引用本文： 杜敏, 魏維, 周光紅, 黃靜, 王玉霞, 龍懷聰. Th2傾向型典型哮喘與咳嗽變異性哮喘外周血單個核細胞基因表達譜的差異性研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(6): 395-402. doi: 10.7507/1671-6205.202304060 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，常見癥狀包括咳嗽、喘息、胸悶和呼吸短促[1]。哮喘的患病率在全球范圍內呈上升趨勢，目前全球哮喘患者已超過3億，每年約有38萬人死于哮喘[2]。大約4000萬中國人患有哮喘，我國一項橫斷面研究顯示，從2010年—2012年，成年人哮喘患病率從1.24%上升到4.2%[3]。盡管成人哮喘控制率從2008年的28.7%上升到2019年的39.2%[4]，但一些哮喘患者仍然沒有得到充分的診斷和治療。哮喘已成為嚴重危害患者健康的公共衛生問題，給患者帶來巨大的心理和經濟負擔[5]。咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是哮喘常見的表型之一。約30%～40%未經標準治療的CVA患者會在3～4年內發展為典型哮喘（classical asthma，CA），因此CVA被認為是哮喘[6]的早期階段。研究發現CVA的發病機制與CA相似，兩者均涉及多種細胞的慢性氣道炎癥，似乎有共同的炎癥模式[7]，CVA發展為CA也被認為是一個自然過程[8]。大多數關于哮喘和CVA的研究都集中在氣道炎癥、氣道功能和治療方面，很少有在基因表達水平上研究兩者的差異。我們推測，對CA和CVA的差異基因表達研究對進一步明確哮喘的發病機制有重要意義。在本研究中，我們收集了門診的CA和CVA患者，通過全長轉錄組測序技術檢測患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC） mRNA的基因表達譜，篩選差異基因，并進一步進行RT-PCR驗證。通過差異基因分析，預測可能與CVA發展為CA相關的基因和途徑。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
采用橫斷面研究，收集2018年6月1日—2019年12月31日在四川省人民醫院呼吸與危重癥醫學科門診就診的CA和CVA患者。健康對照組從我院體檢中心招募。收集受試者年齡、性別、體重指數（body mass index，BMI）、呼出氣一氧化氮分數（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）、血清IgE和呼氣峰值流量（peak expiratory flow，PEF）等臨床特征。CA的診斷標準來自2018年版全球哮喘防治創議[9]。CVA的診斷標準為：咳嗽為唯一癥狀或主要癥狀，無典型哮喘表現如氣喘、胸悶等；通常表現為干咳或咳出少量清痰，主要在夜間發生；氣道高反應性測試陽性；排除其他原因的咳嗽。納入標準：年齡在20～65歲；符合CA和CVA診斷標準；無吸煙史；4周內未口服或靜脈注射糖皮質激素，未采用免疫療法和生物療法；4周內無急性呼吸道感染史；同意參與這項研究。排除標準：重度哮喘患者；合并內分泌代謝性疾病、高血壓等與遺傳相關的疾病和其他呼吸道疾病（如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張、肺結核等）；妊娠、哺乳期。本研究得到了四川省人民醫院倫理委員會批準（批準文號：2017年103號），所有參與者簽署書面知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 炎癥表型
采用血清IgE和FeNO評估患者氣道炎癥。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb[10-12]為條件進一步篩選CA或CVA患者，并將其定義為Th2傾向型哮喘。
1.2.2 PBMC分離和RNA提取
乙二胺四乙酸抗凝管（6 mL）收集外周血。用淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque，北京康為世紀生物科技有限公司）在2 h內分離出PBMC。總RNA提取按照生產廠家（北京康為世紀生物科技有限公司）的說明書使用Trizol試劑進行。用Nanodrop檢測提取RNA的純度，RNA儲存在–80 ℃的冰箱中，以便進一步分析。
1.2.3 全長轉錄組測序和數據分析
基因全長轉錄組測序分析由北京百邁客生物科技有限公司協助完成。P<0.05和fold change（FC）≥1.5被認為是差異表達基因（ differentially expressed genes，DEGs），利用基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對生物過程進行分析并篩選差異基因。將篩選的差異基因輸入STRING數據庫，確定差異基因對應蛋白之間可能存在的相互作用關系，構建蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡結構圖。應用Cytoscope中的CytoNCA插件對中間中心進行排序為標準，選擇前1/4個基因，通過MCODE插件Cytoscope識別PPI網絡中最關鍵的模塊。
1.2.4 RT-PCR驗證差異基因表達
選擇DEGs并設計相應引物，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測差異基因mRNA表達。使用Aidlab的TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，獲得cDNA，并將其作為模板，使用實時PCR儀（analytikjena-Easycycl，德國）根據PCR擴增試劑盒說明書對PBMC的mRNA樣本進行擴增。PCR反應參數為：95 ℃，3 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，連續39個循環，樣品設置3個平行重復孔。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為內參，用2–△△Ct計算各靶點的相對基因表達量。
1.3 統計學方法
采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料符合正態分布的以均數±標準差（
±s）表示，正態分布的數據組間比較采用單因素方差分析，利用Bonferroni進行校正，多重比較中檢驗水準α=0.05/比較次數。不符合正態分布的數據采用中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用非參數獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料采用例數表示，組間比較采用χ2檢驗。利用Wallenius非中心超幾何分布的GOseq R包（4.3版本）進行DEGs的基因本體富集分析，應用KOBAS[13]軟件對差異基因進行KEGG統計富集分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
31例哮喘患者和7例HC的臨床特征見表1。31例哮喘患者中，CA組20例，CVA組11例。CA、CVA和HC組在性別、年齡、BMI和PEF均無顯著差異（P>0.05）。CA和CVA組IgE、FeNO水平明顯高于HC組（P<0.05），而CA組與CVA組間差異無統計學意義（P>0.05）。CA組血液嗜酸性粒細胞計數高于HC組，但CVA與HC和CA組間無明顯差異（P>0.05）。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb為條件篩選出Th2傾向型CA患者9例，Th2傾向型CVA患者5例。
表1
受試者入組時的臨床特征［（
）/例/M（P25，P75）］
2.2 差異基因分析
在基因表達水平上，CA組和CVA組之間有177個DEGs，其中上調基因94個，下調基因83個。CA組與HC組之間共存在949個DEGs，其中上調基因478個，下調基因471個。CVA組與HC組比較，有532個DEGs，其中290個基因上調，242個基因下調。進一步分組分析，Th2傾向型CA組與Th2傾向型CVA組之間共存在300個差異表達，其中155個（52%）基因相對上調，145個（48%）基因相對下調。與HC組相比，Th2傾向型CA組有832個DEGs，其中385個（46%）相對上調，447個（51%）相對下調。與HC組相比，Th2傾向型CVA組有275個（48%）基因相對表達上調，296個（52%）基因相對表達下調。結果見圖1。
圖1
三組間DEGs火山圖
a. Th2傾向型CA組與Th2傾向型CVA組；b. Th2傾向型CA組與HC組；c. Th2傾向型CVA組與HC組。紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，黑色表示無差異基因。
2.3 GO富集分析
基因差異表達的GO注釋主要包括生物過程、細胞組分和分子功能。HC與Th2傾向型CA之間生物過程DEGs主要富集于有機氮化合物合成、主動脈發育和藥物反應；細胞組分DEGs主要富集在細胞質中；分子功能DEGs主要富集在ATP結合等活性分子功能中。在Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間的生物過程中，DEGs主要富集在藥物反應和氮化合物生物合成；細胞組分DEGs主要富集在細胞質基質、細胞質等部位；分子功能DEGs主要富集在蛋白結合、ATP結合等活性分子功能中。在HC和Th2傾向型CVA生物過程DEGs主要富集在上皮細胞遷移和藥物反應的正向調控中，細胞組分的DEGs主要富集在細胞質中；分子功能DEGs主要富集在活性分子功能中，如ATP結合分子功能。結果如圖2所示。
圖2
三組間GO注釋圖比較
a. Th2傾向型CA組和Th2傾向型CVA組；b. Th2傾向型CA組和HC組；c. Th2傾向型CVA組和HC組。直方圖顏色表示GO功能分類，紅色代表生物過程，黃色代表細胞組分，藍色代表分子功能；y軸為GO項；x軸表示–log10（KS），KS是Kolmogorov-Smirnov檢驗（KS test）得到的
2.4 KEGG通路分析
KEGG分析顯示，Th2傾向型CA與Th2傾向型CVA的DEGs主要富集在2-氧羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒性信號通路中，Th2傾向型CA與HC的DEGs主要富集在血管平滑肌收縮等信號通路中，Th2傾向型CVA與HC的DEGs主要富集在其他類型的o-聚糖生物合成中。結果如圖3所示。
圖3
三組間DEGsKEGG通路富集散點圖比較
a. Th2傾向型CA組與Th2傾向型CVA組；b. Th2傾向型CA組與HC組；c. Th2傾向型CVA組與HC組。圖中每一個圓表示一個KEGG通路，縱坐標表示通路名稱，橫坐標為富集因子，表示差異基因中注釋到某通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值。富集因子越大，表示DEGs在該通路中的富集水平越顯著。圓圈的顏色代表
2.5 PPI 網絡分析
將差異基因輸入STRING數據庫（版本11.5），構建中等置信度（相互作用得分0.40）的PPI網絡，刪除邊緣處的非相互作用蛋白。PPI網絡分析結果表明，不同基因之間存在復雜的相互關系，不同基因之間存在廣泛的蛋白質相互作用。不同基因相關的關鍵模塊包括GZMB、TBX21、RUNX3、IL2RB、B3GAT1、PPBP、IFIT1、IFIT3、IFIT4、IFIT2、TNFSF10、TLR2、CCR2、CD69、XAF1、CCRL2、PRF1基因（圖4）。結合GO、KEGG、PPI分析，篩選出高表達、顯著富集的差異基因和蛋白–蛋白相互作用密集的基因，從中篩選了10個DEGs（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）作為候選基因，通過后續實時PCR進行驗證，引物設計見表2。
圖4
PPI分析圖
a. 順序基于Betweenness Centralit值，紅色表示Betweenness Centralit值的前四分之一；b. . PPI網絡分析中最關鍵的模塊，包括17個節點和60邊。
表2
10個候選基因實時PCR檢測引物列表
2.6 候選DEGs的RT-PCR驗證
RT-PCR結果顯示，PBMC中CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X的表達在Th2傾向型CA組和Th2傾向型CVA組，以及Th2傾向型CA組和HC組之間存在顯著差異（P<0.05），表達量上調。PF4在PBMC中的表達僅在Th2傾向型CA組和HC組之間差異有統計學意義（P<0.05）。HLA-A、DUSP2、CCR2在Th2傾向型CA組、Th2傾向型CVA組和HC組之間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表3。
表3
各組候選基因相對表達量比較（
）
3 討論
哮喘是一種常見的慢性呼吸道疾病，本質上是慢性氣道炎癥。哮喘的生理特征主要表現為氣道高反應性和氣道重塑。近幾十年來，人們進行了大量的基礎和臨床研究，以發現哮喘發生發展的原因和潛在機制，但其發病機制尚未明確，哮喘發病率居高不下。研究表明哮喘是一種表型不同的異質性疾病，Th2型哮喘是哮喘最重要的表型之一，占成人哮喘的60%以上[14]。CVA是一種非典型哮喘，其發病機制與CA相似，可能受Th2細胞的影響，Th1/Th2免疫失衡也與CVA的發生有關[15]。CVA被認為是哮喘的早期階段，30%～40%的CVA病例未經標準化治療會在3～4年內發展為CA，但其發病機制尚不清楚，環境因素和遺傳因素可促進哮喘的發生。
在本研究中，我們使用三代全長轉錄組測序分析，發現Th2傾向型CA、Th2傾向型CVA和HC的PBMC基因表達譜存在顯著差異。Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間共篩選出300個DEGs，其中155個相對表達水平上調，145個相對表達水平下調。GO功能富集分析表明，Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA的DEGs與藥物反應、氮化合物生物合成、細胞質基質、細胞質、蛋白質結合、ATP結合等生物學過程密切相關。KEGG通路主要富集在2-羥基羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒性等信號通路中。通過GO、KEGG和PPI分析篩選出10個候選基因（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）。我們通過RT-PCR驗證候選基因的結果，發現CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X在Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間存在顯著差異，且在Th2傾向型CA表達水平上調明顯高于Th2傾向型CVA。
病理生理改變如支氣管炎、平滑肌痙攣和氣道黏液分泌增加已在Th2型哮喘中顯示出來，通常由Th2細胞釋放的白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13引起。IL-5參與嗜酸性粒細胞進入氣道的激活和遷移，并引發嗜酸性氣道炎癥[16]。IL-13在黏液高分泌和氣道高反應性中起主要作用。IL-4誘導B細胞IgE同型轉換，上調靶細胞表面高親和IgE受體（FcεRI）。肥大細胞在質膜表面的FcεRI結合IgE的過敏誘導交聯后被激活。肥大細胞釋放組胺和其他介質，導致過敏癥狀[17]。Th2免疫應答是哮喘病理生理的主要因素，也受多種信號通路的調控，如PGD2-CRTH2、Wnt/β-catenin-FAM13A和JNK-Gal-7[18]。先天淋巴細胞在免疫應答中起保護作用，NK細胞是先天淋巴細胞家族的成員，NK細胞在調節過敏性氣道炎癥中起關鍵作用，NK細胞的數量與哮喘的嚴重程度相關，NK細胞可以通過兩種不同的途徑介導其細胞毒活性[19]。它們可以釋放含有穿孔素和顆粒酶的細胞毒顆粒，或在病變細胞表面分別表達TRAIL或Fas配體與TRAIL-r1/-R2或CD95/Fas結合，誘導死亡受體介導的凋亡[20]。研究發現哮喘患者與健康對照組的痰代謝譜存在差異，這些不同的代謝物主要涉及甘油磷脂代謝、2-氧羧酸代謝和氨基酸生物合成等代謝途徑[21]。在本研究中，我們發現Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間的DEGs主要富集在2-氧羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒信號轉導通路中，提示上述信號通路可能與其差異有關。
簇集蛋白（clusterin，CLU）是一種敏感的氧化應激細胞生物傳感器，廣泛參與免疫調節、細胞粘附、細胞-細胞相互作用、細胞分化和轉化調節、細胞周期調節、DNA修復等重要生物活動，被認為是氧化應激的指標。既往研究表明，哮喘患者的血清和痰中CLU水平升高[22]。血清CLU水平與哮喘嚴重程度呈正相關，哮喘越嚴重，血清CLU水平越高；CLU也被認為是哮喘患者哮喘嚴重程度和氧化應激的生物標志物[23]。本研究中，與Th2傾向型CVA相比，Th2傾向型CA的CLU表達明顯上調，Th2傾向型CVA的CLU表達較HC組增加。Th2傾向型CA的發病機制可能與CLU有關，為CVA在遺傳水平上是哮喘的早期階段提供了有利的證據。PTGS1基因位于染色體9q32-q33.3上，全長約22 kb，編碼環氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）。環氧化酶是一種催化前列腺素生物合成的關鍵酶，也是哮喘炎癥的重要中介因子。研究表明，PTGS1基因變異與哮喘之間存在關聯[24]。顆粒酶B（granzyme B，GZMB）是一種28 kDa絲氨酸蛋白酶，被認為局限于淋巴系，是顆粒介導的細胞毒性的主要效應物[25]。GZMB和IL-13能夠同時誘導嗜堿性粒細胞，并且發現支氣管肺泡灌洗液中的兩種介質在哮喘過敏性反應晚期患者中高度相關。GZMB被認為是一種新的嗜堿性粒細胞來源的過敏性炎癥介質[25]。穿孔蛋白1（pore forming protein，PRF1）屬于膜攻擊復合物/PRF（MACPF）蛋白家族，主要參與細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞的顆粒依賴性殺傷活性，可作為具有殺傷能力的免疫細胞的明確標志物[26]。PRF1參與免疫和炎癥介導疾病的發病機制。TMSB4X基因編碼一種肌動蛋白螯合蛋白，該蛋白在調節肌動蛋白聚合中起作用，也參與細胞增殖、遷移和分化[27]，目前還沒有研究表明其與哮喘有關。
我們的研究存在以下局限性：（1）因目前對Th2型炎癥未形成統一的診斷標準，故本文查閱文獻篩選出了二個節點值定義為Th2型傾向型；（2）因為CVA患者通常很少，導致本研究中Th2傾向型CVA亞組樣本量相對較小；（3）雖然我們使用FeNO等指標來區分氣道炎癥，但沒有使用誘導痰檢查來進一步鑒別氣道炎癥的亞型。
綜上所述，我們發現6個關鍵基因CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1和TMSB4X在Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間存在差異表達，這些DEGs主要富集在2-氧羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒性信號通路中。本研究發現的基因可能預測哮喘分子水平的亞型變化，并與CVA向CA的進展有關，但CVA向CA進展的具體機制尚需進一步闡明。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見的慢性氣道炎癥性疾病，常見癥狀包括咳嗽、喘息、胸悶和呼吸短促[1]。哮喘的患病率在全球范圍內呈上升趨勢，目前全球哮喘患者已超過3億，每年約有38萬人死于哮喘[2]。大約4000萬中國人患有哮喘，我國一項橫斷面研究顯示，從2010年—2012年，成年人哮喘患病率從1.24%上升到4.2%[3]。盡管成人哮喘控制率從2008年的28.7%上升到2019年的39.2%[4]，但一些哮喘患者仍然沒有得到充分的診斷和治療。哮喘已成為嚴重危害患者健康的公共衛生問題，給患者帶來巨大的心理和經濟負擔[5]。咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是哮喘常見的表型之一。約30%～40%未經標準治療的CVA患者會在3～4年內發展為典型哮喘（classical asthma，CA），因此CVA被認為是哮喘[6]的早期階段。研究發現CVA的發病機制與CA相似，兩者均涉及多種細胞的慢性氣道炎癥，似乎有共同的炎癥模式[7]，CVA發展為CA也被認為是一個自然過程[8]。大多數關于哮喘和CVA的研究都集中在氣道炎癥、氣道功能和治療方面，很少有在基因表達水平上研究兩者的差異。我們推測，對CA和CVA的差異基因表達研究對進一步明確哮喘的發病機制有重要意義。在本研究中，我們收集了門診的CA和CVA患者，通過全長轉錄組測序技術檢測患者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC） mRNA的基因表達譜，篩選差異基因，并進一步進行RT-PCR驗證。通過差異基因分析，預測可能與CVA發展為CA相關的基因和途徑。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
采用橫斷面研究，收集2018年6月1日—2019年12月31日在四川省人民醫院呼吸與危重癥醫學科門診就診的CA和CVA患者。健康對照組從我院體檢中心招募。收集受試者年齡、性別、體重指數（body mass index，BMI）、呼出氣一氧化氮分數（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）、血清IgE和呼氣峰值流量（peak expiratory flow，PEF）等臨床特征。CA的診斷標準來自2018年版全球哮喘防治創議[9]。CVA的診斷標準為：咳嗽為唯一癥狀或主要癥狀，無典型哮喘表現如氣喘、胸悶等；通常表現為干咳或咳出少量清痰，主要在夜間發生；氣道高反應性測試陽性；排除其他原因的咳嗽。納入標準：年齡在20～65歲；符合CA和CVA診斷標準；無吸煙史；4周內未口服或靜脈注射糖皮質激素，未采用免疫療法和生物療法；4周內無急性呼吸道感染史；同意參與這項研究。排除標準：重度哮喘患者；合并內分泌代謝性疾病、高血壓等與遺傳相關的疾病和其他呼吸道疾病（如慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴張、肺結核等）；妊娠、哺乳期。本研究得到了四川省人民醫院倫理委員會批準（批準文號：2017年103號），所有參與者簽署書面知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 炎癥表型
采用血清IgE和FeNO評估患者氣道炎癥。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb[10-12]為條件進一步篩選CA或CVA患者，并將其定義為Th2傾向型哮喘。
1.2.2 PBMC分離和RNA提取
乙二胺四乙酸抗凝管（6 mL）收集外周血。用淋巴細胞分離液（Ficoll-Paque，北京康為世紀生物科技有限公司）在2 h內分離出PBMC。總RNA提取按照生產廠家（北京康為世紀生物科技有限公司）的說明書使用Trizol試劑進行。用Nanodrop檢測提取RNA的純度，RNA儲存在–80 ℃的冰箱中，以便進一步分析。
1.2.3 全長轉錄組測序和數據分析
基因全長轉錄組測序分析由北京百邁客生物科技有限公司協助完成。P<0.05和fold change（FC）≥1.5被認為是差異表達基因（ differentially expressed genes，DEGs），利用基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對生物過程進行分析并篩選差異基因。將篩選的差異基因輸入STRING數據庫，確定差異基因對應蛋白之間可能存在的相互作用關系，構建蛋白–蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡結構圖。應用Cytoscope中的CytoNCA插件對中間中心進行排序為標準，選擇前1/4個基因，通過MCODE插件Cytoscope識別PPI網絡中最關鍵的模塊。
1.2.4 RT-PCR驗證差異基因表達
選擇DEGs并設計相應引物，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測差異基因mRNA表達。使用Aidlab的TUREscript 1st Stand cDNA Synthesis Kit進行反轉錄，獲得cDNA，并將其作為模板，使用實時PCR儀（analytikjena-Easycycl，德國）根據PCR擴增試劑盒說明書對PBMC的mRNA樣本進行擴增。PCR反應參數為：95 ℃，3 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，連續39個循環，樣品設置3個平行重復孔。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶作為內參，用2–△△Ct計算各靶點的相對基因表達量。
1.3 統計學方法
采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料符合正態分布的以均數±標準差（±s）表示，正態分布的數據組間比較采用單因素方差分析，利用Bonferroni進行校正，多重比較中檢驗水準α=0.05/比較次數。不符合正態分布的數據采用中位數（四分位數）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用非參數獨立樣本Kruskal-Wallis H檢驗；計數資料采用例數表示，組間比較采用χ2檢驗。利用Wallenius非中心超幾何分布的GOseq R包（4.3版本）進行DEGs的基因本體富集分析，應用KOBAS[13]軟件對差異基因進行KEGG統計富集分析。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
31例哮喘患者和7例HC的臨床特征見表1。31例哮喘患者中，CA組20例，CVA組11例。CA、CVA和HC組在性別、年齡、BMI和PEF均無顯著差異（P>0.05）。CA和CVA組IgE、FeNO水平明顯高于HC組（P<0.05），而CA組與CVA組間差異無統計學意義（P>0.05）。CA組血液嗜酸性粒細胞計數高于HC組，但CVA與HC和CA組間無明顯差異（P>0.05）。以IgE>60 IU/mL和FeNO>40 ppb為條件篩選出Th2傾向型CA患者9例，Th2傾向型CVA患者5例。
表1
受試者入組時的臨床特征［（）/例/M（P25，P75）］
2.2 差異基因分析
在基因表達水平上，CA組和CVA組之間有177個DEGs，其中上調基因94個，下調基因83個。CA組與HC組之間共存在949個DEGs，其中上調基因478個，下調基因471個。CVA組與HC組比較，有532個DEGs，其中290個基因上調，242個基因下調。進一步分組分析，Th2傾向型CA組與Th2傾向型CVA組之間共存在300個差異表達，其中155個（52%）基因相對上調，145個（48%）基因相對下調。與HC組相比，Th2傾向型CA組有832個DEGs，其中385個（46%）相對上調，447個（51%）相對下調。與HC組相比，Th2傾向型CVA組有275個（48%）基因相對表達上調，296個（52%）基因相對表達下調。結果見圖1。
圖1
三組間DEGs火山圖
a. Th2傾向型CA組與Th2傾向型CVA組；b. Th2傾向型CA組與HC組；c. Th2傾向型CVA組與HC組。紅色表示上調基因，綠色表示下調基因，黑色表示無差異基因。
2.3 GO富集分析
基因差異表達的GO注釋主要包括生物過程、細胞組分和分子功能。HC與Th2傾向型CA之間生物過程DEGs主要富集于有機氮化合物合成、主動脈發育和藥物反應；細胞組分DEGs主要富集在細胞質中；分子功能DEGs主要富集在ATP結合等活性分子功能中。在Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間的生物過程中，DEGs主要富集在藥物反應和氮化合物生物合成；細胞組分DEGs主要富集在細胞質基質、細胞質等部位；分子功能DEGs主要富集在蛋白結合、ATP結合等活性分子功能中。在HC和Th2傾向型CVA生物過程DEGs主要富集在上皮細胞遷移和藥物反應的正向調控中，細胞組分的DEGs主要富集在細胞質中；分子功能DEGs主要富集在活性分子功能中，如ATP結合分子功能。結果如圖2所示。
圖2
三組間GO注釋圖比較
a. Th2傾向型CA組和Th2傾向型CVA組；b. Th2傾向型CA組和HC組；c. Th2傾向型CVA組和HC組。直方圖顏色表示GO功能分類，紅色代表生物過程，黃色代表細胞組分，藍色代表分子功能；y軸為GO項；x軸表示–log10（KS），KS是Kolmogorov-Smirnov檢驗（KS test）得到的
2.4 KEGG通路分析
KEGG分析顯示，Th2傾向型CA與Th2傾向型CVA的DEGs主要富集在2-氧羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒性信號通路中，Th2傾向型CA與HC的DEGs主要富集在血管平滑肌收縮等信號通路中，Th2傾向型CVA與HC的DEGs主要富集在其他類型的o-聚糖生物合成中。結果如圖3所示。
圖3
三組間DEGsKEGG通路富集散點圖比較
a. Th2傾向型CA組與Th2傾向型CVA組；b. Th2傾向型CA組與HC組；c. Th2傾向型CVA組與HC組。圖中每一個圓表示一個KEGG通路，縱坐標表示通路名稱，橫坐標為富集因子，表示差異基因中注釋到某通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值。富集因子越大，表示DEGs在該通路中的富集水平越顯著。圓圈的顏色代表
2.5 PPI 網絡分析
將差異基因輸入STRING數據庫（版本11.5），構建中等置信度（相互作用得分0.40）的PPI網絡，刪除邊緣處的非相互作用蛋白。PPI網絡分析結果表明，不同基因之間存在復雜的相互關系，不同基因之間存在廣泛的蛋白質相互作用。不同基因相關的關鍵模塊包括GZMB、TBX21、RUNX3、IL2RB、B3GAT1、PPBP、IFIT1、IFIT3、IFIT4、IFIT2、TNFSF10、TLR2、CCR2、CD69、XAF1、CCRL2、PRF1基因（圖4）。結合GO、KEGG、PPI分析，篩選出高表達、顯著富集的差異基因和蛋白–蛋白相互作用密集的基因，從中篩選了10個DEGs（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）作為候選基因，通過后續實時PCR進行驗證，引物設計見表2。
圖4
PPI分析圖
a. 順序基于Betweenness Centralit值，紅色表示Betweenness Centralit值的前四分之一；b. . PPI網絡分析中最關鍵的模塊，包括17個節點和60邊。
表2
10個候選基因實時PCR檢測引物列表
2.6 候選DEGs的RT-PCR驗證
RT-PCR結果顯示，PBMC中CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X的表達在Th2傾向型CA組和Th2傾向型CVA組，以及Th2傾向型CA組和HC組之間存在顯著差異（P<0.05），表達量上調。PF4在PBMC中的表達僅在Th2傾向型CA組和HC組之間差異有統計學意義（P<0.05）。HLA-A、DUSP2、CCR2在Th2傾向型CA組、Th2傾向型CVA組和HC組之間差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表3。
表3
各組候選基因相對表達量比較（）
3 討論
哮喘是一種常見的慢性呼吸道疾病，本質上是慢性氣道炎癥。哮喘的生理特征主要表現為氣道高反應性和氣道重塑。近幾十年來，人們進行了大量的基礎和臨床研究，以發現哮喘發生發展的原因和潛在機制，但其發病機制尚未明確，哮喘發病率居高不下。研究表明哮喘是一種表型不同的異質性疾病，Th2型哮喘是哮喘最重要的表型之一，占成人哮喘的60%以上[14]。CVA是一種非典型哮喘，其發病機制與CA相似，可能受Th2細胞的影響，Th1/Th2免疫失衡也與CVA的發生有關[15]。CVA被認為是哮喘的早期階段，30%～40%的CVA病例未經標準化治療會在3～4年內發展為CA，但其發病機制尚不清楚，環境因素和遺傳因素可促進哮喘的發生。
在本研究中，我們使用三代全長轉錄組測序分析，發現Th2傾向型CA、Th2傾向型CVA和HC的PBMC基因表達譜存在顯著差異。Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間共篩選出300個DEGs，其中155個相對表達水平上調，145個相對表達水平下調。GO功能富集分析表明，Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA的DEGs與藥物反應、氮化合物生物合成、細胞質基質、細胞質、蛋白質結合、ATP結合等生物學過程密切相關。KEGG通路主要富集在2-羥基羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒性等信號通路中。通過GO、KEGG和PPI分析篩選出10個候選基因（TMSB4X、PPBP、PF4、HLA-A、GZMB、CLU、DUSP2、PRF1、PTGS1和CCR2）。我們通過RT-PCR驗證候選基因的結果，發現CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1、TMSB4X在Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間存在顯著差異，且在Th2傾向型CA表達水平上調明顯高于Th2傾向型CVA。
病理生理改變如支氣管炎、平滑肌痙攣和氣道黏液分泌增加已在Th2型哮喘中顯示出來，通常由Th2細胞釋放的白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5和IL-13引起。IL-5參與嗜酸性粒細胞進入氣道的激活和遷移，并引發嗜酸性氣道炎癥[16]。IL-13在黏液高分泌和氣道高反應性中起主要作用。IL-4誘導B細胞IgE同型轉換，上調靶細胞表面高親和IgE受體（FcεRI）。肥大細胞在質膜表面的FcεRI結合IgE的過敏誘導交聯后被激活。肥大細胞釋放組胺和其他介質，導致過敏癥狀[17]。Th2免疫應答是哮喘病理生理的主要因素，也受多種信號通路的調控，如PGD2-CRTH2、Wnt/β-catenin-FAM13A和JNK-Gal-7[18]。先天淋巴細胞在免疫應答中起保護作用，NK細胞是先天淋巴細胞家族的成員，NK細胞在調節過敏性氣道炎癥中起關鍵作用，NK細胞的數量與哮喘的嚴重程度相關，NK細胞可以通過兩種不同的途徑介導其細胞毒活性[19]。它們可以釋放含有穿孔素和顆粒酶的細胞毒顆粒，或在病變細胞表面分別表達TRAIL或Fas配體與TRAIL-r1/-R2或CD95/Fas結合，誘導死亡受體介導的凋亡[20]。研究發現哮喘患者與健康對照組的痰代謝譜存在差異，這些不同的代謝物主要涉及甘油磷脂代謝、2-氧羧酸代謝和氨基酸生物合成等代謝途徑[21]。在本研究中，我們發現Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間的DEGs主要富集在2-氧羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒信號轉導通路中，提示上述信號通路可能與其差異有關。
簇集蛋白（clusterin，CLU）是一種敏感的氧化應激細胞生物傳感器，廣泛參與免疫調節、細胞粘附、細胞-細胞相互作用、細胞分化和轉化調節、細胞周期調節、DNA修復等重要生物活動，被認為是氧化應激的指標。既往研究表明，哮喘患者的血清和痰中CLU水平升高[22]。血清CLU水平與哮喘嚴重程度呈正相關，哮喘越嚴重，血清CLU水平越高；CLU也被認為是哮喘患者哮喘嚴重程度和氧化應激的生物標志物[23]。本研究中，與Th2傾向型CVA相比，Th2傾向型CA的CLU表達明顯上調，Th2傾向型CVA的CLU表達較HC組增加。Th2傾向型CA的發病機制可能與CLU有關，為CVA在遺傳水平上是哮喘的早期階段提供了有利的證據。PTGS1基因位于染色體9q32-q33.3上，全長約22 kb，編碼環氧化酶-1（cyclooxygenase-1，COX-1）。環氧化酶是一種催化前列腺素生物合成的關鍵酶，也是哮喘炎癥的重要中介因子。研究表明，PTGS1基因變異與哮喘之間存在關聯[24]。顆粒酶B（granzyme B，GZMB）是一種28 kDa絲氨酸蛋白酶，被認為局限于淋巴系，是顆粒介導的細胞毒性的主要效應物[25]。GZMB和IL-13能夠同時誘導嗜堿性粒細胞，并且發現支氣管肺泡灌洗液中的兩種介質在哮喘過敏性反應晚期患者中高度相關。GZMB被認為是一種新的嗜堿性粒細胞來源的過敏性炎癥介質[25]。穿孔蛋白1（pore forming protein，PRF1）屬于膜攻擊復合物/PRF（MACPF）蛋白家族，主要參與細胞毒性T淋巴細胞和NK細胞的顆粒依賴性殺傷活性，可作為具有殺傷能力的免疫細胞的明確標志物[26]。PRF1參與免疫和炎癥介導疾病的發病機制。TMSB4X基因編碼一種肌動蛋白螯合蛋白，該蛋白在調節肌動蛋白聚合中起作用，也參與細胞增殖、遷移和分化[27]，目前還沒有研究表明其與哮喘有關。
我們的研究存在以下局限性：（1）因目前對Th2型炎癥未形成統一的診斷標準，故本文查閱文獻篩選出了二個節點值定義為Th2型傾向型；（2）因為CVA患者通常很少，導致本研究中Th2傾向型CVA亞組樣本量相對較小；（3）雖然我們使用FeNO等指標來區分氣道炎癥，但沒有使用誘導痰檢查來進一步鑒別氣道炎癥的亞型。
綜上所述，我們發現6個關鍵基因CLU、GZMB、PPBP、PRF1、PTGS1和TMSB4X在Th2傾向型CA和Th2傾向型CVA之間存在差異表達，這些DEGs主要富集在2-氧羧酸代謝和自然殺傷細胞介導的細胞毒性信號通路中。本研究發現的基因可能預測哮喘分子水平的亞型變化，并與CVA向CA的進展有關，但CVA向CA進展的具體機制尚需進一步闡明。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
