引用本文： 趙哲, 穆培娟, 張冬. SAPCD2對肺腺癌A549細胞生物學功能的影響及機制研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(7): 506-514. doi: 10.7507/1671-6205.202305038 復制
肺癌發病率逐年上升，在惡性腫瘤病死率排名中位列第一，是罹患癌癥導致患者死亡的主要原因之一[1]。2022年中國新增肺癌病例數約87萬例，新增由于肺癌死亡病例數約76萬例，肺癌已然成為危害人民身體健康，惡化家庭經濟的常見癌癥[2]。肺癌發病率、患病率及死亡率隨著年齡的增加呈現上升趨勢，而且男性均高于女性[1, 3]。肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大組織學亞型，其中非小細胞肺癌約占85%[4]。非小細胞肺癌最常見和最致命的亞型是肺腺癌。由于肺癌患者在初期癥狀易與普通肺部疾病混淆，多數患者初診時已處于晚期，5年生存率僅約10%。目前早期篩查、手術治療、放化療等相關措施都一定程度上緩解了患者部分并發癥[5]，提高了生活質量，一定程度上延長了患者的壽命，但目前常用的治療手段所覆蓋的肺癌種類少，且手術治療針對肺癌晚期患者不能根治，放化療不良反應較大且針對性弱[6]。肺癌一旦發生全身轉移或治療藥物出現耐受等導致效果變差的情況后，患者的治療將陷入兩難的境地，多數患者在晚期只能對癥維持治療[7]。SAPCD2是高度保守且在胚胎組織中高度表達的基因，與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關，可通過多種信號通路促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并與腫瘤耐藥相關，而在肺癌中少有報道[8]。本研究探討SAPCD2在肺腺癌組織和細胞中的表達、生物學特性及作用機制，為進一步找尋新的篩查、預后標志物以及肺腺癌的治療靶點奠定臨床實際應用的理論基礎。
1 資料與方法
1.1 材料
肺腺癌細胞HCC827、H1650、SK-MES-1、A549及人正常肺上皮細胞BEAS-2S（中國科學院干細胞庫），0.25%胰酶、RPMI-1640培養基（Hyclone公司），胎牛血清（GIBCO公司），TRIzol試劑（Ambion公司），Lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（康為世紀有限公司），實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒SYBR Premix Ex Taq（BIO-RAD公司），Transwell小室、BCA試劑盒、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、SAPCD2兔抗人多克隆抗體、Caspase-3抗體、NF2抗體、ki-67抗體、P-MST1抗體、P-LATS1抗體、P-YAP抗體、IGF-1抗體、羊抗兔IgG二抗（美國Abcam公司）等。
1.2 方法
1.2.1 癌癥基因圖譜
從生信之家官網（
1.2.2 細胞培養
將肺癌細胞系（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和人正常肺上皮細胞（BESA-2B）培養在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱，視培養基性狀決定是否換液，細胞長滿瓶底80%左右的面積時可以傳代，取對數生長期且狀態良好的細胞進行實驗。
1.2.3 細胞株篩、轉染及分組
使用qRT-PCR和免疫印跡（Western blot）檢測肺癌細胞（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和BEAS-2B細胞中SAPCD2 mRNA和蛋白表達水平，選取表達量較高的細胞進行轉染實驗。將細胞分為正常對照組（NC組）、si-SAPCD2組和通路抑制劑組（si-SAPCD2+XMU-MP-1組）。將選取好的肺癌A549細胞培養至對數生長期，在細胞箱中培養過夜，采取瞬時轉染，依據Lipo2000說明書，將干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染到A549細胞中，培養箱中培養48 h后，再次使用qRT-PCR和Western blot檢測細胞轉染效率。
1.2.4 qRT-PCR實驗檢測SAPCD2 mRNA表達
采用qRT-PCR檢測肺癌細胞和正常細胞SAPCD2 mRNA表達，選取肺癌細胞中表達水平最高的細胞株進行實驗，并通過檢測轉染后細胞的SAPCD2 mRNA表達明確細胞轉染效率。利用TRIzol分別提取肺癌細胞（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞中RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將提取的RNA反轉錄成cDNA，根據qRT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq進行實驗，以GAPDH為內參，采用2–△△CT法計算肺腺癌細胞和BEAS-2B中SAPCD2 mRNA表達。
1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力
取對數生長期的細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞。對配置好的細胞懸液進行細胞計數。取用2塊6孔板，6孔板中每孔以500個細胞為標準進行接種，每組設置3個孔，每隔2～3 d對細胞進行換液操作，為期2周。實驗完成時，使用1 mL磷酸鹽緩沖液沖洗1～2次，使用現配的包含10%多聚甲醛的吉姆薩染液進行固定和染色。然后使用清水沖洗6孔板，最后使用相機拍照保存實驗記錄。
1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡
將上述轉染處理后的A549細胞重新消化并離心。離心后棄除上層培養液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液洗滌細胞1次，500～1000 r/min離心5 min后，再次棄除上層液體并收集細胞。加入400 μL 1×Binding Buffer將細胞輕輕吹打重懸。向上述中加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，室溫避光，孵育15 min。再加入10 μL PI染液，混勻，2～8 ℃避光反應5 min，上機檢測凋亡情況。
1.2.7 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲的能力
遷移實驗：取生長狀態良好的細胞，將基質膠按照1∶8使用無血清培養基進行稀釋，實驗前將Transwell小室取出，加入300 μL Opti-MEM培養基，將已轉染成功的A549細胞消化、離心，再取適量Opti-MEM培養基清洗2遍，調整細胞密度為1×104個/mL。向上室加入100 μL細胞懸液，下室加入500 μL含20%胎牛血清的完全培養基，培養24 h后，棄掉上層培養基，甲醇固定后吉姆薩染色自然晾干，于顯微鏡下拍照觀察并記錄。侵襲實驗：取生長狀態良好的細胞，將基質膠按照1∶8使用無血清培養基進行稀釋，將鋪有Matrigel基質膠的小室取出并將其恢復至常溫，加入無血清培養基300 μL，培養箱中孵育4 h，其余步驟同遷移實驗。
1.2.8 Western blot檢測蛋白表達
采用Western blot檢測SAPCD2在肺癌細胞與正常肺上皮細胞中蛋白表達，選取SAPCD2蛋白表達最高的細胞株進行實驗，通過檢測轉染后細胞的SAPCD2蛋白表達水平明確該細胞的轉染效率。通過檢測增殖相關蛋白ki-67、Bcl-2，凋亡相關蛋白Caspase-3以及Hippo信號通路相關蛋白NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP、YAP、TAZ在NC組、si-SAPCD2組、si-SAPCD2+XMU-MP-1組表達水平明確SAPCD2是否通過HIPPO信號通路影響A549細胞的生物學功能。先配備12% SDS-PAGE分離膠，將培養好的A549細胞完全裂解后離心后收集總蛋白的上清液。將凝膠放入電泳槽內，加入緩沖液，依次加入標準蛋白和待測蛋白，完畢后恒壓80 V進行電泳，轉入PVDF膜中，使用5%的脫脂奶粉室溫封閉60 min，加入一抗于4 ℃冰箱內過夜，孵育完畢后置于離心管中，于搖床上用TBST沖洗3次，每次7～8 min，用TBST稀釋二抗，孵育二抗步驟同上。最后在PVDF膜上加入提前配置好的化學發光顯影劑，浸泡3～4 min后于暗室中迅速曝光顯影。
1.3 統計學方法
采用統計學軟件SPSS 23.0進行統計分析，GraphPad Prism 8.0軟件繪制統計圖。呈正態分布的計量數據用均數±標準差（
±s）表示。兩組均數間比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SAPCD2在肺腺癌中高表達
在TCGA數據集中，肺腺癌組織中SAPCD2基因的表達水平較正常肺組織明顯升高（P<0.0001）。SAPCD2在人肺腺細胞株中的mRNA及蛋白表達顯著升高（P<0.01）；5種細胞中A549細胞SAPCD2的表達量最高，因此選擇此細胞進行后續的實驗（圖1）。
圖1
SAPCD2在肺腺癌組織和細胞中的表達
a. SAPCD2在肺腺癌組織和正常肺組織樣本中的表達差異；b. qRT-PCR驗證SAPCD2在肺癌細胞系內mRNA的相對表達；c. Western blot驗證SAPCD2在肺癌細胞系內蛋白質的相對表達；d. 相對灰度值比較柱狀圖。與NC組比較，*
2.2 A549細胞轉染效率
NC組SAPCD2的mRNA表達及蛋白表達量明顯高于si-SAPCD2組，差異有統計學意義（P<0.01），證明轉染成功，可以繼續進行實驗（圖2）。
圖2
轉染后SAPCD2在A549細胞SAPCD2 siRNA和蛋白的表達情況
a. Western blot檢測沉默SAPCD2后A549細胞內蛋白的相對表達；b. 相對灰度值比較柱狀圖；c. qRT-PCR檢測沉默SAPCD2后A549細胞內mRNA的相對表達。與NC組比較，**
2.3 沉默SAPCD2對A549細胞增殖能力的影響
與NC組相比，si-SAPCD2組A549細胞增殖活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01），提示沉默SAPCD2抑制肺腺癌細胞的增殖（圖3）。
圖3
沉默SAPCD2對A549細胞增殖的影響
a. 細胞克隆平板實驗細胞量；b. 細胞克隆細胞量柱狀圖。與NC組比較，**
2.4 沉默SAPCD2對A549細胞凋亡的影響
轉染48 h后，與NC組相比，si-SAPCD2組肺腺癌細胞凋亡顯著增加（P<0.01），提示沉默SAPCD2促進肺腺癌細胞凋亡（圖4）。
圖4
沉默SAPCD2對A549細胞凋亡的影響
a. A549細胞凋亡圖；b. 細胞凋亡率柱狀圖。與NC組比較，**
2.5 沉默SAPCD2對A549細胞周期分布的影響
肺腺癌A549細胞經過轉染后，si-SAPCD2組與NC組相比，分布于G0/G1期的細胞數量增加，而G2/M及S期細胞數量減少（P<0.01），提示沉默SAPCD2使A549細胞停滯于G0/G1期，進而抑制細胞增殖（圖5）。
圖5
沉默SAPCD2對A549細胞周期分布的影響
a. A549細胞周期分布圖；b. 細胞周期柱狀圖比較。與NC組比較，**
2.6 沉默SAPCD2對A549細胞遷移及侵襲的影響
與NC組相比，si-SAPCD2組肺腺癌A549細胞的遷移及侵襲顯著抑制（P<0.05），提示沉默SAPCD2抑制肺腺癌細胞的侵襲及遷移（圖6）。
圖6
沉默SAPCD2對A549細胞遷移及侵襲的影響
a. 每個高倍鏡視野中遷移及侵襲的細胞數量（×40）；b. 遷移細胞數比較柱狀圖；c. 侵襲細胞數比較柱狀圖。與NC組比較，*
2.7 沉默SAPCD2對Hippo信號通路的影響
si-SAPCD2組與NC組相比，ki-67、Bcl-2、YAP、TAZ蛋白的表達下降（P<0.01），Caspase-3、NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP蛋白的表達上升（P<0.01）；si-SAPCD2+XMU-MP-1組較si-SAPCD2組ki-67蛋白表達上升（P<0.05），Bcl-2、YAP、TAZ蛋白的表達上升（P<0.01），Caspase-3、NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP蛋白的表達下降（P<0.01）。結果提示沉默SAPCD2后，促進了Hippo信號通路，使得通路蛋白YAP、TAZ的表達下降，細胞增殖相關蛋白ki-67、Bcl-2表達同樣下降（圖7）。同樣，沉默SAPCD2后A549細胞增殖、侵襲和遷移能力降低，而si-SAPCD2+XMU-MP-1組較si-SAPCD2組A549細胞增殖、侵襲和遷移能力上升，且較NC組差異無統計學意義。使用XMU-MP-1可逆轉沉默SAPCD2對A549細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用（圖7和圖8）。提示SAPCD2可通過Hippo信號通路促進肺腺癌A549細胞的增殖、遷移及侵襲，抑制其凋亡。
圖7
Western blot檢測Hippo信號通路相關蛋白表達
a. 增殖蛋白ki-67、Bcl-2，凋亡相關蛋白Caspase-3與Hippo信號通路蛋白表達；b. ki-67、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達柱狀圖；c. Hippo信號通路上游蛋白NF2、P-MST1、P-LATS1表達柱狀圖；d. Hippo信號通路關鍵蛋白P-YAP、YAP、TAZ表達柱狀圖。*
圖8
XMU-MP-1可逆轉沉默SAPCD2對A549細胞遷移及侵襲的抑制
a. 每個高倍鏡視野中遷移及侵襲的細胞數量（×40）；b. 遷移細胞數比較柱狀圖；c. 侵襲細胞數比較柱狀圖。*
3 討論
隨著醫療科技及手段的進步，對肺腺癌相關基因的研究日益增多，很多基因在肺腺癌中高表達，甚至可能影響肺腺癌發生發展，與之對應的相關治療手段也層出不窮[9]。SAPCD2是一種新發現在哺乳動物中高度保守的影響細胞周期調控的相關基因，它參與染色體分離，SAPCD2僅在腫瘤或胚胎組織中表達，而在正常成人組織中不表達。SAPCD2蛋白目前已知的結構包括一個EF手基[10]，一個CC結構域以及兩個富含脯氨酸的區域，其他蛋白結構尚未明確[11]。SAPCD2最早是在胃癌細胞中發現并分離，是影響結直腸癌進展的重要因素[12-13]。近年SAPCD2與各種類型惡性腫瘤的研究越來越多，Wei等[14]發現抑制SAPCD2在肺腺癌中的表達，可以抑制肺腺癌細胞的惡性進展，其結果可能與MiR-486-5p的特異性有關。SAPCD2蛋白的表達與腫瘤組織分化程度具有相關性，可作為肺癌的療效指標或預測指標[15]。Zhang等[16]研究表明，乳腺癌中SAPCD2的表達和預后與YAP/TAZ蛋白表達水平相關，證明SAPCD2可通過Hippo信號通路來影響乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等。Weng等[17]研究表明，結直腸癌中SAPCD2高表達與患者的年齡、性別、TNM分期、預后及生活質量有關。Luo等[18]研究表明，過表達SAPCD2可使結直腸癌細胞在體內外的增殖和遷移顯著增強，且使停滯在細胞周期G2/M期的結直腸癌細胞增多，沉默SAPCD2在結直腸癌細胞中的表達后發現，停滯在細胞周期G1期的細胞增多而S期細胞減少。本研究結果顯示，與正常肺上皮細胞相比，肺腺癌中SAPCD2水平明顯升高，這與相關研究結果一致。
腫瘤細胞由于其相較于正常細胞顯著的增殖能力來說，易發生壓迫周圍組織、侵犯臨近器官、發生遠處轉移等危害人體健康的不利影響[19]。本研究對比了肺腺癌細胞（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和人正常肺上皮細胞（BESA-2B），發現所有肺腺癌細胞中SAPCD2的mRNA及蛋白表達都較人正常肺上皮細胞高，尤其是以A549細胞最為明顯，因此后續實驗采用A549細胞進行。實驗結果發現沉默SAPCD2的表達后，肺腺癌A549的增殖能力被抑制，細胞周期G1/G0期的細胞明顯增多，細胞早期凋亡率較NC組明顯增加。這表明沉默SAPCD2后，使肺腺癌細胞多數停滯在G1/G0期，能到達S或G2/M期的細胞變少，從而抑制細胞增殖。Ki-67蛋白一直被廣泛用作人類腫瘤細胞的增殖標志物，在細胞間期、有絲分裂期中都有作用，是正常細胞的異染色質抗原和異染色質核仁結合所必需的，其作用是防止有絲分裂染色體的聚集[20]。Bcl-2是BCL-2家族細胞凋亡調節蛋白的創始成員，最初是通過研究人B細胞濾泡性淋巴瘤中存在的t（14；18）易位而發現的，它能夠通過干擾細胞凋亡來增加細胞的增殖[21]。Caspase-3又叫做半胱天冬酶-3，是細胞凋亡早期和晚期最公認且常用的生化標志，活化的Caspase-3可促進細胞凋亡，參與生長刺激[22-23]。本研究結果顯示，沉默SAPCD2在肺腺癌的表達后，Western blot結果顯示ki-67、Bcl-2蛋白表達被明顯抑制，Caspase-3蛋白表達明顯升高，表明沉默SAPCD2后，肺腺癌細胞的凋亡明顯增多，增殖明顯下降。
遷移和侵襲是惡性腫瘤主要生物學特征之一[24]。在哺乳動物中，YAP/TAZ是Hippo通路中的下游效應分子，也是細胞微環境結構和機械特征的傳感器[25]，YAP基因位于人類染色體11q22上，它廣泛表達于正常人體組織中，TAZ又稱WWTR1，與YAP同源，有46%的氨基酸序列相同[26]。YAP/TAZ是在人類惡性腫瘤中普遍激活的高度相關的轉錄調節因子。研究表明YAP/TAZ對大多數實體瘤相關癌癥的生長至關重要[27]。它們的激活可誘導癌癥干細胞增殖、轉移，甚至對化學治療產生抵抗[28]。Zhu等[29]研究發現SFTA1P沉默降低了TAZ蛋白豐度，從而降低了YAP/TAZ轉錄表達，可能通過與TAZ mRNA的相互作用來調節TAZ翻譯，研究最后證明SFTA1P是Hippo信號傳導的正反饋調節因子。本研究結果顯示，沉默SAPCD2在肺腺癌的表達后，Western blot結果顯示NF2、YAP/TAZ蛋白表達減少，P-YAP、P-MST1、P-LATS1表達增多，表明SAPCD2表達減少可促進Hippo信號通路MST1、LATS1以及YAP蛋白的磷酸化，最終使磷酸化后的YAP無法進入細胞核，進而抑制細胞增殖。
Hippo通路的激活可使MST1激酶活化，逐級促進下游因子磷酸化，當YAP/TAZ被磷酸化后很難進入細胞核，促進細胞凋亡。XMU-MP-1是Hippo通路激酶MST1/2的抑制劑，能阻斷MST1/2激酶活性，使下游磷酸化YAP/TAZ減少，并促進細胞生長[30]。該激酶抑制劑已被證明可促進增殖、再生以及抗凋亡，轉錄調節相關下游因子YAP1的激活[31]。本研究Western blot結果顯示，si-SAPCD2+XMU-MP-1組較si-SAPCD2組，ki-67、Bcl-2、YAP、TAZ蛋白表達明顯增加，Caspase-3、NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP蛋白的表達明顯下降，NC組與si-SAPCD2組相比蛋白表達同上。而si-SAPCD2+XMU-MP-1組與NC組相比，差異無統計學意義。實驗結果表明在si-SAPCD2組基礎上使用XMU-MP-1，能抑制沉默SAPCD2后肺腺癌細胞下降的增殖、遷移及侵襲能力，而YAP蛋白表達高于NC組可能與XMU-MP-1直接作用Hippo通路激酶MST1/2有關。
綜上所述，SAPCD2在肺腺癌中高表達。沉默SAPCD2可降低肺腺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的能力，促進細胞凋亡；SAPCD2通過Hippo信號通路來影響細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡。SAPCD2基因可作為肺癌的療效指標或預測指標進一步研究。本實驗還存在一些的不足：研究只進行了體外細胞培養實驗，無體內相關肺腺癌組織的研究；驗證Hippo信號通路時，只通過沉默SAPCD2做了驗證，而過表達該基因是否與沉默時Hippo信號中關鍵蛋白表達量相反，仍有待進一步研究驗證；只驗證了SAPCD2表達最高的A549細胞，缺少對其他三種肺癌細胞生物學功能的探索。另外，Hippo信號通路中蛋白較多，我們還可以通過檢測該通路其他蛋白表達量的變化，來探索對肺腺癌細胞生物學功能的影響。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺癌發病率逐年上升，在惡性腫瘤病死率排名中位列第一，是罹患癌癥導致患者死亡的主要原因之一[1]。2022年中國新增肺癌病例數約87萬例，新增由于肺癌死亡病例數約76萬例，肺癌已然成為危害人民身體健康，惡化家庭經濟的常見癌癥[2]。肺癌發病率、患病率及死亡率隨著年齡的增加呈現上升趨勢，而且男性均高于女性[1, 3]。肺癌分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌兩大組織學亞型，其中非小細胞肺癌約占85%[4]。非小細胞肺癌最常見和最致命的亞型是肺腺癌。由于肺癌患者在初期癥狀易與普通肺部疾病混淆，多數患者初診時已處于晚期，5年生存率僅約10%。目前早期篩查、手術治療、放化療等相關措施都一定程度上緩解了患者部分并發癥[5]，提高了生活質量，一定程度上延長了患者的壽命，但目前常用的治療手段所覆蓋的肺癌種類少，且手術治療針對肺癌晚期患者不能根治，放化療不良反應較大且針對性弱[6]。肺癌一旦發生全身轉移或治療藥物出現耐受等導致效果變差的情況后，患者的治療將陷入兩難的境地，多數患者在晚期只能對癥維持治療[7]。SAPCD2是高度保守且在胚胎組織中高度表達的基因，與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關，可通過多種信號通路促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并與腫瘤耐藥相關，而在肺癌中少有報道[8]。本研究探討SAPCD2在肺腺癌組織和細胞中的表達、生物學特性及作用機制，為進一步找尋新的篩查、預后標志物以及肺腺癌的治療靶點奠定臨床實際應用的理論基礎。
1 資料與方法
1.1 材料
肺腺癌細胞HCC827、H1650、SK-MES-1、A549及人正常肺上皮細胞BEAS-2S（中國科學院干細胞庫），0.25%胰酶、RPMI-1640培養基（Hyclone公司），胎牛血清（GIBCO公司），TRIzol試劑（Ambion公司），Lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen公司），逆轉錄試劑盒（康為世紀有限公司），實時定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）試劑盒SYBR Premix Ex Taq（BIO-RAD公司），Transwell小室、BCA試劑盒、β-肌動蛋白（β-actin）抗體、SAPCD2兔抗人多克隆抗體、Caspase-3抗體、NF2抗體、ki-67抗體、P-MST1抗體、P-LATS1抗體、P-YAP抗體、IGF-1抗體、羊抗兔IgG二抗（美國Abcam公司）等。
1.2 方法
1.2.1 癌癥基因圖譜
從生信之家官網（
1.2.2 細胞培養
將肺癌細胞系（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和人正常肺上皮細胞（BESA-2B）培養在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱，視培養基性狀決定是否換液，細胞長滿瓶底80%左右的面積時可以傳代，取對數生長期且狀態良好的細胞進行實驗。
1.2.3 細胞株篩、轉染及分組
使用qRT-PCR和免疫印跡（Western blot）檢測肺癌細胞（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和BEAS-2B細胞中SAPCD2 mRNA和蛋白表達水平，選取表達量較高的細胞進行轉染實驗。將細胞分為正常對照組（NC組）、si-SAPCD2組和通路抑制劑組（si-SAPCD2+XMU-MP-1組）。將選取好的肺癌A549細胞培養至對數生長期，在細胞箱中培養過夜，采取瞬時轉染，依據Lipo2000說明書，將干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）轉染到A549細胞中，培養箱中培養48 h后，再次使用qRT-PCR和Western blot檢測細胞轉染效率。
1.2.4 qRT-PCR實驗檢測SAPCD2 mRNA表達
采用qRT-PCR檢測肺癌細胞和正常細胞SAPCD2 mRNA表達，選取肺癌細胞中表達水平最高的細胞株進行實驗，并通過檢測轉染后細胞的SAPCD2 mRNA表達明確細胞轉染效率。利用TRIzol分別提取肺癌細胞（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞中RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將提取的RNA反轉錄成cDNA，根據qRT-PCR試劑盒SYBR Premix Ex Taq進行實驗，以GAPDH為內參，采用2–△△CT法計算肺腺癌細胞和BEAS-2B中SAPCD2 mRNA表達。
1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖能力
取對數生長期的細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞。對配置好的細胞懸液進行細胞計數。取用2塊6孔板，6孔板中每孔以500個細胞為標準進行接種，每組設置3個孔，每隔2～3 d對細胞進行換液操作，為期2周。實驗完成時，使用1 mL磷酸鹽緩沖液沖洗1～2次，使用現配的包含10%多聚甲醛的吉姆薩染液進行固定和染色。然后使用清水沖洗6孔板，最后使用相機拍照保存實驗記錄。
1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡
將上述轉染處理后的A549細胞重新消化并離心。離心后棄除上層培養液，加入1 mL磷酸鹽緩沖液洗滌細胞1次，500～1000 r/min離心5 min后，再次棄除上層液體并收集細胞。加入400 μL 1×Binding Buffer將細胞輕輕吹打重懸。向上述中加入Annexin V-FITC 5 μL混勻，室溫避光，孵育15 min。再加入10 μL PI染液，混勻，2～8 ℃避光反應5 min，上機檢測凋亡情況。
1.2.7 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲的能力
遷移實驗：取生長狀態良好的細胞，將基質膠按照1∶8使用無血清培養基進行稀釋，實驗前將Transwell小室取出，加入300 μL Opti-MEM培養基，將已轉染成功的A549細胞消化、離心，再取適量Opti-MEM培養基清洗2遍，調整細胞密度為1×104個/mL。向上室加入100 μL細胞懸液，下室加入500 μL含20%胎牛血清的完全培養基，培養24 h后，棄掉上層培養基，甲醇固定后吉姆薩染色自然晾干，于顯微鏡下拍照觀察并記錄。侵襲實驗：取生長狀態良好的細胞，將基質膠按照1∶8使用無血清培養基進行稀釋，將鋪有Matrigel基質膠的小室取出并將其恢復至常溫，加入無血清培養基300 μL，培養箱中孵育4 h，其余步驟同遷移實驗。
1.2.8 Western blot檢測蛋白表達
采用Western blot檢測SAPCD2在肺癌細胞與正常肺上皮細胞中蛋白表達，選取SAPCD2蛋白表達最高的細胞株進行實驗，通過檢測轉染后細胞的SAPCD2蛋白表達水平明確該細胞的轉染效率。通過檢測增殖相關蛋白ki-67、Bcl-2，凋亡相關蛋白Caspase-3以及Hippo信號通路相關蛋白NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP、YAP、TAZ在NC組、si-SAPCD2組、si-SAPCD2+XMU-MP-1組表達水平明確SAPCD2是否通過HIPPO信號通路影響A549細胞的生物學功能。先配備12% SDS-PAGE分離膠，將培養好的A549細胞完全裂解后離心后收集總蛋白的上清液。將凝膠放入電泳槽內，加入緩沖液，依次加入標準蛋白和待測蛋白，完畢后恒壓80 V進行電泳，轉入PVDF膜中，使用5%的脫脂奶粉室溫封閉60 min，加入一抗于4 ℃冰箱內過夜，孵育完畢后置于離心管中，于搖床上用TBST沖洗3次，每次7～8 min，用TBST稀釋二抗，孵育二抗步驟同上。最后在PVDF膜上加入提前配置好的化學發光顯影劑，浸泡3～4 min后于暗室中迅速曝光顯影。
1.3 統計學方法
采用統計學軟件SPSS 23.0進行統計分析，GraphPad Prism 8.0軟件繪制統計圖。呈正態分布的計量數據用均數±標準差（±s）表示。兩組均數間比較采用t檢驗，多組均數比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 SAPCD2在肺腺癌中高表達
在TCGA數據集中，肺腺癌組織中SAPCD2基因的表達水平較正常肺組織明顯升高（P<0.0001）。SAPCD2在人肺腺細胞株中的mRNA及蛋白表達顯著升高（P<0.01）；5種細胞中A549細胞SAPCD2的表達量最高，因此選擇此細胞進行后續的實驗（圖1）。
圖1
SAPCD2在肺腺癌組織和細胞中的表達
a. SAPCD2在肺腺癌組織和正常肺組織樣本中的表達差異；b. qRT-PCR驗證SAPCD2在肺癌細胞系內mRNA的相對表達；c. Western blot驗證SAPCD2在肺癌細胞系內蛋白質的相對表達；d. 相對灰度值比較柱狀圖。與NC組比較，*
2.2 A549細胞轉染效率
NC組SAPCD2的mRNA表達及蛋白表達量明顯高于si-SAPCD2組，差異有統計學意義（P<0.01），證明轉染成功，可以繼續進行實驗（圖2）。
圖2
轉染后SAPCD2在A549細胞SAPCD2 siRNA和蛋白的表達情況
a. Western blot檢測沉默SAPCD2后A549細胞內蛋白的相對表達；b. 相對灰度值比較柱狀圖；c. qRT-PCR檢測沉默SAPCD2后A549細胞內mRNA的相對表達。與NC組比較，**
2.3 沉默SAPCD2對A549細胞增殖能力的影響
與NC組相比，si-SAPCD2組A549細胞增殖活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01），提示沉默SAPCD2抑制肺腺癌細胞的增殖（圖3）。
圖3
沉默SAPCD2對A549細胞增殖的影響
a. 細胞克隆平板實驗細胞量；b. 細胞克隆細胞量柱狀圖。與NC組比較，**
2.4 沉默SAPCD2對A549細胞凋亡的影響
轉染48 h后，與NC組相比，si-SAPCD2組肺腺癌細胞凋亡顯著增加（P<0.01），提示沉默SAPCD2促進肺腺癌細胞凋亡（圖4）。
圖4
沉默SAPCD2對A549細胞凋亡的影響
a. A549細胞凋亡圖；b. 細胞凋亡率柱狀圖。與NC組比較，**
2.5 沉默SAPCD2對A549細胞周期分布的影響
肺腺癌A549細胞經過轉染后，si-SAPCD2組與NC組相比，分布于G0/G1期的細胞數量增加，而G2/M及S期細胞數量減少（P<0.01），提示沉默SAPCD2使A549細胞停滯于G0/G1期，進而抑制細胞增殖（圖5）。
圖5
沉默SAPCD2對A549細胞周期分布的影響
a. A549細胞周期分布圖；b. 細胞周期柱狀圖比較。與NC組比較，**
2.6 沉默SAPCD2對A549細胞遷移及侵襲的影響
與NC組相比，si-SAPCD2組肺腺癌A549細胞的遷移及侵襲顯著抑制（P<0.05），提示沉默SAPCD2抑制肺腺癌細胞的侵襲及遷移（圖6）。
圖6
沉默SAPCD2對A549細胞遷移及侵襲的影響
a. 每個高倍鏡視野中遷移及侵襲的細胞數量（×40）；b. 遷移細胞數比較柱狀圖；c. 侵襲細胞數比較柱狀圖。與NC組比較，*
2.7 沉默SAPCD2對Hippo信號通路的影響
si-SAPCD2組與NC組相比，ki-67、Bcl-2、YAP、TAZ蛋白的表達下降（P<0.01），Caspase-3、NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP蛋白的表達上升（P<0.01）；si-SAPCD2+XMU-MP-1組較si-SAPCD2組ki-67蛋白表達上升（P<0.05），Bcl-2、YAP、TAZ蛋白的表達上升（P<0.01），Caspase-3、NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP蛋白的表達下降（P<0.01）。結果提示沉默SAPCD2后，促進了Hippo信號通路，使得通路蛋白YAP、TAZ的表達下降，細胞增殖相關蛋白ki-67、Bcl-2表達同樣下降（圖7）。同樣，沉默SAPCD2后A549細胞增殖、侵襲和遷移能力降低，而si-SAPCD2+XMU-MP-1組較si-SAPCD2組A549細胞增殖、侵襲和遷移能力上升，且較NC組差異無統計學意義。使用XMU-MP-1可逆轉沉默SAPCD2對A549細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用（圖7和圖8）。提示SAPCD2可通過Hippo信號通路促進肺腺癌A549細胞的增殖、遷移及侵襲，抑制其凋亡。
圖7
Western blot檢測Hippo信號通路相關蛋白表達
a. 增殖蛋白ki-67、Bcl-2，凋亡相關蛋白Caspase-3與Hippo信號通路蛋白表達；b. ki-67、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達柱狀圖；c. Hippo信號通路上游蛋白NF2、P-MST1、P-LATS1表達柱狀圖；d. Hippo信號通路關鍵蛋白P-YAP、YAP、TAZ表達柱狀圖。*
圖8
XMU-MP-1可逆轉沉默SAPCD2對A549細胞遷移及侵襲的抑制
a. 每個高倍鏡視野中遷移及侵襲的細胞數量（×40）；b. 遷移細胞數比較柱狀圖；c. 侵襲細胞數比較柱狀圖。*
3 討論
隨著醫療科技及手段的進步，對肺腺癌相關基因的研究日益增多，很多基因在肺腺癌中高表達，甚至可能影響肺腺癌發生發展，與之對應的相關治療手段也層出不窮[9]。SAPCD2是一種新發現在哺乳動物中高度保守的影響細胞周期調控的相關基因，它參與染色體分離，SAPCD2僅在腫瘤或胚胎組織中表達，而在正常成人組織中不表達。SAPCD2蛋白目前已知的結構包括一個EF手基[10]，一個CC結構域以及兩個富含脯氨酸的區域，其他蛋白結構尚未明確[11]。SAPCD2最早是在胃癌細胞中發現并分離，是影響結直腸癌進展的重要因素[12-13]。近年SAPCD2與各種類型惡性腫瘤的研究越來越多，Wei等[14]發現抑制SAPCD2在肺腺癌中的表達，可以抑制肺腺癌細胞的惡性進展，其結果可能與MiR-486-5p的特異性有關。SAPCD2蛋白的表達與腫瘤組織分化程度具有相關性，可作為肺癌的療效指標或預測指標[15]。Zhang等[16]研究表明，乳腺癌中SAPCD2的表達和預后與YAP/TAZ蛋白表達水平相關，證明SAPCD2可通過Hippo信號通路來影響乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲等。Weng等[17]研究表明，結直腸癌中SAPCD2高表達與患者的年齡、性別、TNM分期、預后及生活質量有關。Luo等[18]研究表明，過表達SAPCD2可使結直腸癌細胞在體內外的增殖和遷移顯著增強，且使停滯在細胞周期G2/M期的結直腸癌細胞增多，沉默SAPCD2在結直腸癌細胞中的表達后發現，停滯在細胞周期G1期的細胞增多而S期細胞減少。本研究結果顯示，與正常肺上皮細胞相比，肺腺癌中SAPCD2水平明顯升高，這與相關研究結果一致。
腫瘤細胞由于其相較于正常細胞顯著的增殖能力來說，易發生壓迫周圍組織、侵犯臨近器官、發生遠處轉移等危害人體健康的不利影響[19]。本研究對比了肺腺癌細胞（HCC827、H1650、SK-MES-1、A549）和人正常肺上皮細胞（BESA-2B），發現所有肺腺癌細胞中SAPCD2的mRNA及蛋白表達都較人正常肺上皮細胞高，尤其是以A549細胞最為明顯，因此后續實驗采用A549細胞進行。實驗結果發現沉默SAPCD2的表達后，肺腺癌A549的增殖能力被抑制，細胞周期G1/G0期的細胞明顯增多，細胞早期凋亡率較NC組明顯增加。這表明沉默SAPCD2后，使肺腺癌細胞多數停滯在G1/G0期，能到達S或G2/M期的細胞變少，從而抑制細胞增殖。Ki-67蛋白一直被廣泛用作人類腫瘤細胞的增殖標志物，在細胞間期、有絲分裂期中都有作用，是正常細胞的異染色質抗原和異染色質核仁結合所必需的，其作用是防止有絲分裂染色體的聚集[20]。Bcl-2是BCL-2家族細胞凋亡調節蛋白的創始成員，最初是通過研究人B細胞濾泡性淋巴瘤中存在的t（14；18）易位而發現的，它能夠通過干擾細胞凋亡來增加細胞的增殖[21]。Caspase-3又叫做半胱天冬酶-3，是細胞凋亡早期和晚期最公認且常用的生化標志，活化的Caspase-3可促進細胞凋亡，參與生長刺激[22-23]。本研究結果顯示，沉默SAPCD2在肺腺癌的表達后，Western blot結果顯示ki-67、Bcl-2蛋白表達被明顯抑制，Caspase-3蛋白表達明顯升高，表明沉默SAPCD2后，肺腺癌細胞的凋亡明顯增多，增殖明顯下降。
遷移和侵襲是惡性腫瘤主要生物學特征之一[24]。在哺乳動物中，YAP/TAZ是Hippo通路中的下游效應分子，也是細胞微環境結構和機械特征的傳感器[25]，YAP基因位于人類染色體11q22上，它廣泛表達于正常人體組織中，TAZ又稱WWTR1，與YAP同源，有46%的氨基酸序列相同[26]。YAP/TAZ是在人類惡性腫瘤中普遍激活的高度相關的轉錄調節因子。研究表明YAP/TAZ對大多數實體瘤相關癌癥的生長至關重要[27]。它們的激活可誘導癌癥干細胞增殖、轉移，甚至對化學治療產生抵抗[28]。Zhu等[29]研究發現SFTA1P沉默降低了TAZ蛋白豐度，從而降低了YAP/TAZ轉錄表達，可能通過與TAZ mRNA的相互作用來調節TAZ翻譯，研究最后證明SFTA1P是Hippo信號傳導的正反饋調節因子。本研究結果顯示，沉默SAPCD2在肺腺癌的表達后，Western blot結果顯示NF2、YAP/TAZ蛋白表達減少，P-YAP、P-MST1、P-LATS1表達增多，表明SAPCD2表達減少可促進Hippo信號通路MST1、LATS1以及YAP蛋白的磷酸化，最終使磷酸化后的YAP無法進入細胞核，進而抑制細胞增殖。
Hippo通路的激活可使MST1激酶活化，逐級促進下游因子磷酸化，當YAP/TAZ被磷酸化后很難進入細胞核，促進細胞凋亡。XMU-MP-1是Hippo通路激酶MST1/2的抑制劑，能阻斷MST1/2激酶活性，使下游磷酸化YAP/TAZ減少，并促進細胞生長[30]。該激酶抑制劑已被證明可促進增殖、再生以及抗凋亡，轉錄調節相關下游因子YAP1的激活[31]。本研究Western blot結果顯示，si-SAPCD2+XMU-MP-1組較si-SAPCD2組，ki-67、Bcl-2、YAP、TAZ蛋白表達明顯增加，Caspase-3、NF2、P-MST1、P-LATS1、P-YAP蛋白的表達明顯下降，NC組與si-SAPCD2組相比蛋白表達同上。而si-SAPCD2+XMU-MP-1組與NC組相比，差異無統計學意義。實驗結果表明在si-SAPCD2組基礎上使用XMU-MP-1，能抑制沉默SAPCD2后肺腺癌細胞下降的增殖、遷移及侵襲能力，而YAP蛋白表達高于NC組可能與XMU-MP-1直接作用Hippo通路激酶MST1/2有關。
綜上所述，SAPCD2在肺腺癌中高表達。沉默SAPCD2可降低肺腺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的能力，促進細胞凋亡；SAPCD2通過Hippo信號通路來影響細胞的增殖、遷移、侵襲及凋亡。SAPCD2基因可作為肺癌的療效指標或預測指標進一步研究。本實驗還存在一些的不足：研究只進行了體外細胞培養實驗，無體內相關肺腺癌組織的研究；驗證Hippo信號通路時，只通過沉默SAPCD2做了驗證，而過表達該基因是否與沉默時Hippo信號中關鍵蛋白表達量相反，仍有待進一步研究驗證；只驗證了SAPCD2表達最高的A549細胞，缺少對其他三種肺癌細胞生物學功能的探索。另外，Hippo信號通路中蛋白較多，我們還可以通過檢測該通路其他蛋白表達量的變化，來探索對肺腺癌細胞生物學功能的影響。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
