引用本文： 徐標, 李文華, 吳威, 高銳, 胡洪琳, 王繼武. 鹽酸納美芬缺血后處理抑制TLR2/MyD88/NF-κB p65炎癥信號途徑減輕大鼠肺缺血–再灌注損傷作用的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(6): 431-436. doi: 10.7507/1671-6205.202304066 復制
肺缺血–再灌注損傷與心肺復蘇、肺栓塞等危重癥患者預后不良有關。缺血–再灌注可產生大量活性氧物質和促炎細胞因子，破壞肺泡上皮細胞和內皮屏障，導致肺水腫和肺泡氣體交換障礙[1-3]。目前對肺缺血–再灌注損傷的藥物研究多集中于缺血期前給藥，然而臨床上時常需面對已經發生肺組織缺血或者再灌注損傷的病理狀態，目前研究報道較少關注這一狀態。TLR2/MyD88/NF-κB信號途徑在肺缺血–再灌注損傷中發揮重要作用[4]，Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）、MyD88、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表達與肺組織中炎癥程度呈正相關性[5]。在急診醫學領域廣泛應用的鹽酸納美芬（納曲酮類似物）是一種特異性μ、κ、α阿片受體阻斷劑，可逆轉阿片藥物導致的呼吸抑制，具有抗休克、治療酒精中毒以及嗎啡類藥物中毒等作用，目前已廣泛應用于急性呼吸衰竭等臨床急重癥的治療[6]。研究發現納美芬可通過抑制Toll樣受體4表達減輕肺缺血–再灌注損傷[7]，但具體信號通路尚不清楚。TLR2和Toll樣受體4結構上存在相似性。因此，本研究將納美芬應用于肺缺血–再灌注損傷大鼠缺血后處理，探討納美芬通過抑制TLR2、MyD88和NF-κB p65相關靶點減輕肺缺血–再灌注損傷的作用和時間–效應性特點。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要藥物、試劑
選取體質量為150～250 g的雄性清潔級Sprague Dawley大鼠60只，飼養于規范標準環境中，動物許可證號：SCXK（鄂）2010-0009。本研究關于動物的飼養、處置和操作符合本院倫理委員會關于實驗動物福利與倫理要求。鹽酸納美芬注射液，規格1 mL∶0.1 mg，成都天臺山制藥有限公司提供。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription PCR，RT-PCR）試劑盒購自大連Takara公司。兔抗大鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65（即磷酸化NF-κB p65二聚體）、GAPDH單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 動物模型建立、分組與給藥
將60只大鼠隨機（采用隨機數字表法）均分為6組，每組10只。（1）假手術組：只開胸游離左肺門，不行缺血再灌注處理。（2）模型組：參考項冰倩等[8]方法，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管后使用嚙齒動物呼吸機對大鼠進行通氣，呼吸頻率設置為120次/min，吸氣/呼氣比設置為1∶2，用無創鉗夾斷左肺門，造成肺缺血。缺血45 min后松開鉗夾，左肺再灌注3 h。在實驗結束時脊椎脫臼處死大鼠，收集左肺上葉組織標本待檢。（3）納美芬A組：根據本研究預實驗結果確定給藥時間以及參考本課題組既往研究[9]確定給藥劑量，于肺循環再灌注前5 min時尾靜脈注射納美芬（15 μg/kg，劑量下同），余處理同模型組（方法下同）。（4）納美芬B組：于肺循環再灌注后10 min時尾靜脈注射納美芬。（5）納美芬C組：于肺循環再灌注后30 min時尾靜脈注射納美芬。（6）納美芬D組：于肺循環再灌注后60 min時尾靜脈注射納美芬。
1.2.2 大鼠肺組織濕/干重比值測定
再灌注3 h后取出左肺組織并立即稱重以確定濕重，然后置于 60 ℃ 烘箱中3 d并再次稱重直至達到恒定質量以確定干重，計算濕/干重比值以評估肺水腫嚴重程度。
1.2.3 大鼠肺組織病理學觀察及肺組織損傷評分
病理切片經蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后觀察肺組織形態改變。肺組織損傷分級評分標準[10]：0級（1分），外觀正常；1級（2分），輕度的間質充血和中性粒細胞浸潤；2級（3分），血管周圍水腫形成，肺結構部分破壞，中性粒細胞中度浸潤；3級（4分），肺結構完全破壞，肺泡內明顯滲出或出血，中性粒細胞致密浸潤。每組大鼠均檢測10個樣本切片。每個樣本切片隨機選取10個視野（×200）評分，取平均值為該樣本肺組織損傷評分。
1.2.4 大鼠肺組織TNF-α水平、MPO活性測定
左肺上葉組織經生理鹽水清洗后以濾紙吸干，剪取50 mg，勻漿器制成肺組織勻漿，按照TNF-α、MPO檢測試劑盒檢測TNF-α水平、MPO活性。
1.2.5 RT-PCR檢測大鼠肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA
用Trizol試劑提取總RNA。RNA濃度用紫外分光光度計檢測，260～280 nm處適宜的OD值為1.8～2.0。逆轉錄反應的總體系為10 mL（1 mg RNA），根據產品說明合成cDNA。PCR引物由中國上海生工生物技術公司合成，序列如下：TLR2（擴增產物96 bp），正向5'-GACTCTGGAAGCAGGTGACA-3′，反向5′-CAGTCAACCAGGACATGGAC-3′。MyD88（擴增產物191 bp），正向5'-AGCCTTGTTAGACCGTGAG-3'，反向：5'-GCAGATAGTGATGAACCGTAG-3'，β-肌動蛋白（內參照，擴增產物281 bp），正向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，反向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 30 s，65 °C 34 s，72 °C 1 min（40個循環）。終產物TLR2 mRNA和MyD88 mRNA相對表達水平的計算公式為2–ΔΔCt法。
1.2.6 免疫印跡（Western blot）檢測大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達
從肺組織中提取蛋白質，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。用BCA試劑盒量化蛋白質含量。每份蛋白質樣品提取50??μg在10%SDS-PAGE凝膠中進行電泳并轉移到PVDF膜上。將印跡與TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH單克隆一抗在用5%脫脂奶粉封閉后在4℃下過夜。將印跡在TBST中洗滌并在室溫下與二抗孵育2 h。條帶由ECL試劑盒發光顯影，并使用Image J 軟件檢查條帶強度。
1.3 統計學方法
數據采用SPSS 19.0 軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，單向方差分析比較組間差異后行LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺組織濕/干重比值
在濕/干重比值方面，模型組檢測值顯著高于假手術組（P<0.01）；納美芬D組檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P >0.05），納美芬缺血后處理各組檢測值呈現為納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見表1。
表1
各組大鼠動脈肺組織濕/干重比值、肺損傷評分、MPO活性、TNF-α表達（
，n=10）
2.2 大鼠肺組織病理變化及肺損傷評分
假手術肺組織未見明顯組織損傷。模型組、納美芬A、B、C、D組均可見不同程度的肺泡間隔破壞，肺間質水腫明顯，間質內炎癥細胞浸潤和紅細胞滲出，部分肺泡萎陷。在肺組織損傷評分方面，模型組評分顯著高于假手術組（P<0.01）；納美芬D組評分與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05），納美芬缺血后處理各組評分呈現納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組的特點，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖1和表1。
圖1
各組大鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 假手術組；b. 納美芬A組；c. 納美芬B組；d. 納美芬C組；e. 納美芬D組；f. 模型組。間質水腫、炎癥細胞浸潤（黑箭）。
2.3 大鼠肺組織MPO活性和TNF-α表達水平
在肺組織MPO活性和TNF-α表達水平方面，模型組各檢測值顯著高于假手術組（P<0.01）；納美芬D組各檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05），納美芬缺血后處理各組相應檢測值呈現為納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見表1。
2.4 大鼠肺組織TLR2和 MyD88 mRNA表達水平
在肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表達水平方面，模型組各檢測值高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.01）；納美芬D組各檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；納美芬缺血后處理各組相應檢測值呈現納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組的特點，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖2和表2。
圖2
大鼠肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表達水平
a. TLR2 mRNA；b. MyD88 mRNA。M：標記；1：模型組；2：納美芬D組；3：納美芬C組；4：納美芬B組；5：納美芬A組；6：假手術組；7：模型組內參照；8：納美芬D組內參照；9：納美芬C組內參照；10：納美芬B組內參照；11：納美芬A組內參照；12：假手術組內參照。
表2
大鼠肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表達水平（
，n=10）
2.5 大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κBp65表達水平
在肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平等方面，模型組各檢測值高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.01）；納美芬D組各檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；納美芬缺血后處理各組相應檢測值呈現為納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組的特點，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖3和表3。
圖3
各組大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達（Western blot）
1：模型組；2：納美芬D組；3：納美芬C組；4：納美芬B組；5：納美芬A組；6：假手術組。
表3
各組大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平（
，n=10）
3 討論
本研究將鹽酸納美芬應用于大鼠肺缺血–再灌注損傷模型的缺血后處理，發現應用納美芬缺血后處理可能通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號途徑減輕肺缺血–再灌注損傷，在缺血后處理的全病程中存在最佳藥物治療時機和有效給藥時間窗。作為Toll樣受體眾多家族成員，TLR2在肺組織中有豐富表達[11]。膜識別受體TLR2介導的信號通路可以通過MyD88依賴途徑誘導NF-κB磷酸化[12]，NF-κB信號通路是主要的炎癥信號轉導通路之一[13]。在生理狀況下NF-κB p65與抑制蛋白IκB結合處于被抑制狀態。炎癥反應時TLR2被激活后，通過一系列級聯反應激活NF-κB p65并由細胞質移位至細胞核，與促炎基因的啟動子結合，通過釋放各種炎性因子來放大炎癥反應[14-15]。
高肺液含量是急性肺損傷的特征[16]。MPO活性是組織中性粒細胞浸潤的標志物[17]。活化的單核–巨噬細胞可產生關鍵的促炎因子TNF-α，使中性粒細胞活化、聚集，并誘導如白細胞介素-6等炎癥因子瀑布式釋放，造成組織嚴重損傷[18]。因此MPO活性和TNF-α表達水平可間接反映炎癥反應嚴重程度[19]。本研究發現在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min給予納美芬可顯著抑制肺組織MPO活性和TNF-α表達，減輕肺組織損傷，因而推測納美芬可能通過間接抑制與中性粒細胞、巨噬細胞的相關炎癥反應來減輕肺組織缺血–再灌注損傷。
本研究還發現缺血–再灌注損傷后肺組織中的TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達顯著升高，肺組織炎癥及病理損傷程度也隨之加重，提示TLR2、MyD88、NF-κB p65表達增加以及NF-κB p65磷酸化、活化與缺血–再灌注損傷后肺組織中炎癥程度呈正相關性。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min時給予納美芬治療均能顯著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平，減輕肺組織炎癥及病理損傷程度，但由于三者治療時機不同，肺組織中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平顯著不同，肺組織炎癥程度也隨之不同。既往研究顯示納美芬減輕肺缺血–再灌注損傷的機制存在多樣性（如TLR4途徑等），本研究提示納美芬可能部分通過抑制TLR2、MyD88、NF-κB p65表達以及NF-κB p65磷酸化來減輕肺組織炎癥反應。
除器官移植方面外，臨床上器官缺血的發生常不可預知，心肺復蘇等病理生理過程中再灌注的發生時間窗也很難把握，因而目前在防治器官缺血–再灌注損傷時缺血前處理在實踐中應用受限，缺血后處理（如藥物治療）卻具有簡單方便、操作性好的特點。既往研究表明多種方式的缺血后處理均能表現出對再灌注器官的保護效應，但缺血后處理有特定的時間窗和保護條件[20-21]。缺血–再灌注損傷不僅發生在缺血的當時，更重要的是發生在血流恢復灌注后，只有抓住這個時間窗及時治療才能更好地防治器官再灌注損傷。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min時給予納美芬治療均能顯著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平，減輕肺組織炎癥及病理損傷程度。肺組織炎癥及病理損傷程度呈現為：再灌注前5 min<再灌注后10 min<再灌注后30 min，提示提示納美芬抑制肺組織缺血再灌注損傷炎癥反應可能存在給藥時間-效應性特點，肺組織缺血–再灌注損傷后盡早給藥可提高治療效果。值得注意的是，在再灌注后60 min時給予同等劑量納美芬治療，肺組織中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平及肺組織炎癥程度與模型組并無顯著差別，提示納美芬可能在某一給藥劑量下存在特定有效時間窗口。推測此現象的可能原因為隨著再灌注后時間延長，肺組織炎癥反應逐步加重，很可能在某一時間臨界點觸發“炎癥因子風暴”等局部炎癥過程，此時此劑量下的納美芬治療難以逆轉炎癥發展的進程。當然藥物作用的動物種屬不同（如作用于人類），藥物作用的劑量不同是否會影響肺組織缺血–再灌注損傷時納美芬治療時間窗的數值尚不清楚。在臨床上納美芬治療肺組織缺血–再灌注損傷有效給藥時間窗的確定以及能否通過增大藥物劑量來延長時間窗也尚待進一步深入研究。
綜上所述，本研究在既往研究的基礎上進一步豐富了納美芬缺血后處理減輕肺組織缺血–再灌注損傷的作用機制和特點，為開發肺血栓栓塞癥、心源性猝死后復蘇等發生肺缺血再灌注損傷疾病的治療提供了基礎研究依據，為進一步拓展鹽酸納美芬在急診醫學領域的臨床新用途奠定了研究基礎。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺缺血–再灌注損傷與心肺復蘇、肺栓塞等危重癥患者預后不良有關。缺血–再灌注可產生大量活性氧物質和促炎細胞因子，破壞肺泡上皮細胞和內皮屏障，導致肺水腫和肺泡氣體交換障礙[1-3]。目前對肺缺血–再灌注損傷的藥物研究多集中于缺血期前給藥，然而臨床上時常需面對已經發生肺組織缺血或者再灌注損傷的病理狀態，目前研究報道較少關注這一狀態。TLR2/MyD88/NF-κB信號途徑在肺缺血–再灌注損傷中發揮重要作用[4]，Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）、MyD88、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）表達與肺組織中炎癥程度呈正相關性[5]。在急診醫學領域廣泛應用的鹽酸納美芬（納曲酮類似物）是一種特異性μ、κ、α阿片受體阻斷劑，可逆轉阿片藥物導致的呼吸抑制，具有抗休克、治療酒精中毒以及嗎啡類藥物中毒等作用，目前已廣泛應用于急性呼吸衰竭等臨床急重癥的治療[6]。研究發現納美芬可通過抑制Toll樣受體4表達減輕肺缺血–再灌注損傷[7]，但具體信號通路尚不清楚。TLR2和Toll樣受體4結構上存在相似性。因此，本研究將納美芬應用于肺缺血–再灌注損傷大鼠缺血后處理，探討納美芬通過抑制TLR2、MyD88和NF-κB p65相關靶點減輕肺缺血–再灌注損傷的作用和時間–效應性特點。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及主要藥物、試劑
選取體質量為150～250 g的雄性清潔級Sprague Dawley大鼠60只，飼養于規范標準環境中，動物許可證號：SCXK（鄂）2010-0009。本研究關于動物的飼養、處置和操作符合本院倫理委員會關于實驗動物福利與倫理要求。鹽酸納美芬注射液，規格1 mL∶0.1 mg，成都天臺山制藥有限公司提供。Trizol試劑購自美國Invitrogen公司。逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription PCR，RT-PCR）試劑盒購自大連Takara公司。兔抗大鼠TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65（即磷酸化NF-κB p65二聚體）、GAPDH單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。BCA試劑盒、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附試驗試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。
1.2 方法
1.2.1 動物模型建立、分組與給藥
將60只大鼠隨機（采用隨機數字表法）均分為6組，每組10只。（1）假手術組：只開胸游離左肺門，不行缺血再灌注處理。（2）模型組：參考項冰倩等[8]方法，用10%水合氯醛（4 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠，氣管插管后使用嚙齒動物呼吸機對大鼠進行通氣，呼吸頻率設置為120次/min，吸氣/呼氣比設置為1∶2，用無創鉗夾斷左肺門，造成肺缺血。缺血45 min后松開鉗夾，左肺再灌注3 h。在實驗結束時脊椎脫臼處死大鼠，收集左肺上葉組織標本待檢。（3）納美芬A組：根據本研究預實驗結果確定給藥時間以及參考本課題組既往研究[9]確定給藥劑量，于肺循環再灌注前5 min時尾靜脈注射納美芬（15 μg/kg，劑量下同），余處理同模型組（方法下同）。（4）納美芬B組：于肺循環再灌注后10 min時尾靜脈注射納美芬。（5）納美芬C組：于肺循環再灌注后30 min時尾靜脈注射納美芬。（6）納美芬D組：于肺循環再灌注后60 min時尾靜脈注射納美芬。
1.2.2 大鼠肺組織濕/干重比值測定
再灌注3 h后取出左肺組織并立即稱重以確定濕重，然后置于 60 ℃ 烘箱中3 d并再次稱重直至達到恒定質量以確定干重，計算濕/干重比值以評估肺水腫嚴重程度。
1.2.3 大鼠肺組織病理學觀察及肺組織損傷評分
病理切片經蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后觀察肺組織形態改變。肺組織損傷分級評分標準[10]：0級（1分），外觀正常；1級（2分），輕度的間質充血和中性粒細胞浸潤；2級（3分），血管周圍水腫形成，肺結構部分破壞，中性粒細胞中度浸潤；3級（4分），肺結構完全破壞，肺泡內明顯滲出或出血，中性粒細胞致密浸潤。每組大鼠均檢測10個樣本切片。每個樣本切片隨機選取10個視野（×200）評分，取平均值為該樣本肺組織損傷評分。
1.2.4 大鼠肺組織TNF-α水平、MPO活性測定
左肺上葉組織經生理鹽水清洗后以濾紙吸干，剪取50 mg，勻漿器制成肺組織勻漿，按照TNF-α、MPO檢測試劑盒檢測TNF-α水平、MPO活性。
1.2.5 RT-PCR檢測大鼠肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA
用Trizol試劑提取總RNA。RNA濃度用紫外分光光度計檢測，260～280 nm處適宜的OD值為1.8～2.0。逆轉錄反應的總體系為10 mL（1 mg RNA），根據產品說明合成cDNA。PCR引物由中國上海生工生物技術公司合成，序列如下：TLR2（擴增產物96 bp），正向5'-GACTCTGGAAGCAGGTGACA-3′，反向5′-CAGTCAACCAGGACATGGAC-3′。MyD88（擴增產物191 bp），正向5'-AGCCTTGTTAGACCGTGAG-3'，反向：5'-GCAGATAGTGATGAACCGTAG-3'，β-肌動蛋白（內參照，擴增產物281 bp），正向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'，反向5'-ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT-3'。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 30 s，65 °C 34 s，72 °C 1 min（40個循環）。終產物TLR2 mRNA和MyD88 mRNA相對表達水平的計算公式為2–ΔΔCt法。
1.2.6 免疫印跡（Western blot）檢測大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達
從肺組織中提取蛋白質，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液中裂解。用BCA試劑盒量化蛋白質含量。每份蛋白質樣品提取50??μg在10%SDS-PAGE凝膠中進行電泳并轉移到PVDF膜上。將印跡與TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65、GAPDH單克隆一抗在用5%脫脂奶粉封閉后在4℃下過夜。將印跡在TBST中洗滌并在室溫下與二抗孵育2 h。條帶由ECL試劑盒發光顯影，并使用Image J 軟件檢查條帶強度。
1.3 統計學方法
數據采用SPSS 19.0 軟件進行分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，單向方差分析比較組間差異后行LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺組織濕/干重比值
在濕/干重比值方面，模型組檢測值顯著高于假手術組（P<0.01）；納美芬D組檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P >0.05），納美芬缺血后處理各組檢測值呈現為納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見表1。
表1
各組大鼠動脈肺組織濕/干重比值、肺損傷評分、MPO活性、TNF-α表達（，n=10）
2.2 大鼠肺組織病理變化及肺損傷評分
假手術肺組織未見明顯組織損傷。模型組、納美芬A、B、C、D組均可見不同程度的肺泡間隔破壞，肺間質水腫明顯，間質內炎癥細胞浸潤和紅細胞滲出，部分肺泡萎陷。在肺組織損傷評分方面，模型組評分顯著高于假手術組（P<0.01）；納美芬D組評分與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05），納美芬缺血后處理各組評分呈現納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組的特點，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖1和表1。
圖1
各組大鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 假手術組；b. 納美芬A組；c. 納美芬B組；d. 納美芬C組；e. 納美芬D組；f. 模型組。間質水腫、炎癥細胞浸潤（黑箭）。
2.3 大鼠肺組織MPO活性和TNF-α表達水平
在肺組織MPO活性和TNF-α表達水平方面，模型組各檢測值顯著高于假手術組（P<0.01）；納美芬D組各檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05），納美芬缺血后處理各組相應檢測值呈現為納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見表1。
2.4 大鼠肺組織TLR2和 MyD88 mRNA表達水平
在肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表達水平方面，模型組各檢測值高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.01）；納美芬D組各檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；納美芬缺血后處理各組相應檢測值呈現納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組的特點，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖2和表2。
圖2
大鼠肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表達水平
a. TLR2 mRNA；b. MyD88 mRNA。M：標記；1：模型組；2：納美芬D組；3：納美芬C組；4：納美芬B組；5：納美芬A組；6：假手術組；7：模型組內參照；8：納美芬D組內參照；9：納美芬C組內參照；10：納美芬B組內參照；11：納美芬A組內參照；12：假手術組內參照。
表2
大鼠肺組織TLR2 mRNA和MyD88 mRNA表達水平（，n=10）
2.5 大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κBp65表達水平
在肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平等方面，模型組各檢測值高于假手術組，差異有統計學意義（P<0.01）；納美芬D組各檢測值與模型組比較，差異無統計學意義（P>0.05）；納美芬缺血后處理各組相應檢測值呈現為納美芬D組>納美芬C組>納美芬B組>納美芬A組的特點，差異有統計學意義（P<0.01）。結果見圖3和表3。
圖3
各組大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達（Western blot）
1：模型組；2：納美芬D組；3：納美芬C組；4：納美芬B組；5：納美芬A組；6：假手術組。
表3
各組大鼠肺組織TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平（，n=10）
3 討論
本研究將鹽酸納美芬應用于大鼠肺缺血–再灌注損傷模型的缺血后處理，發現應用納美芬缺血后處理可能通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號途徑減輕肺缺血–再灌注損傷，在缺血后處理的全病程中存在最佳藥物治療時機和有效給藥時間窗。作為Toll樣受體眾多家族成員，TLR2在肺組織中有豐富表達[11]。膜識別受體TLR2介導的信號通路可以通過MyD88依賴途徑誘導NF-κB磷酸化[12]，NF-κB信號通路是主要的炎癥信號轉導通路之一[13]。在生理狀況下NF-κB p65與抑制蛋白IκB結合處于被抑制狀態。炎癥反應時TLR2被激活后，通過一系列級聯反應激活NF-κB p65并由細胞質移位至細胞核，與促炎基因的啟動子結合，通過釋放各種炎性因子來放大炎癥反應[14-15]。
高肺液含量是急性肺損傷的特征[16]。MPO活性是組織中性粒細胞浸潤的標志物[17]。活化的單核–巨噬細胞可產生關鍵的促炎因子TNF-α，使中性粒細胞活化、聚集，并誘導如白細胞介素-6等炎癥因子瀑布式釋放，造成組織嚴重損傷[18]。因此MPO活性和TNF-α表達水平可間接反映炎癥反應嚴重程度[19]。本研究發現在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min給予納美芬可顯著抑制肺組織MPO活性和TNF-α表達，減輕肺組織損傷，因而推測納美芬可能通過間接抑制與中性粒細胞、巨噬細胞的相關炎癥反應來減輕肺組織缺血–再灌注損傷。
本研究還發現缺血–再灌注損傷后肺組織中的TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達顯著升高，肺組織炎癥及病理損傷程度也隨之加重，提示TLR2、MyD88、NF-κB p65表達增加以及NF-κB p65磷酸化、活化與缺血–再灌注損傷后肺組織中炎癥程度呈正相關性。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min時給予納美芬治療均能顯著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平，減輕肺組織炎癥及病理損傷程度，但由于三者治療時機不同，肺組織中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平顯著不同，肺組織炎癥程度也隨之不同。既往研究顯示納美芬減輕肺缺血–再灌注損傷的機制存在多樣性（如TLR4途徑等），本研究提示納美芬可能部分通過抑制TLR2、MyD88、NF-κB p65表達以及NF-κB p65磷酸化來減輕肺組織炎癥反應。
除器官移植方面外，臨床上器官缺血的發生常不可預知，心肺復蘇等病理生理過程中再灌注的發生時間窗也很難把握，因而目前在防治器官缺血–再灌注損傷時缺血前處理在實踐中應用受限，缺血后處理（如藥物治療）卻具有簡單方便、操作性好的特點。既往研究表明多種方式的缺血后處理均能表現出對再灌注器官的保護效應，但缺血后處理有特定的時間窗和保護條件[20-21]。缺血–再灌注損傷不僅發生在缺血的當時，更重要的是發生在血流恢復灌注后，只有抓住這個時間窗及時治療才能更好地防治器官再灌注損傷。在再灌注前5 min、再灌注后10 min及30 min時給予納美芬治療均能顯著降低TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平，減輕肺組織炎癥及病理損傷程度。肺組織炎癥及病理損傷程度呈現為：再灌注前5 min<再灌注后10 min<再灌注后30 min，提示提示納美芬抑制肺組織缺血再灌注損傷炎癥反應可能存在給藥時間-效應性特點，肺組織缺血–再灌注損傷后盡早給藥可提高治療效果。值得注意的是，在再灌注后60 min時給予同等劑量納美芬治療，肺組織中TLR2、MyD88、NF-κB p65、p-NF-κB p65表達水平及肺組織炎癥程度與模型組并無顯著差別，提示納美芬可能在某一給藥劑量下存在特定有效時間窗口。推測此現象的可能原因為隨著再灌注后時間延長，肺組織炎癥反應逐步加重，很可能在某一時間臨界點觸發“炎癥因子風暴”等局部炎癥過程，此時此劑量下的納美芬治療難以逆轉炎癥發展的進程。當然藥物作用的動物種屬不同（如作用于人類），藥物作用的劑量不同是否會影響肺組織缺血–再灌注損傷時納美芬治療時間窗的數值尚不清楚。在臨床上納美芬治療肺組織缺血–再灌注損傷有效給藥時間窗的確定以及能否通過增大藥物劑量來延長時間窗也尚待進一步深入研究。
綜上所述，本研究在既往研究的基礎上進一步豐富了納美芬缺血后處理減輕肺組織缺血–再灌注損傷的作用機制和特點，為開發肺血栓栓塞癥、心源性猝死后復蘇等發生肺缺血再灌注損傷疾病的治療提供了基礎研究依據，為進一步拓展鹽酸納美芬在急診醫學領域的臨床新用途奠定了研究基礎。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
