引用本文： 徐鋒, 范林林, 康霞, 劉洋洋, 韋海濤, 李麗. LINC00626通過JAK1/STAT3/KHSRP信號軸調控肺腺癌轉移的惡性進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(9): 646-656. doi: 10.7507/1671-6205.202306023 復制
肺癌是世界上病死率第一的惡性腫瘤[1]。肺腺癌是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中最常見的病理類型，發病率和病死率都很高。盡管手術、化療和分子靶向使肺腺癌治療取得較大進展，但肺癌預后仍不令人滿意[2]。由于肺腺癌有不同的治療結局和反應，故尋找診斷和治療的分子標志物尤為重要[3-4]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）的失調是所有癌癥中常見現象，已成為人類癌癥中關鍵調節因子[5]。LncRNA在細胞周期、增殖、遷移、凋亡、侵襲和轉移等進程中發揮重要作用[6-7]。LncRNA FAM83A-AS1可以促進肺腺癌細胞的遷移和侵襲和肺腺癌細胞系中的糖酵解。敲降FAM83A-AS1可以抑制腫瘤生長，抑制缺氧誘導因子-1α和糖酵解相關基因在體內的表達[8]。LncRNA RP11-10A14.5主要分布在肺癌細胞質中，可以促進肺腺癌細胞生長和轉移，并與臨床分期和不良生存結局相關[9]。LncRNA DARS-AS1是一種促癌基因，在肺腺癌中高表達，可通過抑制miR-188-5p增強肺腺癌的增殖、侵襲和遷移[10]。李靜等[4]通過對89例NSCLC患者肺癌組織和癌旁組織進行定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerasechain reaction，qPCR），發現LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC組織中高表達，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及吸煙史密切相關。因此，lncRNA不僅是癌癥早期診斷和精準預測的潛在生物標志物，也可能是新的分子治療靶點[11]。本研究經過數據庫及預實驗篩選得到目的基因LINC00626，位于1q24,2位置。經文獻檢索發現LINC00626在胃癌中過表達，且不斷升高與差預后相關。然而，LINC00626在肺腺癌發生發展過程中扮演的角色以及分子調控機制研究尚不清楚。JAK/STAT信號通路是許多細胞因子進行胞內、外信息傳導的主要通路，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥等多種生理過程[12]，還參與癌癥發病機制和進展[13]。KH型剪接調控蛋白（KH-type splicing regulatory protein，KHSRP）是一種多功能核酸結合蛋白，與多種細胞發展過程有關，包括細胞核中的剪接和細胞質中的mRNA定位和降解[14]。在結直腸癌中，KHSRP在原發性和轉移性的上皮和基質區室中表達均上調[15]。KHSRP可通過參與不同細胞過程（如遷移和對細胞應激的反應）的致癌蛋白分泌來促進血管生成細胞外環境。本研究分析長鏈非編碼RNA 626（long intergenic non-protein coding RNA 626，LINC00626）和KHSRP在肺腺癌組織和細胞中的表達水平，并深入研究LINC00626通過JAK1/STAT3/KHSRP信號軸，調控肺腺癌細胞轉移的惡性進展的分子機制。
1 材料與方法
1.1 細胞實驗
1.1.1 實驗細胞、主要試劑及儀器
人肺癌細胞系A549、H1299、H1975、H1437購自武漢普諾賽生命科技有限公司。人正常支氣管上皮細胞系16HBE購自寧波明舟生物科技有限公司。TRIzol試劑、細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、10%聚偏二氟乙烯膜購自美國Sigma Aldrich公司。HiScript?II逆轉錄酶試劑盒、通用型高特異性染料法定量PCR檢測試劑盒、RIPA緩沖液購自北京索萊寶公司。BCA蛋白質定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。Transwell小室購自美國Corning Incorporated公司。慢病毒試劑購自上海吉瑪制藥有限公司。RNA-蛋白質下拉試劑盒、RNA核質分離試劑盒和RNA熒光原位雜交實驗（RNA fluorescence in situ hybridization，FISH）試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。Nano Drop 2000c分光光度計購自美國賽默飛世爾科技公司。酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司。
1.1.2 細胞培養及轉染
將細胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，放置在5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養。取對數生長期的H1299細胞系，根據說明書，轉入在載體LV3上構建的LV3-NC和三個短發卡RNA序列的LV3（H1/GFP&Puro）-LINC00626-homo-994敲降慢病毒，依次命名為sh-NC組、sh-LINC00626#1組、sh-LINC00626#2組、sh-LINC00626#3組，H1437細胞系操作如上。取對數生長期的A549細胞系，轉入在克隆載體LV6上構建好的LV6-NC和LV6-LINC00626-homo過表達慢病毒，依次命名為Vector組、LINC00626組，H1975細胞系操作如上。取對數生長期的H1437細胞，轉入在敲降LINC00626慢病毒基礎上的KHSRP載體和在敲降LINC00626慢病毒基礎上的空白載體，分別命名為sh-LINC00626+KHSRP組和sh-LINC00626+Vector組。
1.1.3 qRT-PCR
使用TRIzol試劑提取總RNA，Nano Drop 2000c分光光度計測RNA的濃度和純度，然后進行反轉錄，使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒檢測各組中LINC00626、KHSRP mRNA的表達量。GAPDH和U6作為對照，2–ΔΔCt法進行分析，序列見表1。
表1
LINC00626的片段引物
1.1.4 CCK-8實驗
將sh-NC組、sh-LINC00626#1組以1×104個細胞/孔接種到96孔板中，培養24、48和72 h。采用CCK-8試劑盒在每個孔中加入10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h。最后用酶標儀在450 nm處測量吸光值。
1.1.5 Transwell小室實驗
采用Transwell小室（含/不含Matrigel膠）檢測細胞侵襲、遷移能力。將200 μL無血清培養基添加到上室，在下室中添加含有胎牛血清的培養基700 μL。孵育24 h（遷移）/48 h（侵襲）后，去除留在膜上細胞，并進行固定和染色。在倒置顯微鏡下以400倍率拍攝圖像。對5個隨機區域中的細胞進行計數，獲得遷移或侵襲細胞平均數。
1.1.6 蛋白質印跡實驗（Western blot）
采用RIPA緩沖液提取sh-NC組、sh-LINC00626#1組、sh-LINC00626+vector組、sh-LINC00626+KHSRP組中的總蛋白。BCA蛋白質定量試劑盒進行定量。通過SDS凝膠電泳將蛋白質分離，之后轉移到PVDF模中，在5%脫脂牛奶中室溫下封閉1 h，再與GAPDH抗體和一抗KHSRP 4°C下孵育過夜，使用TBST洗滌3遍，與二抗在室溫下放置1.5 h。使用ECL試劑盒化學發光。
1.2 病例標本試驗
收集河南大學淮河醫院胸外科手術切除且病理檢查確診為肺腺癌的144例癌組織標本和其癌旁組織標本。本研究經河南大學淮河醫院倫理委員會批準（HUSOM2020-250），所有參與者已簽署知情同意書。
1.3 裸鼠實驗
4～6周雄性裸鼠，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司。皮下荷瘤實驗：將32只老鼠隨機分為sh-NC組、sh-LINC00626組、Vector組、LINC00626組，每組8只。將sh-NC、sh-LINC00626轉染到H1437細胞，將Vector、LINC00626轉染到A549細胞。注射劑量均為5×106個細胞。每2 d測量1次腫瘤體積/體重。體積公式為：體積（mm3）=長×寬2×0.5。第21～30 d后處死小鼠。尾靜脈注射肺轉移模型實驗：將20只老鼠隨機分為sh-NC組、sh-LINC00626組、Vector組、LINC00626組，每組5只。注射濃度為1×106/mL，尾靜脈接種0.1 mL/只。第22～33 d后以頸椎脫臼法處死裸鼠，稱裸鼠體重，剖取肺，肉眼和解剖顯微鏡下同時計數各肺部的轉移病灶數。
1.4 RNA核質分離及FISH實驗檢測LINC00626、KHSRP的細胞分布
使用RNA核質分離試劑分離細胞核、質RNA。將細胞核、質RNA和總RNA經過純化和DNaseⅠ處理后進行反轉錄，用LINC00626引物進行qPCR檢測。根據以下公式：所占比例（%）=2（總RNA的Ct值–組分RNA的Ct值）×100%，判斷LINC00626在細胞核、質RNA內的分布比例。U6作為細胞核的內源性對照，GAPDH作為細胞質的內源性對照。另外，使用FISH試劑盒及熒光標記的LINC00626 FISH探針進行FISH實驗，采用激光共聚焦顯微鏡觀察KHSRP在細胞中的定位情況。
1.5 RNA下拉和質譜實驗
采用RNA-蛋白質下拉試劑盒拉下與LINC00626結合的所有蛋白。將bio-LINC00626和陰性對照（bio-NC）轉染到肺腺癌細胞并孵育24 h，預洗鏈霉親和素磁珠。將備好的細胞裂解液重懸收集磁珠，將上述反應體系在4℃條件下緩慢旋轉2 h，充分保證磁珠與細胞裂解產物充分結合。之后洗滌與洗脫RNA-蛋白復合物，然后進行銀染實驗。一部分通過質譜分析存RNA-蛋白復合物，一部分用Westernblot實驗檢測目的蛋白，驗證質譜分析的結果。
1.6 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較。計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗進行組間比較。采用Kaplan-Meier法和對數秩檢驗進行生存分析。采用雙側檢驗，檢驗校準α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 LINC00626在肺腺癌組織和細胞系中表達均顯著上調
qRT-PCR結果顯示，與正常組織相比，LINC00626在肺腺癌組織中表達顯著上調（P<0.001，圖1a）。與16HBE細胞相比，LINC00626在肺腺癌細胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中表達顯著上調（P<0.001，圖1b），故選用表達相對較低的A549、H1975和表達量相對較高的H1299、H1437細胞系進行后續細胞功能實驗，其中A549、H1975做過表達處理，H1299、H1437做敲降處理。
圖1
qRT-PCR檢測LINC00626在組織和細胞的表達
a. 在肺腺癌組織樣本中高表達；b. 在NSCLC細胞系中高表達。*
根據LINC00626在144例肺腺癌和癌旁組織中的表達量2–△△Ct表達值，把144例肺腺癌標本分成兩組，數值>中位數值1.484159視為顯著高表達組（n=72），數值<中位數值1.484159視為顯著低表達組（n=72），繪制受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，顯示在144例肺腺癌及癌旁組織總樣本中LINC00626的ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC）=0.6629［95%置信區間（confidential interval，CI）0.616 8～0.7090，P<0.0001，截斷值13.41，敏感性77.78%，特異性73.61%］；在72例顯著高表達的肺腺癌及癌旁組織樣本中LINC00626的AUC=0.7720（95%CI 0.6946～0.8494，P<0.0001，截斷值13.41、敏感性77.78%，特異性73.61%）；在72例高表達Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ期肺腺癌和癌旁組織中LINC00626的AUC=0.8810（95%CI 0.7855～0.9764，P=0.0005，截斷值22.31，敏感性68.57%，特異性100.00%）；在72例高表達有無淋巴結轉移肺腺癌和癌旁組織中LINC00626的AUC=0.9198（95%CI 0.8568～0.9826，P<0.0001，截斷值17.72，敏感性89.66%，特異性81.40%）。臨床病理信息見表2。
表2
LINC00626表達與144例肺腺癌患者臨床病理特征的相關性（例）
2.2 LINC00626促進體外肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力
qRT-PCR結果顯示sh-LINC00626#1組、sh-LINC00626#2組和sh-LINC00626#3組中LINC00626表達水平較sh-NC組顯著降低（P<0.001，圖2a），sh-LINC00626#1組效果最明顯，因此采用sh-LINC00626#1組進行后續實驗。與Vector組相比，LINC00626組表達水平明顯增加（P<0.001，圖2b）。與sh-NC組相比，sh-LINC00626組細胞增殖遷移和侵襲能力明顯降低，過表達則反之（P<0.001，圖2c～d）。以上結果表明LINC00626可促進體外肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。
圖2
LINC00626促進肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力
a、b. qRT-PCR實驗檢測敲降組和過表達組轉染效率；c. CCK-8實驗檢測敲降或過表達LINC00626對肺癌細胞增殖能力的影響；d. Transwell小室檢測敲降或過表達LINC00626對肺癌細胞遷移、侵襲能力的影響。*
2.3 LINC00626抑制裸鼠體內肺腺癌細胞生長、遷移和侵襲能力
皮下荷瘤實驗中，與sh-NC組相比，sh-LINC00626組中腫瘤體積和重量顯著減少（P<0.01，圖3a、b）。與Vector組比，LINC00626組中腫瘤體積和重量顯著增加（P<0.01，圖3c、d）。與sh-NC和Vector組相比，敲降LINC00626組和過表達LINC00626組細胞增殖率和增殖指數明顯下降或上升（P<0.01，圖3e～f）。尾靜脈注射肺轉移模型實驗中與sh-NC和Vector組相比，敲降LINC00626和過表達LINC00626均可顯著抑制或促進肺部淋巴結轉移數量（P<0.01，圖3g～i）。以上結果表明LINC00626可促進裸鼠體內肺腺癌細胞生長、遷移和侵襲能力。
圖3
LINC00626促進裸鼠體內肺腺癌細胞生長、遷移和侵襲能力
a. 第21 d時處死裸鼠和剖離瘤體；b. 統計腫瘤體積和重量的量化圖；c. 第30 d時處死裸鼠和剖離瘤體；d. 統計瘤體積和體重的量化圖；e、f. Ki-67染色結果和增殖指數；g. 裸鼠尾靜脈注射肺轉移模型肉眼下肺組織轉移結節圖；h、i. 裸鼠尾靜脈注射顯微鏡下肺組織轉移結節病理圖和結節計數（HE×200）。*
2.4 LINC00626與KHSRP位于細胞核內，且LINC00626能夠與KHSRP直接結合
將H1299和H1437細胞進行RNA核質分離后行qPCR檢測，結果顯示LINC00626主要定位于肺腺癌細胞核內（P<0.01，圖4a、b）。FISH實驗顯示HKSRP同樣主要定位于細胞核內（圖4c）。采用RNA下拉實驗拉下與LINC00626結合的所有蛋白，然后將這些的蛋白進行質譜分析，列舉出排在前20的差異蛋白（表3）。RNA下拉銀染實驗顯示，LINC00626所結合的蛋白在70 kDa處存在明顯表達（圖4d）。接著采用蛋白質印跡實驗再次驗證了LINC00626能夠與KHSRP相互結合在一起（圖4e）。根據上述機制研究結果，可以推測得出LINC00626與KHBSRP作用的分子機制圖（圖4f）。
圖4
LINC00626直接與KHSRP蛋白互作用
a、b. 核質分離實驗表明LINC00626主要位于細胞核內；c. FISH實驗表明KHSRP主要位于細胞核內；d. 銀染實驗驗證LINC00626能夠與下拉的KHSRP結合；e. 蛋白質印跡實驗驗證KHSRP確實與LINC00626結合；f. LINC00626與KHSRP的分子作用機制圖。
表3
質譜分析與LINC00626互作的蛋白（前20名）
2.5 KHSRP過表達逆轉敲降LINC00626對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響
qRT-PCR結果顯示，與正常組織相比，KHSRP在肺腺癌組織中表達上調（P<0.001，圖5a）；與16HBE細胞相比，KHSRP在肺腺癌細胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中均表達上調（P<0.001，圖5b）。隨后，將KHSRP加入sh-LINC00626中共轉染（圖5c、d），進行了細胞功能恢復試驗。CCK-8、Transwell小室遷移/侵襲和劃痕實驗均表明，與sh-LINC00626+Vector組相比，sh-LINC00626組+KHSRP組中細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著增加（圖5e～f）。KHSRP上調可消除敲降LINC00626對細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。以上結果表明LINC00626和KHSRP在肺腺癌中表達一致，且LINC00626對KHSRP具有正向調控作用。
圖5
KHSRP過表達可逆轉敲降LINC00626對肺腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響
a. KHSRP在144例肺腺癌組織中表達顯著上調；b. HKSRP在肺癌細胞株中表達顯著上調； c、d. qRT-PCR和蛋白質印跡實驗KHSRP與sh-LINC00626共轉染的效果；e. CCK-8實驗檢測敲降LINC00626與KHSRP共轉染后對肺腺癌細胞增殖能力的影響；f. Transwell實驗檢測敲降LINC00626與KHSRP共轉染后對肺腺癌細胞遷移、侵襲能力的影響。*
2.6 LINC00626在肺腺癌中對JAK/STAT信號通路的調控作用
PCR、qRT-PCR實驗結果顯示，與sh-NC組相比，sh-LINC00626組中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表達降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表達降低不明顯（圖6a～c）；與Vector組相比，LINC00626組JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表達水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表達升高不明顯（圖6d～f）。以上結果表明在肺腺癌中LINC00626對JAK1/STAT3蛋白具有正向調控作用。
圖6
PCR、qRT-PCR 檢驗LINC00626在肺腺癌中與JAK1/STAT3呈正相關
a～c. PCR和qPCR檢測LINC00626與敲降組JAK/STAT信號通路相關蛋白mRNA水平表達的關系：d～f. PCR和qPCR檢測LINC00626與過表達組JAK/STAT信號通路相關蛋白mRNA水平表達的關系。*
2.7 KHSRP在肺腺癌中對JAK/STAT信號通路的調控作用
PCR和qRT-PCR實驗結果顯示，與sh-NC組相比，sh-LINC00626組中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA水平表達降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA水平降低不明顯（圖7a～c）；與Vector 組相比，LINC00626 組JAK1、p-JAK1和STAT3表達水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT 5 mRNA升高不明顯（圖7d～g）。以上結果顯示肺腺癌中KHSRP蛋白對JAK1/STAT3具有正向調控作用。
圖7
PCR、qPCR檢測KHSRP在肺腺癌中與JAK1/STAT3呈正相關
a～c. PCR和qPCR檢測KHSRP與敲降組JAK/STAT相關蛋白在H1437細胞系中mRNA水平表達的關系；d～f. PCR和qPCR檢測KHSRP與過表達組JAK/STAT相關蛋白在A549細胞系中mRNA水平表達的關系。*
3 討論
肺腺癌細胞惡性增殖和遷移與患者不良預后有關[16]。LncRNA異常表達可通過調節細胞增殖、遷移和侵襲來發揮腫瘤癌基因或抑制因子的作用[17-18]，許多lncRNA已被證實在肺腺癌中充當競爭性內源性RNAs而發揮關鍵作用[19-20]。Song等[21]發現lncRNA LINC01535在宮頸癌中高表達，并通過結合微RNA-214，從而上調EZH2蛋白表達。本研究首次發現LINC00626在肺腺癌組織和細胞中高表達，并促進肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。首先利用在線網站發現LINC00626在NSCLC細胞中呈高表達，隨后通過qRT-PCR實驗發現LINC00626在收集的144例新鮮肺腺癌組織標本和NSCLC細胞系中表達均上調，體外細胞功能實驗發現敲降LINC00626基因表達后可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，過表達LINC00626則有相反的效果。
JAK/STAT信號通路是由表皮生長因子受體JAK激活的細胞信號通路，主要包括JAK家族和STAT家族。JAK/STAT信號通路的激活/失活與多種腫瘤的發生有關。JAK/STAT信號通路廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥等多種生理過程[22]。JAK/STAT信號通路在多種疾病的中起重要調節作用，例如Zhao等[23]發現LncRNAFEZF1-AS1可以通過激活JAK/STAT3信號通路刺激卵巢癌的發生和發展聯合抑制JAK1/STAT3/PD-L1信號通路，有望為去除抵抗性前列腺癌的免疫治療提供新的思路和靶點[24]。宮頸癌細胞中Aloperine抗腫瘤活性與IL-6/JAK1/STAT3反饋回路的抑制有關[25]。本研究驗證了在肺腺癌中LINC00626能夠通過調節JAK/STAT信號通路中的關鍵基因，從而促進肺腺癌轉移的惡性進程。
KHSRP在1996年由Levens和Black實驗室獨立發現，為遠上游元件結合蛋白家族的新成員[26]。KHSRP 是一種多功能的單鏈核酸（DNA或RNA）結合蛋白，位于細胞核和細胞質中。KHSRP結構分三部分：氨基酸的末端結構域、含有4個KH基序的中心結構域以及羧基的末端結構域[27]。這3個高度保守的區域由可變連接區域連接，中心的KH區域是最具特征的區域。除了直接與核酸結合外，KH1和KH4結構域外還有一個β-折疊結構，可與其他蛋白相互作用，KH2和KH3的結構域有負調控結合位點[28]。KHSRP基因在調控RNA剪接、RNA轉運、RNA編輯以及mRNA穩定和降解中發揮重要作用[29]。目前研究表明KHSRP在胰腺癌[14]、NSCLC[30]、大腸癌[15]等腫瘤中的蛋白表達都與腫瘤的發生發展進程密切相關。本研究確定了LINC00626能夠與KHSRP互作且呈正相關，通過激活JAK1/STATA3促進肺腺癌細胞轉移的惡性進程。
綜上所述，LINC00626在肺腺癌中表達上調，并與肺腺癌患者轉移的惡性進程密切相關。LINC00626通過調節JAK1/STAT3/HKSRP軸，促進肺腺癌細胞生長和運動、侵襲、轉移能力。本研究為肺腺癌的臨床診療提供了一種新的分子標志物和潛在的治療靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺癌是世界上病死率第一的惡性腫瘤[1]。肺腺癌是非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中最常見的病理類型，發病率和病死率都很高。盡管手術、化療和分子靶向使肺腺癌治療取得較大進展，但肺癌預后仍不令人滿意[2]。由于肺腺癌有不同的治療結局和反應，故尋找診斷和治療的分子標志物尤為重要[3-4]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）的失調是所有癌癥中常見現象，已成為人類癌癥中關鍵調節因子[5]。LncRNA在細胞周期、增殖、遷移、凋亡、侵襲和轉移等進程中發揮重要作用[6-7]。LncRNA FAM83A-AS1可以促進肺腺癌細胞的遷移和侵襲和肺腺癌細胞系中的糖酵解。敲降FAM83A-AS1可以抑制腫瘤生長，抑制缺氧誘導因子-1α和糖酵解相關基因在體內的表達[8]。LncRNA RP11-10A14.5主要分布在肺癌細胞質中，可以促進肺腺癌細胞生長和轉移，并與臨床分期和不良生存結局相關[9]。LncRNA DARS-AS1是一種促癌基因，在肺腺癌中高表達，可通過抑制miR-188-5p增強肺腺癌的增殖、侵襲和遷移[10]。李靜等[4]通過對89例NSCLC患者肺癌組織和癌旁組織進行定量聚合酶鏈式反應（quantitative polymerasechain reaction，qPCR），發現LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC組織中高表達，且與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及吸煙史密切相關。因此，lncRNA不僅是癌癥早期診斷和精準預測的潛在生物標志物，也可能是新的分子治療靶點[11]。本研究經過數據庫及預實驗篩選得到目的基因LINC00626，位于1q24,2位置。經文獻檢索發現LINC00626在胃癌中過表達，且不斷升高與差預后相關。然而，LINC00626在肺腺癌發生發展過程中扮演的角色以及分子調控機制研究尚不清楚。JAK/STAT信號通路是許多細胞因子進行胞內、外信息傳導的主要通路，廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥等多種生理過程[12]，還參與癌癥發病機制和進展[13]。KH型剪接調控蛋白（KH-type splicing regulatory protein，KHSRP）是一種多功能核酸結合蛋白，與多種細胞發展過程有關，包括細胞核中的剪接和細胞質中的mRNA定位和降解[14]。在結直腸癌中，KHSRP在原發性和轉移性的上皮和基質區室中表達均上調[15]。KHSRP可通過參與不同細胞過程（如遷移和對細胞應激的反應）的致癌蛋白分泌來促進血管生成細胞外環境。本研究分析長鏈非編碼RNA 626（long intergenic non-protein coding RNA 626，LINC00626）和KHSRP在肺腺癌組織和細胞中的表達水平，并深入研究LINC00626通過JAK1/STAT3/KHSRP信號軸，調控肺腺癌細胞轉移的惡性進展的分子機制。
1 材料與方法
1.1 細胞實驗
1.1.1 實驗細胞、主要試劑及儀器
人肺癌細胞系A549、H1299、H1975、H1437購自武漢普諾賽生命科技有限公司。人正常支氣管上皮細胞系16HBE購自寧波明舟生物科技有限公司。TRIzol試劑、細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒、10%聚偏二氟乙烯膜購自美國Sigma Aldrich公司。HiScript?II逆轉錄酶試劑盒、通用型高特異性染料法定量PCR檢測試劑盒、RIPA緩沖液購自北京索萊寶公司。BCA蛋白質定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。Transwell小室購自美國Corning Incorporated公司。慢病毒試劑購自上海吉瑪制藥有限公司。RNA-蛋白質下拉試劑盒、RNA核質分離試劑盒和RNA熒光原位雜交實驗（RNA fluorescence in situ hybridization，FISH）試劑盒購自美國賽默飛世爾科技公司。流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。Nano Drop 2000c分光光度計購自美國賽默飛世爾科技公司。酶標儀購自北京普天新橋技術有限公司。
1.1.2 細胞培養及轉染
將細胞在含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基，放置在5%CO2、37℃的細胞培養箱中培養。取對數生長期的H1299細胞系，根據說明書，轉入在載體LV3上構建的LV3-NC和三個短發卡RNA序列的LV3（H1/GFP&Puro）-LINC00626-homo-994敲降慢病毒，依次命名為sh-NC組、sh-LINC00626#1組、sh-LINC00626#2組、sh-LINC00626#3組，H1437細胞系操作如上。取對數生長期的A549細胞系，轉入在克隆載體LV6上構建好的LV6-NC和LV6-LINC00626-homo過表達慢病毒，依次命名為Vector組、LINC00626組，H1975細胞系操作如上。取對數生長期的H1437細胞，轉入在敲降LINC00626慢病毒基礎上的KHSRP載體和在敲降LINC00626慢病毒基礎上的空白載體，分別命名為sh-LINC00626+KHSRP組和sh-LINC00626+Vector組。
1.1.3 qRT-PCR
使用TRIzol試劑提取總RNA，Nano Drop 2000c分光光度計測RNA的濃度和純度，然后進行反轉錄，使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒檢測各組中LINC00626、KHSRP mRNA的表達量。GAPDH和U6作為對照，2–ΔΔCt法進行分析，序列見表1。
表1
LINC00626的片段引物
1.1.4 CCK-8實驗
將sh-NC組、sh-LINC00626#1組以1×104個細胞/孔接種到96孔板中，培養24、48和72 h。采用CCK-8試劑盒在每個孔中加入10 μL的CCK-8溶液，孵育2 h。最后用酶標儀在450 nm處測量吸光值。
1.1.5 Transwell小室實驗
采用Transwell小室（含/不含Matrigel膠）檢測細胞侵襲、遷移能力。將200 μL無血清培養基添加到上室，在下室中添加含有胎牛血清的培養基700 μL。孵育24 h（遷移）/48 h（侵襲）后，去除留在膜上細胞，并進行固定和染色。在倒置顯微鏡下以400倍率拍攝圖像。對5個隨機區域中的細胞進行計數，獲得遷移或侵襲細胞平均數。
1.1.6 蛋白質印跡實驗（Western blot）
采用RIPA緩沖液提取sh-NC組、sh-LINC00626#1組、sh-LINC00626+vector組、sh-LINC00626+KHSRP組中的總蛋白。BCA蛋白質定量試劑盒進行定量。通過SDS凝膠電泳將蛋白質分離，之后轉移到PVDF模中，在5%脫脂牛奶中室溫下封閉1 h，再與GAPDH抗體和一抗KHSRP 4°C下孵育過夜，使用TBST洗滌3遍，與二抗在室溫下放置1.5 h。使用ECL試劑盒化學發光。
1.2 病例標本試驗
收集河南大學淮河醫院胸外科手術切除且病理檢查確診為肺腺癌的144例癌組織標本和其癌旁組織標本。本研究經河南大學淮河醫院倫理委員會批準（HUSOM2020-250），所有參與者已簽署知情同意書。
1.3 裸鼠實驗
4～6周雄性裸鼠，購自北京維通利華實驗動物科技有限公司。皮下荷瘤實驗：將32只老鼠隨機分為sh-NC組、sh-LINC00626組、Vector組、LINC00626組，每組8只。將sh-NC、sh-LINC00626轉染到H1437細胞，將Vector、LINC00626轉染到A549細胞。注射劑量均為5×106個細胞。每2 d測量1次腫瘤體積/體重。體積公式為：體積（mm3）=長×寬2×0.5。第21～30 d后處死小鼠。尾靜脈注射肺轉移模型實驗：將20只老鼠隨機分為sh-NC組、sh-LINC00626組、Vector組、LINC00626組，每組5只。注射濃度為1×106/mL，尾靜脈接種0.1 mL/只。第22～33 d后以頸椎脫臼法處死裸鼠，稱裸鼠體重，剖取肺，肉眼和解剖顯微鏡下同時計數各肺部的轉移病灶數。
1.4 RNA核質分離及FISH實驗檢測LINC00626、KHSRP的細胞分布
使用RNA核質分離試劑分離細胞核、質RNA。將細胞核、質RNA和總RNA經過純化和DNaseⅠ處理后進行反轉錄，用LINC00626引物進行qPCR檢測。根據以下公式：所占比例（%）=2（總RNA的Ct值–組分RNA的Ct值）×100%，判斷LINC00626在細胞核、質RNA內的分布比例。U6作為細胞核的內源性對照，GAPDH作為細胞質的內源性對照。另外，使用FISH試劑盒及熒光標記的LINC00626 FISH探針進行FISH實驗，采用激光共聚焦顯微鏡觀察KHSRP在細胞中的定位情況。
1.5 RNA下拉和質譜實驗
采用RNA-蛋白質下拉試劑盒拉下與LINC00626結合的所有蛋白。將bio-LINC00626和陰性對照（bio-NC）轉染到肺腺癌細胞并孵育24 h，預洗鏈霉親和素磁珠。將備好的細胞裂解液重懸收集磁珠，將上述反應體系在4℃條件下緩慢旋轉2 h，充分保證磁珠與細胞裂解產物充分結合。之后洗滌與洗脫RNA-蛋白復合物，然后進行銀染實驗。一部分通過質譜分析存RNA-蛋白復合物，一部分用Westernblot實驗檢測目的蛋白，驗證質譜分析的結果。
1.6 統計學方法
采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析（ANOVA）進行組間比較。計數資料以例（%）表示，采用χ2檢驗進行組間比較。采用Kaplan-Meier法和對數秩檢驗進行生存分析。采用雙側檢驗，檢驗校準α=0.05。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 LINC00626在肺腺癌組織和細胞系中表達均顯著上調
qRT-PCR結果顯示，與正常組織相比，LINC00626在肺腺癌組織中表達顯著上調（P<0.001，圖1a）。與16HBE細胞相比，LINC00626在肺腺癌細胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中表達顯著上調（P<0.001，圖1b），故選用表達相對較低的A549、H1975和表達量相對較高的H1299、H1437細胞系進行后續細胞功能實驗，其中A549、H1975做過表達處理，H1299、H1437做敲降處理。
圖1
qRT-PCR檢測LINC00626在組織和細胞的表達
a. 在肺腺癌組織樣本中高表達；b. 在NSCLC細胞系中高表達。*
根據LINC00626在144例肺腺癌和癌旁組織中的表達量2–△△Ct表達值，把144例肺腺癌標本分成兩組，數值>中位數值1.484159視為顯著高表達組（n=72），數值<中位數值1.484159視為顯著低表達組（n=72），繪制受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線，顯示在144例肺腺癌及癌旁組織總樣本中LINC00626的ROC曲線下面積（area under ROC curve，AUC）=0.6629［95%置信區間（confidential interval，CI）0.616 8～0.7090，P<0.0001，截斷值13.41，敏感性77.78%，特異性73.61%］；在72例顯著高表達的肺腺癌及癌旁組織樣本中LINC00626的AUC=0.7720（95%CI 0.6946～0.8494，P<0.0001，截斷值13.41、敏感性77.78%，特異性73.61%）；在72例高表達Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ期肺腺癌和癌旁組織中LINC00626的AUC=0.8810（95%CI 0.7855～0.9764，P=0.0005，截斷值22.31，敏感性68.57%，特異性100.00%）；在72例高表達有無淋巴結轉移肺腺癌和癌旁組織中LINC00626的AUC=0.9198（95%CI 0.8568～0.9826，P<0.0001，截斷值17.72，敏感性89.66%，特異性81.40%）。臨床病理信息見表2。
表2
LINC00626表達與144例肺腺癌患者臨床病理特征的相關性（例）
2.2 LINC00626促進體外肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力
qRT-PCR結果顯示sh-LINC00626#1組、sh-LINC00626#2組和sh-LINC00626#3組中LINC00626表達水平較sh-NC組顯著降低（P<0.001，圖2a），sh-LINC00626#1組效果最明顯，因此采用sh-LINC00626#1組進行后續實驗。與Vector組相比，LINC00626組表達水平明顯增加（P<0.001，圖2b）。與sh-NC組相比，sh-LINC00626組細胞增殖遷移和侵襲能力明顯降低，過表達則反之（P<0.001，圖2c～d）。以上結果表明LINC00626可促進體外肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲能力。
圖2
LINC00626促進肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力
a、b. qRT-PCR實驗檢測敲降組和過表達組轉染效率；c. CCK-8實驗檢測敲降或過表達LINC00626對肺癌細胞增殖能力的影響；d. Transwell小室檢測敲降或過表達LINC00626對肺癌細胞遷移、侵襲能力的影響。*
2.3 LINC00626抑制裸鼠體內肺腺癌細胞生長、遷移和侵襲能力
皮下荷瘤實驗中，與sh-NC組相比，sh-LINC00626組中腫瘤體積和重量顯著減少（P<0.01，圖3a、b）。與Vector組比，LINC00626組中腫瘤體積和重量顯著增加（P<0.01，圖3c、d）。與sh-NC和Vector組相比，敲降LINC00626組和過表達LINC00626組細胞增殖率和增殖指數明顯下降或上升（P<0.01，圖3e～f）。尾靜脈注射肺轉移模型實驗中與sh-NC和Vector組相比，敲降LINC00626和過表達LINC00626均可顯著抑制或促進肺部淋巴結轉移數量（P<0.01，圖3g～i）。以上結果表明LINC00626可促進裸鼠體內肺腺癌細胞生長、遷移和侵襲能力。
圖3
LINC00626促進裸鼠體內肺腺癌細胞生長、遷移和侵襲能力
a. 第21 d時處死裸鼠和剖離瘤體；b. 統計腫瘤體積和重量的量化圖；c. 第30 d時處死裸鼠和剖離瘤體；d. 統計瘤體積和體重的量化圖；e、f. Ki-67染色結果和增殖指數；g. 裸鼠尾靜脈注射肺轉移模型肉眼下肺組織轉移結節圖；h、i. 裸鼠尾靜脈注射顯微鏡下肺組織轉移結節病理圖和結節計數（HE×200）。*
2.4 LINC00626與KHSRP位于細胞核內，且LINC00626能夠與KHSRP直接結合
將H1299和H1437細胞進行RNA核質分離后行qPCR檢測，結果顯示LINC00626主要定位于肺腺癌細胞核內（P<0.01，圖4a、b）。FISH實驗顯示HKSRP同樣主要定位于細胞核內（圖4c）。采用RNA下拉實驗拉下與LINC00626結合的所有蛋白，然后將這些的蛋白進行質譜分析，列舉出排在前20的差異蛋白（表3）。RNA下拉銀染實驗顯示，LINC00626所結合的蛋白在70 kDa處存在明顯表達（圖4d）。接著采用蛋白質印跡實驗再次驗證了LINC00626能夠與KHSRP相互結合在一起（圖4e）。根據上述機制研究結果，可以推測得出LINC00626與KHBSRP作用的分子機制圖（圖4f）。
圖4
LINC00626直接與KHSRP蛋白互作用
a、b. 核質分離實驗表明LINC00626主要位于細胞核內；c. FISH實驗表明KHSRP主要位于細胞核內；d. 銀染實驗驗證LINC00626能夠與下拉的KHSRP結合；e. 蛋白質印跡實驗驗證KHSRP確實與LINC00626結合；f. LINC00626與KHSRP的分子作用機制圖。
表3
質譜分析與LINC00626互作的蛋白（前20名）
2.5 KHSRP過表達逆轉敲降LINC00626對肺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響
qRT-PCR結果顯示，與正常組織相比，KHSRP在肺腺癌組織中表達上調（P<0.001，圖5a）；與16HBE細胞相比，KHSRP在肺腺癌細胞系（A549、H1299、H1975和H1437）中均表達上調（P<0.001，圖5b）。隨后，將KHSRP加入sh-LINC00626中共轉染（圖5c、d），進行了細胞功能恢復試驗。CCK-8、Transwell小室遷移/侵襲和劃痕實驗均表明，與sh-LINC00626+Vector組相比，sh-LINC00626組+KHSRP組中細胞增殖、遷移和侵襲能力顯著增加（圖5e～f）。KHSRP上調可消除敲降LINC00626對細胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。以上結果表明LINC00626和KHSRP在肺腺癌中表達一致，且LINC00626對KHSRP具有正向調控作用。
圖5
KHSRP過表達可逆轉敲降LINC00626對肺腺癌細胞增殖、遷移、侵襲能力的影響
a. KHSRP在144例肺腺癌組織中表達顯著上調；b. HKSRP在肺癌細胞株中表達顯著上調； c、d. qRT-PCR和蛋白質印跡實驗KHSRP與sh-LINC00626共轉染的效果；e. CCK-8實驗檢測敲降LINC00626與KHSRP共轉染后對肺腺癌細胞增殖能力的影響；f. Transwell實驗檢測敲降LINC00626與KHSRP共轉染后對肺腺癌細胞遷移、侵襲能力的影響。*
2.6 LINC00626在肺腺癌中對JAK/STAT信號通路的調控作用
PCR、qRT-PCR實驗結果顯示，與sh-NC組相比，sh-LINC00626組中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表達降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表達降低不明顯（圖6a～c）；與Vector組相比，LINC00626組JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA表達水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA表達升高不明顯（圖6d～f）。以上結果表明在肺腺癌中LINC00626對JAK1/STAT3蛋白具有正向調控作用。
圖6
PCR、qRT-PCR 檢驗LINC00626在肺腺癌中與JAK1/STAT3呈正相關
a～c. PCR和qPCR檢測LINC00626與敲降組JAK/STAT信號通路相關蛋白mRNA水平表達的關系：d～f. PCR和qPCR檢測LINC00626與過表達組JAK/STAT信號通路相關蛋白mRNA水平表達的關系。*
2.7 KHSRP在肺腺癌中對JAK/STAT信號通路的調控作用
PCR和qRT-PCR實驗結果顯示，與sh-NC組相比，sh-LINC00626組中JAK1、p-JAK1和STAT3 mRNA水平表達降低，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT5 mRNA水平降低不明顯（圖7a～c）；與Vector 組相比，LINC00626 組JAK1、p-JAK1和STAT3表達水平升高，JAK2、p-JAK2、STAT1、STAT2和STAT 5 mRNA升高不明顯（圖7d～g）。以上結果顯示肺腺癌中KHSRP蛋白對JAK1/STAT3具有正向調控作用。
圖7
PCR、qPCR檢測KHSRP在肺腺癌中與JAK1/STAT3呈正相關
a～c. PCR和qPCR檢測KHSRP與敲降組JAK/STAT相關蛋白在H1437細胞系中mRNA水平表達的關系；d～f. PCR和qPCR檢測KHSRP與過表達組JAK/STAT相關蛋白在A549細胞系中mRNA水平表達的關系。*
3 討論
肺腺癌細胞惡性增殖和遷移與患者不良預后有關[16]。LncRNA異常表達可通過調節細胞增殖、遷移和侵襲來發揮腫瘤癌基因或抑制因子的作用[17-18]，許多lncRNA已被證實在肺腺癌中充當競爭性內源性RNAs而發揮關鍵作用[19-20]。Song等[21]發現lncRNA LINC01535在宮頸癌中高表達，并通過結合微RNA-214，從而上調EZH2蛋白表達。本研究首次發現LINC00626在肺腺癌組織和細胞中高表達，并促進肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。首先利用在線網站發現LINC00626在NSCLC細胞中呈高表達，隨后通過qRT-PCR實驗發現LINC00626在收集的144例新鮮肺腺癌組織標本和NSCLC細胞系中表達均上調，體外細胞功能實驗發現敲降LINC00626基因表達后可抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，過表達LINC00626則有相反的效果。
JAK/STAT信號通路是由表皮生長因子受體JAK激活的細胞信號通路，主要包括JAK家族和STAT家族。JAK/STAT信號通路的激活/失活與多種腫瘤的發生有關。JAK/STAT信號通路廣泛參與細胞增殖、分化、凋亡和炎癥等多種生理過程[22]。JAK/STAT信號通路在多種疾病的中起重要調節作用，例如Zhao等[23]發現LncRNAFEZF1-AS1可以通過激活JAK/STAT3信號通路刺激卵巢癌的發生和發展聯合抑制JAK1/STAT3/PD-L1信號通路，有望為去除抵抗性前列腺癌的免疫治療提供新的思路和靶點[24]。宮頸癌細胞中Aloperine抗腫瘤活性與IL-6/JAK1/STAT3反饋回路的抑制有關[25]。本研究驗證了在肺腺癌中LINC00626能夠通過調節JAK/STAT信號通路中的關鍵基因，從而促進肺腺癌轉移的惡性進程。
KHSRP在1996年由Levens和Black實驗室獨立發現，為遠上游元件結合蛋白家族的新成員[26]。KHSRP 是一種多功能的單鏈核酸（DNA或RNA）結合蛋白，位于細胞核和細胞質中。KHSRP結構分三部分：氨基酸的末端結構域、含有4個KH基序的中心結構域以及羧基的末端結構域[27]。這3個高度保守的區域由可變連接區域連接，中心的KH區域是最具特征的區域。除了直接與核酸結合外，KH1和KH4結構域外還有一個β-折疊結構，可與其他蛋白相互作用，KH2和KH3的結構域有負調控結合位點[28]。KHSRP基因在調控RNA剪接、RNA轉運、RNA編輯以及mRNA穩定和降解中發揮重要作用[29]。目前研究表明KHSRP在胰腺癌[14]、NSCLC[30]、大腸癌[15]等腫瘤中的蛋白表達都與腫瘤的發生發展進程密切相關。本研究確定了LINC00626能夠與KHSRP互作且呈正相關，通過激活JAK1/STATA3促進肺腺癌細胞轉移的惡性進程。
綜上所述，LINC00626在肺腺癌中表達上調，并與肺腺癌患者轉移的惡性進程密切相關。LINC00626通過調節JAK1/STAT3/HKSRP軸，促進肺腺癌細胞生長和運動、侵襲、轉移能力。本研究為肺腺癌的臨床診療提供了一種新的分子標志物和潛在的治療靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
