驗的臨床研究依舊不多。本研究采用T-SPOT.TB試劑盒對臨床疑似活動性結核病患者進行檢查，評估試驗的敏感度、特異度，并對試驗結果假陽性及假陰性的影響因素進行分析，旨在明確T-SPOT.TB試驗對活動性結核的診斷價值，為臨床診斷提供進一步依據。
1 對象與方法
1.1 研究對象
前瞻性納入2010年7月至2012年11月于四川大學華西醫院住院的疑似活動性結核患者289例，其中男性183例，女性106例，年齡46.3±18.0歲。排除：①資料不全或失訪的診斷性抗癆患者；②試驗前2周內接受過抗癆治療的患者；③診斷不明確的患者；④未接受診斷性抗癆或自行停藥的患者。對診斷性抗癆的患者分別于治療開始后1、3、6月進行3次隨訪。在研究終點（2013年8月）對所有病例進行診斷評估，按照最終診斷分為結核組（確診組+臨床診斷組）及對照組。
1.2 研究方法
取肝素抗凝靜脈血10 mL，加入Ficoll淋巴細胞分離液后離心分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），用細胞培養基重懸細胞。在培養板上每組條孔分別加入50 μL細胞培養基作為空白對照，50 μL植物血凝素作為陽性對照，50 μL結核分枝桿菌特異性ESAT-6、50 μL CFP-10抗原作為刺激原，之后每孔加入100 μL PBMC懸液。將培養板放入37°C孵箱培養16～20小時后，取出培養板并用PBS洗滌4次，加入堿性磷酸酶標記的二抗，2°C～8°C孵育1小時。洗滌培養板并加入顯色液50 μL，室溫靜置7分鐘后再次洗滌培養板終止反應，室溫2小時干燥計數斑點。陽性標準：①空白對照孔斑點數0～5個時且抗原A或抗原B孔的斑點數－空白對照孔斑點數≥6個；②空白對照孔斑點數6～10個時且抗原A或抗原B孔的斑點數≥2 ×空白對照孔斑點數。
1.3 統計分析
使用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料采用
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
共納入疑似活動性結核患者289例。在最終診斷的84例結核患者中，確診組17例，其中3例痰涂片見抗酸桿菌、7例病理活檢見抗酸桿菌、7例結核桿菌DNA的PCR試驗結果陽性；臨床診斷組67例，均為診斷性抗癆有效。此84例作為結核感染組，其中男52例，女32例，年齡17～92歲，平均42.1±18.1歲。對照組包括排除活動性結核感染的患者共156例，均臨床診斷為其他疾病并接受相應治療有效，其中男99例，女57例，年齡15～83歲，平均年齡48.1±17.7歲。排除的49例中，23例接受診斷性抗癆后失訪，3例于試驗前兩周曾接受抗癆治療，22例未確診便自動要求出院，1例于明確診斷前死亡。患者基本情況及所患基礎疾病見表 1、2。
表1
納入患者的基本情況
表2
納入患者的基礎疾病情況（例）
2.2 T-SPOT.TB試驗檢查結果
對84例活動性結核患者的T-SPOT.TB試驗結果進行分析，其中70例試驗結果陽性，陽性率83.3%；14例試驗結果陰性，占16.7%。對156例對照組患者進行試驗，125例檢測結果陰性，陰性率80.1%，31例檢測陽性（19.9%）。
2.3 T-SPOT.TB試驗影響因素分析
為探求T-SPOT.TB試驗結果的敏感度、特異度、假陽性及假陰性的影響因素，本研究對患者采用系統回顧和臨床病歷相結合的方法進行分析。對T-SPOT.TB試驗結果可能造成影響的因素包括性別、年齡、基礎疾病、結核類型等，應用單因素logistic回歸對以上結果進行分析，結果見表 3和表 4。
表3
T-SPOT.TB試驗假陰性影響因素分析［例（%）］
表4
T-SPOT.TB試驗假陽性影響因素分析［例（%）］
在單因素分析的基礎上，對P＜0.2的自變量建立多因素回歸模型，在分析剔除存在交互作用的混雜變量后，分析結果顯示本研究納入因素均非影響T-SPOT.TB試驗結果的危險因素。
3 討論
目前，對臨床疑似結核患者的診斷依然是結核診斷的難點，尤其是肺外結核，其臨床癥狀及體征普遍不典型，不具有特異性，臨床上容易漏診或誤診[10]。我國是廣泛接種卡介苗的國家，由于PPD試驗使用的純蛋白衍生物和卡介苗中部分抗原成分相同，易發生交叉反應，使PPD在接種卡介苗的地區出現了較高的假陽性率，診斷特異度較低[7, 11, 12]。近年來，兩種商業化γ-干擾素釋放試驗（IGRA）的興起為臨床診斷結核提供了新的思路，其中T-SPOT.TB試驗的敏感度又高于QuantiFERON-TB Gold [13, 14]。T-SPOT.TB試驗的刺激原ESAT-6及CFP-10抗原基因嚴格限制于結核分支桿菌復合群及4種非結核分支桿菌即M. kansasii、M. szulgai、M. marinum和M. gordonae中，不存在于卡介苗中[15, 16]，從而避免了傳統結核桿菌皮試中存在的BCG交叉抗原反應，保證了T-SPOT.TB試驗的特異度。
本研究對289例臨床疑似結核病患者進行了T-SPOT.TB試驗，結果表明其診斷活動性結核的敏感度和特異度分別為83.3%及80.1%。Dai等[17]對IGRA敏感度及特異度的應用文獻進行Meta分析，結果顯示T-SPOT.TB試驗的合并敏感度為85%，特異度為84%，而其中10項研究表明國內T-SPOT.TB試驗的敏感度及特異度分別為88%和89%，本研究結果與之基本相符。
此前已有多項研究對合并其他疾病的結核患者進行T-SPOT.TB試驗的敏感度進行分析。Yu等[18]的研究發現，在中國HIV感染合并活動性結核患者中，T-SPOT.TB試驗敏感度僅為41.3%。Santin等[19]的Meta分析結果顯示，在HIV感染患者中T-SPOT.TB試驗的合并敏感度和特異度分別為65%和70%，這提示HIV感染可能為T-SPOT.TB試驗假陰性結果的影響因素。Kim等[20]研究發現，T-SPOT.TB試驗的假陽性結果可能與結核感染史相關。但目前僅有Lee等[21]對T-SPOT.TB試驗假陰性的危險因素進行統計分析，結果顯示結核性腦膜炎可能是試驗假陰性的危險因素。而本研究首次用多因素logistic回歸對可能影響試驗結果的因素進行分析，結果顯示年齡、性別等基礎情況及免疫抑制狀態、惡性腫瘤等因素對T-SPOT.TB試驗結果均無影響，這與之前的研究結果一致。但本研究納入的肺外結核患者數目較少，且納入患者中無HIV感染者及有結核感染史的患者，無法與之前的研究進行比較，一定程度上影響了結果的精確性，需納入更多樣本進一步研究。
本研究使用T-SPOT.TB試驗對臨床疑似活動性結核的患者進行檢測，結果顯示T-SPOT.TB試驗對活動性結核診斷的敏感度及特異度均較高，影響試驗結果的危險因素少，而且操作簡便、快速，可作為早期診斷活動性結核的一種方法，具有較好的應用價值和推廣前景。
結核病是危害人類健康的最主要傳染病之一。據世界衛生組織（WHO）統計，全球約有20億人感染結核分支桿菌，每年約有200萬人死于結核病[1, 2]。我國是世界上22個結核病高負擔國家之一，結核病患者數高居世界第二。結核病可累及全身各個系統，其臨床表現多樣，尤其是肺外結核病臨床癥狀往往不典型，易被誤診為其他疾病，給其診斷帶來極大困難。當前診斷結核病的方法為根據臨床表現、影像學檢查、痰培養及結核菌素試驗（TST）等多因素綜合判斷，但在常規接種卡介苗的國家中痰培養及結核菌素試驗的敏感度及特異度均較低[3]，僅憑臨床表現和影像學特征無法確診結核病。因此，尋找快速、準確的診斷方法對于早期診斷活動性結核至關重要。
T-SPOT.TB試劑盒（Oxford Immunotec，Abingdon，UK）是建立在酶聯免疫斑點試驗（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）基礎上的商業化結核診斷方法，其本質為以T細胞免疫應答作為基礎的γ-干擾素釋放試驗，通過檢測結核分支桿菌特異性抗原ESAT-6和CFP-10特異性效應T細胞從而用于結核桿菌的檢測和結核病的輔助診斷[4]。其已在歐美國家被廣泛應用，并已被證實對結核診斷具有較高的敏感度及特異度。
與TST相比，T-SPOT.TB試驗診斷活動性結核的敏感度有顯著提高，但多項研究報告的試驗敏感度和特異度并不一致[5-9]。而國內對T-SPOT.TB試驗的臨床研究依舊不多。本研究采用T-SPOT.TB試劑盒對臨床疑似活動性結核病患者進行檢查，評估試驗的敏感度、特異度，并對試驗結果假陽性及假陰性的影響因素進行分析，旨在明確T-SPOT.TB試驗對活動性結核的診斷價值，為臨床診斷提供進一步依據。
1 對象與方法
1.1 研究對象
前瞻性納入2010年7月至2012年11月于四川大學華西醫院住院的疑似活動性結核患者289例，其中男性183例，女性106例，年齡46.3±18.0歲。排除：①資料不全或失訪的診斷性抗癆患者；②試驗前2周內接受過抗癆治療的患者；③診斷不明確的患者；④未接受診斷性抗癆或自行停藥的患者。對診斷性抗癆的患者分別于治療開始后1、3、6月進行3次隨訪。在研究終點（2013年8月）對所有病例進行診斷評估，按照最終診斷分為結核組（確診組+臨床診斷組）及對照組。
1.2 研究方法
取肝素抗凝靜脈血10 mL，加入Ficoll淋巴細胞分離液后離心分離外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），用細胞培養基重懸細胞。在培養板上每組條孔分別加入50 μL細胞培養基作為空白對照，50 μL植物血凝素作為陽性對照，50 μL結核分枝桿菌特異性ESAT-6、50 μL CFP-10抗原作為刺激原，之后每孔加入100 μL PBMC懸液。將培養板放入37°C孵箱培養16～20小時后，取出培養板并用PBS洗滌4次，加入堿性磷酸酶標記的二抗，2°C～8°C孵育1小時。洗滌培養板并加入顯色液50 μL，室溫靜置7分鐘后再次洗滌培養板終止反應，室溫2小時干燥計數斑點。陽性標準：①空白對照孔斑點數0～5個時且抗原A或抗原B孔的斑點數－空白對照孔斑點數≥6個；②空白對照孔斑點數6～10個時且抗原A或抗原B孔的斑點數≥2 ×空白對照孔斑點數。
1.3 統計分析
使用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料采用
2 結果
2.1 納入患者的基本情況
共納入疑似活動性結核患者289例。在最終診斷的84例結核患者中，確診組17例，其中3例痰涂片見抗酸桿菌、7例病理活檢見抗酸桿菌、7例結核桿菌DNA的PCR試驗結果陽性；臨床診斷組67例，均為診斷性抗癆有效。此84例作為結核感染組，其中男52例，女32例，年齡17～92歲，平均42.1±18.1歲。對照組包括排除活動性結核感染的患者共156例，均臨床診斷為其他疾病并接受相應治療有效，其中男99例，女57例，年齡15～83歲，平均年齡48.1±17.7歲。排除的49例中，23例接受診斷性抗癆后失訪，3例于試驗前兩周曾接受抗癆治療，22例未確診便自動要求出院，1例于明確診斷前死亡。患者基本情況及所患基礎疾病見表 1、2。
表1
納入患者的基本情況
表2
納入患者的基礎疾病情況（例）
2.2 T-SPOT.TB試驗檢查結果
對84例活動性結核患者的T-SPOT.TB試驗結果進行分析，其中70例試驗結果陽性，陽性率83.3%；14例試驗結果陰性，占16.7%。對156例對照組患者進行試驗，125例檢測結果陰性，陰性率80.1%，31例檢測陽性（19.9%）。
2.3 T-SPOT.TB試驗影響因素分析
為探求T-SPOT.TB試驗結果的敏感度、特異度、假陽性及假陰性的影響因素，本研究對患者采用系統回顧和臨床病歷相結合的方法進行分析。對T-SPOT.TB試驗結果可能造成影響的因素包括性別、年齡、基礎疾病、結核類型等，應用單因素logistic回歸對以上結果進行分析，結果見表 3和表 4。
表3
T-SPOT.TB試驗假陰性影響因素分析［例（%）］
表4
T-SPOT.TB試驗假陽性影響因素分析［例（%）］
在單因素分析的基礎上，對P＜0.2的自變量建立多因素回歸模型，在分析剔除存在交互作用的混雜變量后，分析結果顯示本研究納入因素均非影響T-SPOT.TB試驗結果的危險因素。
3 討論
目前，對臨床疑似結核患者的診斷依然是結核診斷的難點，尤其是肺外結核，其臨床癥狀及體征普遍不典型，不具有特異性，臨床上容易漏診或誤診[10]。我國是廣泛接種卡介苗的國家，由于PPD試驗使用的純蛋白衍生物和卡介苗中部分抗原成分相同，易發生交叉反應，使PPD在接種卡介苗的地區出現了較高的假陽性率，診斷特異度較低[7, 11, 12]。近年來，兩種商業化γ-干擾素釋放試驗（IGRA）的興起為臨床診斷結核提供了新的思路，其中T-SPOT.TB試驗的敏感度又高于QuantiFERON-TB Gold [13, 14]。T-SPOT.TB試驗的刺激原ESAT-6及CFP-10抗原基因嚴格限制于結核分支桿菌復合群及4種非結核分支桿菌即M. kansasii、M. szulgai、M. marinum和M. gordonae中，不存在于卡介苗中[15, 16]，從而避免了傳統結核桿菌皮試中存在的BCG交叉抗原反應，保證了T-SPOT.TB試驗的特異度。
本研究對289例臨床疑似結核病患者進行了T-SPOT.TB試驗，結果表明其診斷活動性結核的敏感度和特異度分別為83.3%及80.1%。Dai等[17]對IGRA敏感度及特異度的應用文獻進行Meta分析，結果顯示T-SPOT.TB試驗的合并敏感度為85%，特異度為84%，而其中10項研究表明國內T-SPOT.TB試驗的敏感度及特異度分別為88%和89%，本研究結果與之基本相符。
此前已有多項研究對合并其他疾病的結核患者進行T-SPOT.TB試驗的敏感度進行分析。Yu等[18]的研究發現，在中國HIV感染合并活動性結核患者中，T-SPOT.TB試驗敏感度僅為41.3%。Santin等[19]的Meta分析結果顯示，在HIV感染患者中T-SPOT.TB試驗的合并敏感度和特異度分別為65%和70%，這提示HIV感染可能為T-SPOT.TB試驗假陰性結果的影響因素。Kim等[20]研究發現，T-SPOT.TB試驗的假陽性結果可能與結核感染史相關。但目前僅有Lee等[21]對T-SPOT.TB試驗假陰性的危險因素進行統計分析，結果顯示結核性腦膜炎可能是試驗假陰性的危險因素。而本研究首次用多因素logistic回歸對可能影響試驗結果的因素進行分析，結果顯示年齡、性別等基礎情況及免疫抑制狀態、惡性腫瘤等因素對T-SPOT.TB試驗結果均無影響，這與之前的研究結果一致。但本研究納入的肺外結核患者數目較少，且納入患者中無HIV感染者及有結核感染史的患者，無法與之前的研究進行比較，一定程度上影響了結果的精確性，需納入更多樣本進一步研究。
本研究使用T-SPOT.TB試驗對臨床疑似活動性結核的患者進行檢測，結果顯示T-SPOT.TB試驗對活動性結核診斷的敏感度及特異度均較高，影響試驗結果的危險因素少，而且操作簡便、快速，可作為早期診斷活動性結核的一種方法，具有較好的應用價值和推廣前景。
