引用本文： 沈克鋒, 陰常欣, 葉艷艷, 江千里, 袁樂中, 陸洋. DNMT3a基因突變與成人原發急性髓系白血病患者初診時外周血象水平關系的Meta分析. 中國循證醫學雜志, 2014, 14(2): 225-230. doi: 10.7507/1672-2531.20140039 復制
表觀遺傳學研究是近年來研究的熱點。已有研究表明DNA甲基化在癌癥發病中起巨大作用[1-3]。DNA甲基化轉移酶3a（DNMT3a）是重要的DNA甲基化轉移酶之一，其主要作用是促使基因組“全新甲基化” [4]。已有研究表明，DNMT3a能維持造血干細胞自我更新和向下分化的動態平衡，敲除DNMT3a可導致造血干細胞大量增殖而造血功能停滯[5, 6]。還有研究表明，DNMT3a突變與急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者初診時外周血象水平相關，但目前尚無定論[7-17]。為此，本研究采用Meta分析方法，納入國內外公開發表的相關文獻，從外周血象的WBC、HGB、PLT三個方面，分析成人原發AML患者初診時DNMT3a突變與外周血象水平的關系。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
病例-對照研究，文種不限。
1.1.2 研究對象
①能提供DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時外周血象WBC、HGB、PLT三個指標的相關數據；②研究對象為成人原發初治AML患者；③患者就診前未接受過AML治療，外周血象為初診時數據。
1.1.3 暴露因素
病例組發生DNMT3a基因突變，對照組未發生DNMT3a基因突變。
1.1.4 結局指標
研究對象外周血象WBC、HGB、PLT水平。
1.1.5 排除標準
①重復發表或內容雷同但質量較差的文獻；②無法提取原始數據或者索取無果的文獻。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、ScienceDirect、EBSCO、Web of Science、CNKI、VIP和WanFang Data數據庫，輔以文獻追溯的方法，納入國內外公開發表的研究DNMT3a與AML患者初診時外周血象關系的病例-對照研究。檢索詞為DNMT3a和AML，采用主題詞與自由詞檢索相結合的方式。檢索年限均為從建庫至2012年12月30日。以PubMed為例，其具體檢索策略見框?1。
框1 ?PubMed檢索策略
acute myeloid leukemia DNMT3a variant OR mutation #1 AND #2 AND #3
1.3 資料提取
制定文獻資料提取表格，數據提取和整理由2名研究者獨立完成并交叉核對，如遇分歧，討論解決。若部分數據缺失，通過兩種方法解決：聯系文獻作者索要原始數據；運用Hozo等[18]所述方法進行統計學等價轉換推導。提取內容主要包括第一作者、地區、年份、樣本量、DNMT3a突變情況、外周血象水平等。
1.4 質量評價
采用Newcastle-Ottawa Scale（NOS）對病例-對照研究的質量評價標準[19]評價納入研究的方法學質量。
1.5 統計分析
Meta分析采用RevMan 5.2軟件。采用均數差（MD）及其95%可信區間（CI）為效應分析統計量，檢驗水準為α=0.05。首先對納入研究進行異質性檢驗，檢驗水平為α=0.10，同時使用I2判斷異質性的大小。若P＞0.10，I2＜50%，認為納入研究結果間無統計學異質性，采用固定效應模型進行Meta分析；反之若P≤0.10，I2≥50%，則提示納入研究結果間有統計學異質性，采用隨機效應模型進行Meta分析。發表偏倚通過繪制漏斗圖進行評價，漏斗圖不對稱或不完整則提示可能存在發表偏倚。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻69篇，經過逐層篩選，最終納入10篇文獻[7, 9-17]，共2 704例患者。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征和方法學質量評價
納入文獻的基本特征見表 1，納入文獻的方法學質量評價結果見表 2。
表1
納入研究的基本特征（
表2
納入研究的方法學質量評價（分）
2.3 Meta分析結果
2.3.1 WBC水平
10個研究[7, 9-17]報告了WBC水平與DNMT3a突變的關系，共包含DNMT3a突變的原發初治AML患者559例，DNMT3a未突變的原發初治AML患者2 145例。隨機效應模型Meta分析結果顯示，DNMT3a突變組初診時WBC水平明顯高于DNMT3a未突變組，其差異有統計學意義[WMD=23.62，95%CI（14.93，32.32），P＜0.000 01]（圖 2）。
圖2
DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時WBC水平比較的Meta分析
2.3.2 HGB水平
6個研究[9-12, 15, 16]報告了HGB水平與DNMT3a突變的關系，共包含DNMT3a突變的原發初治AML患者357例，DNMT3a未突變的原發初治AML患者1 482例。隨機效應模型Meta分析結果顯示，DNMT3a突變組初診時HGB水平明顯高于DNMT3a未突變組，其差異有統計學意義[WMD=4.54，95%CI（0.85，8.24），P=0.02]（圖 3）。
圖3
DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時HGB水平比較的Meta分析
2.3.3 PLT水平
7個研究[9-12, 15-17]報告了PLT水平與DNMT3a突變的關系，共包含DNMT3a突變的原發初治AML患者453例，DNMT3a未突變的原發初治AML患者1 801例。固定效應模型Meta分析結果顯示，DNMT3a突變組初診時HGB水平明顯高于DNMT3a未突變組，其差異有統計學意義[WMD=18.75，95%CI（10.48，27.02），P＜0.000 01]（圖 4）。
圖4
DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時PLT水平比較的Meta分析
2.4 發表偏倚分析
基于WBC水平與DNMT3a突變關系的漏斗圖顯示各納入研究在漏斗兩側分布對稱性較差（圖 5），提示存在發表偏倚的可能性較大。
圖5
基于WBC水平與DNMT3a突變關系的漏斗圖
3 討論
AML是一組異質性惡性克隆性疾病，系造血干細胞或祖細胞突變引起的造血系統惡性腫瘤。傳統觀點認為，AML主要與細胞遺傳學和分子生物學異常所導致的兩大類基因改變有關：第一類是激活下游信號通路的基因改變，如STAT、PI3K、RAS-MAPK等；第二類是影響關鍵轉錄因子表達的基因改變。最近研究表明，AML的發生可能存在第三類基因改變——表觀遺傳學基因改變，如DNMT3a、TET2、IDH1/2、ASXL1、EZH2、MLL等[20, 21]。
2010年，Yamashita等[22]在74例白血病患者中發現3例患者發生了DNMT3a基因的R882精氨酸位點突變，該突變直接導致DNA甲基化水平下降50%以上。隨后，Ley等[7]應用高通量全基因組測序方法發現在AML患者中DNMT3a突變發生率高達22%，與預后不良有關，且多伴正常核型。DNMT3a突變多發生在R882精氨酸位點，突變形式多樣，包括無義突變、錯義突變、插入/缺失突變、移碼突變等。2011年，國內陳賽娟等[8]通過對1 185例患者的研究也得出類似結果。DNMT3a突變是AML的一個重要分子事件，DNMT3a突變與疾病發病明顯相關。
DNMT3a突變與AML患者初診時外周血象水平的關系，目前尚無定論[7, 9-17]。本研究采用Meta分析方法，納入國內外公開發表的相關文獻，從外周血象的WBC、HGB、PLT三個方面，分析比較了成人原發AML患者DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時的外周血象水平，比較研究結果顯示成人原發AML患者DNMT3a突變組初診時的外周血象水平較DNMT3a未突變組高，且差異有統計學意義（P＜0.05）。
本Meta分析結果表明，DNMT3a突變組初診時外周血象水平較高，即伴隨較高腫瘤負荷水平，提示DNMT3a突變可能有促進細胞增殖的作用。其原因可能是DNMT3a突變常與FLT3（Fms樣酪氨酸激酶3）突變相伴發生[13, 15, 23]，而FLT3可促進細胞增殖[24, 25]。FLT3是造血干細胞和造血祖細胞表面表達的一種重要的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，在粒系和淋系細胞分化成熟中發揮重要作用[26, 27]。FLT3結合相應FLT3配體（Flt3 ligand）后可激活Ras/MAP、AKT和STAT5等下游信號通路來促進造血細胞生長發育[28, 29]。FLT3發生突變后可持續激活上述信號通路而導致旺盛造血。另一原因可能是，DNMT3a突變本身就可能具有促進細胞增殖功能。陳賽娟等[30]報道，DNMT3a突變伴隨較高的外周血水平現象，并研究了DNMT3a突變潛在的致白血病作用，他們發現過表達DNMT3a突變的小鼠32D細胞具有明顯的生長優勢，甚至可以不依賴生長因子生長。現有研究表明，DNMT3a突變提示預后不良[7, 9-17]，DNMT3a突變患者常伴隨較高的初診時外周血象水平，即較高的腫瘤負荷，而較高初診時腫瘤負荷也是AML預后不良的重要指標[31]。然而，DNMT3a突變組患者初診時伴隨較高的HGB和PLT水平，是否也意味著該組患者具有較低的貧血及出血風險？進而推測DNMT3a突變組預后較好呢？考慮到患者預后與初診時腫瘤負荷水平及治療后血象變化情況存在更為密切的關系，從總體上說，我們不能單從初診時DNMT3a突變組患者較高的HGB及PLT水平，就推測DNMT3a突變組患者在整個疾病過程中具有較低的貧血及出血風險。
綜上所述，本研究結果表明成人原發AML患者DNMT3a突變組初診時外周血象水平較DNMT3a未突變組高，這有助于我們更好地探索DNMT3a突變在AML發生發展中的作用。DNMT3a突變或可納入AML新的預后分層評價指標中，指導對AML進行分層治療。
表觀遺傳學研究是近年來研究的熱點。已有研究表明DNA甲基化在癌癥發病中起巨大作用[1-3]。DNA甲基化轉移酶3a（DNMT3a）是重要的DNA甲基化轉移酶之一，其主要作用是促使基因組“全新甲基化” [4]。已有研究表明，DNMT3a能維持造血干細胞自我更新和向下分化的動態平衡，敲除DNMT3a可導致造血干細胞大量增殖而造血功能停滯[5, 6]。還有研究表明，DNMT3a突變與急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）患者初診時外周血象水平相關，但目前尚無定論[7-17]。為此，本研究采用Meta分析方法，納入國內外公開發表的相關文獻，從外周血象的WBC、HGB、PLT三個方面，分析成人原發AML患者初診時DNMT3a突變與外周血象水平的關系。
1 資料與方法
1.1 納入與排除標準
1.1.1 研究類型
病例-對照研究，文種不限。
1.1.2 研究對象
①能提供DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時外周血象WBC、HGB、PLT三個指標的相關數據；②研究對象為成人原發初治AML患者；③患者就診前未接受過AML治療，外周血象為初診時數據。
1.1.3 暴露因素
病例組發生DNMT3a基因突變，對照組未發生DNMT3a基因突變。
1.1.4 結局指標
研究對象外周血象WBC、HGB、PLT水平。
1.1.5 排除標準
①重復發表或內容雷同但質量較差的文獻；②無法提取原始數據或者索取無果的文獻。
1.2 檢索策略
計算機檢索PubMed、ScienceDirect、EBSCO、Web of Science、CNKI、VIP和WanFang Data數據庫，輔以文獻追溯的方法，納入國內外公開發表的研究DNMT3a與AML患者初診時外周血象關系的病例-對照研究。檢索詞為DNMT3a和AML，采用主題詞與自由詞檢索相結合的方式。檢索年限均為從建庫至2012年12月30日。以PubMed為例，其具體檢索策略見框?1。
框1 ?PubMed檢索策略
acute myeloid leukemia DNMT3a variant OR mutation #1 AND #2 AND #3
1.3 資料提取
制定文獻資料提取表格，數據提取和整理由2名研究者獨立完成并交叉核對，如遇分歧，討論解決。若部分數據缺失，通過兩種方法解決：聯系文獻作者索要原始數據；運用Hozo等[18]所述方法進行統計學等價轉換推導。提取內容主要包括第一作者、地區、年份、樣本量、DNMT3a突變情況、外周血象水平等。
1.4 質量評價
采用Newcastle-Ottawa Scale（NOS）對病例-對照研究的質量評價標準[19]評價納入研究的方法學質量。
1.5 統計分析
Meta分析采用RevMan 5.2軟件。采用均數差（MD）及其95%可信區間（CI）為效應分析統計量，檢驗水準為α=0.05。首先對納入研究進行異質性檢驗，檢驗水平為α=0.10，同時使用I2判斷異質性的大小。若P＞0.10，I2＜50%，認為納入研究結果間無統計學異質性，采用固定效應模型進行Meta分析；反之若P≤0.10，I2≥50%，則提示納入研究結果間有統計學異質性，采用隨機效應模型進行Meta分析。發表偏倚通過繪制漏斗圖進行評價，漏斗圖不對稱或不完整則提示可能存在發表偏倚。
2 結果
2.1 文獻檢索結果
初檢出相關文獻69篇，經過逐層篩選，最終納入10篇文獻[7, 9-17]，共2 704例患者。文獻篩選流程及結果見圖 1。
圖1
文獻篩選流程及結果
2.2 納入研究的基本特征和方法學質量評價
納入文獻的基本特征見表 1，納入文獻的方法學質量評價結果見表 2。
表1
納入研究的基本特征（
表2
納入研究的方法學質量評價（分）
2.3 Meta分析結果
2.3.1 WBC水平
10個研究[7, 9-17]報告了WBC水平與DNMT3a突變的關系，共包含DNMT3a突變的原發初治AML患者559例，DNMT3a未突變的原發初治AML患者2 145例。隨機效應模型Meta分析結果顯示，DNMT3a突變組初診時WBC水平明顯高于DNMT3a未突變組，其差異有統計學意義[WMD=23.62，95%CI（14.93，32.32），P＜0.000 01]（圖 2）。
圖2
DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時WBC水平比較的Meta分析
2.3.2 HGB水平
6個研究[9-12, 15, 16]報告了HGB水平與DNMT3a突變的關系，共包含DNMT3a突變的原發初治AML患者357例，DNMT3a未突變的原發初治AML患者1 482例。隨機效應模型Meta分析結果顯示，DNMT3a突變組初診時HGB水平明顯高于DNMT3a未突變組，其差異有統計學意義[WMD=4.54，95%CI（0.85，8.24），P=0.02]（圖 3）。
圖3
DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時HGB水平比較的Meta分析
2.3.3 PLT水平
7個研究[9-12, 15-17]報告了PLT水平與DNMT3a突變的關系，共包含DNMT3a突變的原發初治AML患者453例，DNMT3a未突變的原發初治AML患者1 801例。固定效應模型Meta分析結果顯示，DNMT3a突變組初診時HGB水平明顯高于DNMT3a未突變組，其差異有統計學意義[WMD=18.75，95%CI（10.48，27.02），P＜0.000 01]（圖 4）。
圖4
DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時PLT水平比較的Meta分析
2.4 發表偏倚分析
基于WBC水平與DNMT3a突變關系的漏斗圖顯示各納入研究在漏斗兩側分布對稱性較差（圖 5），提示存在發表偏倚的可能性較大。
圖5
基于WBC水平與DNMT3a突變關系的漏斗圖
3 討論
AML是一組異質性惡性克隆性疾病，系造血干細胞或祖細胞突變引起的造血系統惡性腫瘤。傳統觀點認為，AML主要與細胞遺傳學和分子生物學異常所導致的兩大類基因改變有關：第一類是激活下游信號通路的基因改變，如STAT、PI3K、RAS-MAPK等；第二類是影響關鍵轉錄因子表達的基因改變。最近研究表明，AML的發生可能存在第三類基因改變——表觀遺傳學基因改變，如DNMT3a、TET2、IDH1/2、ASXL1、EZH2、MLL等[20, 21]。
2010年，Yamashita等[22]在74例白血病患者中發現3例患者發生了DNMT3a基因的R882精氨酸位點突變，該突變直接導致DNA甲基化水平下降50%以上。隨后，Ley等[7]應用高通量全基因組測序方法發現在AML患者中DNMT3a突變發生率高達22%，與預后不良有關，且多伴正常核型。DNMT3a突變多發生在R882精氨酸位點，突變形式多樣，包括無義突變、錯義突變、插入/缺失突變、移碼突變等。2011年，國內陳賽娟等[8]通過對1 185例患者的研究也得出類似結果。DNMT3a突變是AML的一個重要分子事件，DNMT3a突變與疾病發病明顯相關。
DNMT3a突變與AML患者初診時外周血象水平的關系，目前尚無定論[7, 9-17]。本研究采用Meta分析方法，納入國內外公開發表的相關文獻，從外周血象的WBC、HGB、PLT三個方面，分析比較了成人原發AML患者DNMT3a突變組與DNMT3a未突變組初診時的外周血象水平，比較研究結果顯示成人原發AML患者DNMT3a突變組初診時的外周血象水平較DNMT3a未突變組高，且差異有統計學意義（P＜0.05）。
本Meta分析結果表明，DNMT3a突變組初診時外周血象水平較高，即伴隨較高腫瘤負荷水平，提示DNMT3a突變可能有促進細胞增殖的作用。其原因可能是DNMT3a突變常與FLT3（Fms樣酪氨酸激酶3）突變相伴發生[13, 15, 23]，而FLT3可促進細胞增殖[24, 25]。FLT3是造血干細胞和造血祖細胞表面表達的一種重要的Ⅲ型酪氨酸激酶受體，在粒系和淋系細胞分化成熟中發揮重要作用[26, 27]。FLT3結合相應FLT3配體（Flt3 ligand）后可激活Ras/MAP、AKT和STAT5等下游信號通路來促進造血細胞生長發育[28, 29]。FLT3發生突變后可持續激活上述信號通路而導致旺盛造血。另一原因可能是，DNMT3a突變本身就可能具有促進細胞增殖功能。陳賽娟等[30]報道，DNMT3a突變伴隨較高的外周血水平現象，并研究了DNMT3a突變潛在的致白血病作用，他們發現過表達DNMT3a突變的小鼠32D細胞具有明顯的生長優勢，甚至可以不依賴生長因子生長。現有研究表明，DNMT3a突變提示預后不良[7, 9-17]，DNMT3a突變患者常伴隨較高的初診時外周血象水平，即較高的腫瘤負荷，而較高初診時腫瘤負荷也是AML預后不良的重要指標[31]。然而，DNMT3a突變組患者初診時伴隨較高的HGB和PLT水平，是否也意味著該組患者具有較低的貧血及出血風險？進而推測DNMT3a突變組預后較好呢？考慮到患者預后與初診時腫瘤負荷水平及治療后血象變化情況存在更為密切的關系，從總體上說，我們不能單從初診時DNMT3a突變組患者較高的HGB及PLT水平，就推測DNMT3a突變組患者在整個疾病過程中具有較低的貧血及出血風險。
綜上所述，本研究結果表明成人原發AML患者DNMT3a突變組初診時外周血象水平較DNMT3a未突變組高，這有助于我們更好地探索DNMT3a突變在AML發生發展中的作用。DNMT3a突變或可納入AML新的預后分層評價指標中，指導對AML進行分層治療。
