引用本文： 馬梓文, 張麗, 鄧稞, 王霽, 李敏, 王剛. 輕中度哮喘支氣管舒張試驗預測模型構建研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(3): 189-196. doi: 10.7507/1671-6205.202303080 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病，癥狀包括反復發作的喘息、胸悶、呼吸困難或咳嗽，并伴有可變的呼出氣流受限[1]。當前哮喘診斷標準，要求結合典型的哮喘臨床癥狀、體征與任一可變呼出氣流受限的確切證據，并排除其他呼吸系統疾病。可變的呼出氣流受限檢測是哮喘診斷的關鍵依據，包括支氣管舒張試驗（bronchodilator reversibility test，BDT）、支氣管激發試驗（bronchial challenge test，BCT）與呼出氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）變異率測定等[2]。BDT是通過患者吸入標準劑量支氣管舒張劑后通氣功能的改善情況來判斷是否存在可逆性氣流受限，BCT則是根據吸入標準劑量激發劑后通氣功能下降的情況判斷是否存在氣道高反應性。基于患者安全性考慮，哮喘診斷指南推薦，BCT適用于第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）占預計值百分比（FEV1%pred）≥70%的患者[3-5]，而當患者存在中度及以上氣流受限（FEV1% pred<70%）時，則應進行BDT。因BDT簡便、經濟和安全的特點，在不能常規開展BCT的醫療機構已得到廣泛應用。
BDT除了用于哮喘診斷外，亦應用于哮喘評估。我們前期確定了支氣管舒張可逆性（bronchodilator reversibility，BDR）高的哮喘表型（BDRHigh），此種哮喘表型與嗜酸性粒細胞氣道炎癥和Type 2型炎癥相關，且對抗哮喘治療有較好的療效反應[6]。因此，在新藥臨床研究中，常常將BDT陽性作為非常重要的受試者入選標準之一[7-8]。然而，診斷明確的哮喘患者有哪些因素與BDR相關，是否可基于此類哮喘患者建立一個臨床模型來預測BDT結果，仍是一個有待探索的問題。
本研究采用橫斷面設計，納入BCT陽性哮喘確診患者，進行BDT，比較BDT陽性組和BDT陰性組患者的臨床及炎癥特征差異，分析與BDT相關的危險因素，同時基于臨床實踐可行性的不同狀況，構建不同的哮喘患者BDT陽性的預測模型。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究為一項橫斷面設計，基于澳亞重癥哮喘協作網（Australasian Severe Asthma Network，ASAN），連續納入2014年1月—2021年10月四川大學華西醫院哮喘專病門診患者。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）通過BCT陽性確診為哮喘；（3）FEV1%pred≥70%；（4）符合哮喘慢性持續期標準，近1個月無急性發作或上呼吸道感染；（5）自愿簽署知情同意書。排除標準：（1）合并除哮喘外的其他呼吸系統疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺間質纖維化、肺結核、氣胸、肺不張等；（2）合并未控制的高血壓、糖尿病、惡性腫瘤等其他系統慢性疾病；（3）既往胸部手術史；（4）無法完成肺功能、BDT及誘導痰采集；（5）因理解問題無法完成問卷填寫；（6）研究者認為不適合參與本研究的情況。本研究實施之前已通過四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審批，并完成臨床試驗注冊（注冊號：ChiCTR-OOC-16009529）。
1.2 社會人口學與臨床信息采集
建立結構性的病例報告表，收集患者的性別、年齡等一般社會人口學數據。并采集吸煙情況、哮喘病程、哮喘用藥情況、哮喘控制水平、哮喘癥狀嚴重程度、哮喘相關生活質量等臨床信息。患者每日使用吸入性糖皮質激素（inhaled corticosteroid，ICS）劑量根據GINA指南換算為二丙酸倍氯米松（beclometasone dipropionate，BDP）當量。
1.2.1 哮喘控制水平及癥狀嚴重程度評估
完成哮喘控制水平、哮喘癥狀評分、哮喘相關生活質量及哮喘用藥情況評估。應用哮喘控制問卷（Asthma Control Questionnaire-6，ACQ-6）[9]來評估患者哮喘控制水平，ACQ-6問卷每個問題分值為0～6分，計算平均分。采用視覺評分量表（Visual Analogue Scale，VAS）評估患者呼吸困難、喘息、咳嗽、胸悶癥狀的嚴重程度。哮喘相關生活質量采用標準化哮喘生活質量問卷（Asthma Questionnaire of Life Quality，AQLQ）[10]進行評估。
1.2.2 實驗室檢查
患者在華西醫院檢驗科采集空腹血，完成外周血常規檢查（Sysmex XN9000，日本）及血清總IgE測定（Beckman DxI-800，美國）。
1.2.3 呼出氣一氧化氮檢測
患者在專業技術人員指導下，參照美國胸科協會標準化操作規程[11]，完成呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）測定（NIOX VERO，Circassia，瑞典）。
1.2.4 肺功能檢查及BDT
肺功能測定及BDT遵循美國胸科協會/歐洲呼吸病學會肺功能測定標準化操作規程[12]，采用標準化肺功能儀（Medical Graphics Corporation，美國）于華西醫院哮喘臨床研究平臺進行。進行肺功能檢測前要求患者停用哮喘藥物24 h，重復測量3次，記錄患者最佳的FEV1、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、最大中段呼氣流速（maximal mid-expiratory flow，MMEF）等指標。在基線肺功能測定后，經儲霧罐吸入硫酸沙丁胺醇氣霧劑400 μg（商品名萬托林，Glaxo Smith Kline，西班牙），15 min后再次測定肺功能。根據沙丁胺醇使用前后FEV1的變化值（ΔFEV1）和FEV1變化的百分比（ΔFEV1%）評估BDR，BDT陽性判定標準為ΔFEV1%>12%且ΔFEV1>200 mL[1]。根據BDT結果將患者分為BDT陽性組與BDT陰性組。
1.2.5 痰誘導及痰標本處理
痰誘導和痰處理參考我們前期研究的規范化操作流程[13-14]。患者完成BDT后，使用超聲霧化吸入器（HEYER Medical AG，德國）予4.5%高滲鹽水霧化吸入20 min，吸入中途囑患者咳痰，用標本杯收集患者誘導痰標本。痰標本收集完成后，4 ℃低溫儲存，2 h內冷鏈運輸至標本處理平臺。取100 μL～1 mL誘導痰黏液塊置于15 mL離心管中，加入4倍黏液塊體積的0.1%二硫蘇糖醇，室溫混勻30～60 min，待黏液塊分散溶解，加入與二硫蘇糖醇等體積的磷酸鹽緩沖液，48 μm孔徑尼龍布過濾后2500 r/min離心10 min，取細胞沉淀加入4倍黏液塊體積的磷酸鹽緩沖液重懸。取20 μL細胞懸液與等體積臺盼藍混勻后進行細胞活力檢測和細胞計數，調整細胞懸液濃度為1×106個/mL后，取70 μL懸液，細胞離心涂片機（Wescor，美國）制作細胞涂片。細胞涂片干燥后，采用邁格吉染色法進行染色，進行炎癥細胞分類計數，每張涂片至少計數400個細胞。
1.3 統計學方法
采用SPSS 26和R 4.1.0軟件進行統計分析。正態分布的連續變量采用均數±標準差（
±s）描述，否則采用中位數（四分位數）［M（Q1，Q3）］描述；分類變量應用百分比或率描述。組間比較根據數據類型及分布情況使用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗或χ2檢驗，相關性分析使用點二列相關、Pearson積矩相關及Spearman秩相關。對與BDR存在相關關系且P<0.05的變量進行多元logistic回歸分析，探索與BDT陽性相關的臨床特征與炎性指標。雙側檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。
將全部受試者納入模型訓練集，以社會人口學、哮喘控制、基礎肺功能、外周血嗜酸性粒細胞、誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO作為自變量，以BDT陽性為二分類因變量，使用R包{glmnet}、{rms}進行LASSO回歸[15-16]，不設置種子進行多次擬合，調和參數λ取一倍標準誤[17]。選取LASSO回歸得出的變量進行logistic回歸構建預測模型，采用Hosmer-Lemeshow檢驗判別模型的擬合優度，繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計算ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC），通過計算模型的區分度、校準度對模型進行評價。使用R包{boot}進行bootstrap法內部驗證，重復采樣500次后計算模型校正一致性指數（concordance index，C指數）及其95%置信區間。
2 結果
2.1 研究人群人口學及哮喘臨床特征
本研究共篩選BCT陽性且FEV1%pred≥70%的哮喘患者348例，14例未能完成BDT，最終納入334例哮喘患者，其中BDT陽性組94例，陰性組240例。患者納入流程見圖1。在哮喘臨床特征方面，BDT陽性組每日ICS用量低（P=0.028）且具有較差的哮喘控制水平（ACQ：P=0.001）和生活質量（AQLQ：P=0.016）。BDT陽性組基線FEV1、FEV1%pred、FEV1與FVC的比值（FEV1/FVC）均低于BDT陰性組（P均<0.001）；舒張后BDT陽性組FEV1/FVC仍低于BDT陰性組（P均<0.001），但兩組間FEV1比較，差異無統計學意義。兩組在性別、年齡、體重指數（body mass index，BMI）、吸煙、病程等指標間的差異無統計學意義。詳情見表1。
圖1
患者納入流程圖
表1
人口學及臨床特征組間差異比較［例（%）/（
）/M（Q1，Q3）］
2.2 炎癥指標及IgE水平組間差異比較
在全身炎癥方面，與BDT陰性組比較，BDT陽性組的外周血白細胞計數（P=0.011）、中性粒細胞計數（P=0.004）和百分比（P=0.026）、嗜酸性粒細胞計數（P<0.001）和百分比（P=0.012）明顯增加。氣道炎癥上，誘導痰細胞學分類顯示，BDT陽性組嗜酸性粒細胞計數（P=0.015）和百分比（P=0.028）較BDT陰性組更高，且BDT陽性組具有更高的FeNO（P=0.001），而IgE在兩組間的差異不具有統計學意義。結果見表2。
表2
炎性指標組間差異比較［（
）/M（Q1，Q3）］
2.3 相關性分析與多元logistic回歸
采用點二列相關、Pearson積矩相關及Spearman秩相關分析哮喘患者社會人口學、臨床特征、炎性指標與BDR（ΔFEV1和ΔFEV1%）之間的相關性。結果顯示，與ΔFEV1和ΔFEV1%同時存在相關性的指標包括BMI、ICS用量、ACQ、AQLQ、FEV1%pred、MMEF%pred、FEV1/FVC、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO（均P<0.05）。校正了性別、年齡、病程、BMI、ICS用量、吸煙和過敏的多元回歸分析結果發現，ACQ、AQLQ、FEV1%pred、MMEF%pred、FEV1/FVC、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞及FeNO與BDR存在顯著的相關性（均P<0.05）。結果見表3。
表3
BDT陽性的多因素logistic回歸分析
2.4 LASSO回歸與預測模型建立
以BDT結果為二分類因變量進行的LASSO回歸結果見圖2，基于臨床實踐的可行性，以FEV1%pred、外周血或誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO作為核心潛在變量建立3個預測模型。
圖2
LASSO回歸曲線圖
a. LASSO回歸過程示意圖。左側縱坐標為預測變量的系數，上框線坐標為模型中系數不為零的變量的個數，下框線坐標為調和參數λ以自然對數e為底的對數值。每條曲線表示訓練集中的一個變量，隨著λ參數的增加逐個把意義較小的變量的系數懲罰為0。b. LASSO回歸模型10折交叉驗證過程示意圖。左側縱坐標為模型的二項偏差，上框線坐標為模型預測變量的個數，下框線坐標為log（λ）。紅點表示在LASSO過程中取特定λ時所擬合模型的平均偏差。圖中左側虛線處為偏差最小時的模型［log（λ）=–4.16］，右側虛線處為偏差最小模型的λ增加一倍標準誤時的模型［log（λ）=–3.13］。
模型1包括的預測變量有FEV1%pred、FEV1/FVC、血嗜酸性粒細胞計數和FeNO，AUC為0.810（95%置信區間為0.761～0.860），預測值為0.20，敏感性為90.80%，特異性為60.58%（圖3a）；模型2包括的預測變量有BMI、FEV1%pred、FEV1/FVC、誘導痰嗜酸性粒細胞計數和吸煙包年數，結果顯示AUC為0.834（95%置信區間為0.776～0.892），最佳預測值為0.19，敏感性為96.15%，特異性為61.24%（圖3d）；模型3包括的預測變量有FEV1%pred、FEV1/FVC、血嗜酸性粒細胞計數和吸煙包年數，AUC為0.812（95%置信區間為0.765～0.860），最佳預測值為0.21，敏感性為90.22%，特異性為63.25%（圖3g）。
圖3
預測模型ROC曲線、校準曲線及列線圖
a、d、g分別為模型1、2、3的ROC曲線圖。橫坐標為特異性，縱坐標為敏感性，對角線代表隨機狀態的預測能力，陰影區域為
Hosmer-Lemeshow檢驗結果提示3個模型均具有較好的擬合優度（模型1：χ2=12.389，P=0.135；模型2：χ2=12.443，P=0.133；模型3：χ2=11.173，P=0.192）。進一步對模型進行500次bootstrap重復采樣進行內部驗證，得到模型校正C指數分別為0.810（95%置信區間為0.758～0.864）、0.834（95%置信區間為0.767～0.889）和0.812（95%置信區間為0.766～0.859）。同時繪制校準曲線圖（圖3b、e、 h），提示模型的預測結果與實際結果之間具有較好一致性。
使用R包{rms}的nomogram函數將該模型中的預測因素帶入，繪制列線圖（圖3c、f、i）。將每一位受試者的相關參對應圖中的分值，各項分值相加計算總分，再根據圖中總分軸確定預測概率。
3 討論
我們基于ASAN數據庫，探索了BCT陽性確診的輕中度哮喘患者中與支氣管舒張反應相關的因素，結果發現與BDT陽性相關的因素包括BMI、ICS用量、ACQ、AQLQ、FEV1%pred、FEV1/FVC、MMEF%pred、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO。通過多元回歸分析發現，ACQ、AQLQ、FEV1%pred、MMEF%pred、FEV1/FVC、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞及FeNO與BDR存在顯著的相關性。基于臨床實踐的不同狀況，建立的3個模型的AUC為0.810～0.834，而且3個模型存在較好的擬合優度和C指數。這些結果表明，3個模型均可較好預測BDT陽性結果，該模型的建立為哮喘干預性臨床研究篩選提供了一個可靠的工具。
哮喘新藥或新型干預措施的開發，需要嚴格規范的臨床研究，尤其是隨機對照臨床試驗。為了提高涉及新藥與安慰劑等對照藥物臨床研究的內在真實性（internal validity），則需要對參與研究的受試者的入選標準進行嚴格的定義以保證其同質性。相反，哮喘作為慢性氣道炎癥疾病存在著明顯的異質性（heterogeneity），因此哮喘的臨床研究的設計變得相當復雜而有難度。例如，靶向IL-5的美泊利單抗（mepolizumab）作為附加治療，在早期的臨床研究中，未選擇的哮喘患者并沒有受益[18]。但是，當選擇性納入嗜酸性粒細胞哮喘表型后，美泊利單抗可明顯改善生活質量并減少未來哮喘的急性發作[19]。BDT陽性患者所展現的更多的哮喘癥狀及更差的哮喘控制水平，至少與兩方面的因素有關。第一、與BDT陰性的哮喘患者比較，BDT陽性患者展現出更高的與2型炎癥相關的氣道和全身炎癥；第二、BDT陽性患者存在一定程度的ICS治療不足（undertreatment）。因此，在臨床研究中，選擇BDT陽性的患者，可能對治療的反應會更好。我們的研究也發現，當給予400 μg的沙丁胺醇時，BDT陽性患者的FEV1改善明顯高于BDT陰性哮喘患者。事實上，眾多的臨床研究已開始關注且在哮喘患者的入選條件中增加了BDT陽性的條目，旨在選擇存在比較高的、治療相對不足的同質性比較好的哮喘患者[7-8]。
為加快臨床研究進程，參與臨床試驗的受試者絕大多數源于既往研究或就診登記系統，為了減少擬入選患者的篩選失敗率及篩選費用，勢必有建立BDT預測模型的必要。然而，迄今鮮有研究探索預測BDT模型的可能性。Zhao等[20]回顧性分析了384例門診哮喘患者，發現外周血嗜酸性粒細胞預測BDT陽性患者的AUC為0.707，敏感性和特異性分別為63.0%和71.8%。我們建立的模型在預測BDT的準確性方面明顯優于Zhao等[20]的研究，AUC為0.810～0.834，而且我們為特定的臨床篩選環境建立了不同的模型。例如，在缺乏痰誘導的基層或研究醫療機構，可采用模型1或3，在同時缺乏FeNO的醫療機構，則可應用模型3。
本研究還發現基線FEV1及MMEF在BDT陽性組患者中更低，且與BDR呈顯著負相關關系，并在模型中是兩項穩定的BDT陽性預測指標。FEV1通常代表氣道整體的通氣功能，其在BDT中的擴張程度受氣道最大口徑影響。與既往研究結果一致，在哮喘患者中，BDT陽性者具有更明顯的氣道阻塞、殘氣量及氣道阻力，且基線FEV1%pred水平與BDR呈顯著負相關關系[21]。這在一定程度上可能是因為在較低基線水平時更容易達到根據FEV1變化程度定義的BDT陽性標準。MMEF主要反映小氣道通氣功能水平，既往研究表明小氣道通氣功能障礙會先于FEV1下降出現。盡管本研究納入的人群FEV1%pred≥70%，該人群的MMEF已存在不同程度的受損并與BDR存在相關性，提示在此人群中采用小氣道指標為基礎進行BDT或可改善其敏感性而用于輕度氣道阻塞可疑哮喘患者的診斷[22]。
本研究亦存在一定的局限性。首先，本研究以肺功能水平輕中度受損哮喘人群為對象，盡管我們的內部驗證提示模型具有較好的一致性，但樣本量仍然相對較小。其次，模型中肺功能、炎癥指標間可能存在共線性，需考慮他們間可能存在中介或交互效應。
綜上，本研究探索了輕中度氣道阻塞的哮喘患者與BDT陽性相關的臨床和炎癥特征，首次構建了不同臨床實踐狀況下的BDT陽性的預測模型，使臨床醫師或研究人員，特別是處于條件有限的基層醫療機構的醫務人員亦可通過相對簡單易得的臨床指標計算列線圖積分，預測哮喘患者的BDT陽性的概率，為哮喘臨床研究或哮喘評估提供了一項新的參考工具。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
致謝：感謝分子網絡前沿科學研究中心肺免疫炎癥研究室林芝技師在痰標本處理方面所作的工作。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質性疾病，癥狀包括反復發作的喘息、胸悶、呼吸困難或咳嗽，并伴有可變的呼出氣流受限[1]。當前哮喘診斷標準，要求結合典型的哮喘臨床癥狀、體征與任一可變呼出氣流受限的確切證據，并排除其他呼吸系統疾病。可變的呼出氣流受限檢測是哮喘診斷的關鍵依據，包括支氣管舒張試驗（bronchodilator reversibility test，BDT）、支氣管激發試驗（bronchial challenge test，BCT）與呼出氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）變異率測定等[2]。BDT是通過患者吸入標準劑量支氣管舒張劑后通氣功能的改善情況來判斷是否存在可逆性氣流受限，BCT則是根據吸入標準劑量激發劑后通氣功能下降的情況判斷是否存在氣道高反應性。基于患者安全性考慮，哮喘診斷指南推薦，BCT適用于第1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）占預計值百分比（FEV1%pred）≥70%的患者[3-5]，而當患者存在中度及以上氣流受限（FEV1% pred<70%）時，則應進行BDT。因BDT簡便、經濟和安全的特點，在不能常規開展BCT的醫療機構已得到廣泛應用。
BDT除了用于哮喘診斷外，亦應用于哮喘評估。我們前期確定了支氣管舒張可逆性（bronchodilator reversibility，BDR）高的哮喘表型（BDRHigh），此種哮喘表型與嗜酸性粒細胞氣道炎癥和Type 2型炎癥相關，且對抗哮喘治療有較好的療效反應[6]。因此，在新藥臨床研究中，常常將BDT陽性作為非常重要的受試者入選標準之一[7-8]。然而，診斷明確的哮喘患者有哪些因素與BDR相關，是否可基于此類哮喘患者建立一個臨床模型來預測BDT結果，仍是一個有待探索的問題。
本研究采用橫斷面設計，納入BCT陽性哮喘確診患者，進行BDT，比較BDT陽性組和BDT陰性組患者的臨床及炎癥特征差異，分析與BDT相關的危險因素，同時基于臨床實踐可行性的不同狀況，構建不同的哮喘患者BDT陽性的預測模型。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究為一項橫斷面設計，基于澳亞重癥哮喘協作網（Australasian Severe Asthma Network，ASAN），連續納入2014年1月—2021年10月四川大學華西醫院哮喘專病門診患者。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）通過BCT陽性確診為哮喘；（3）FEV1%pred≥70%；（4）符合哮喘慢性持續期標準，近1個月無急性發作或上呼吸道感染；（5）自愿簽署知情同意書。排除標準：（1）合并除哮喘外的其他呼吸系統疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺間質纖維化、肺結核、氣胸、肺不張等；（2）合并未控制的高血壓、糖尿病、惡性腫瘤等其他系統慢性疾病；（3）既往胸部手術史；（4）無法完成肺功能、BDT及誘導痰采集；（5）因理解問題無法完成問卷填寫；（6）研究者認為不適合參與本研究的情況。本研究實施之前已通過四川大學華西醫院臨床試驗與生物醫學倫理專委會審批，并完成臨床試驗注冊（注冊號：ChiCTR-OOC-16009529）。
1.2 社會人口學與臨床信息采集
建立結構性的病例報告表，收集患者的性別、年齡等一般社會人口學數據。并采集吸煙情況、哮喘病程、哮喘用藥情況、哮喘控制水平、哮喘癥狀嚴重程度、哮喘相關生活質量等臨床信息。患者每日使用吸入性糖皮質激素（inhaled corticosteroid，ICS）劑量根據GINA指南換算為二丙酸倍氯米松（beclometasone dipropionate，BDP）當量。
1.2.1 哮喘控制水平及癥狀嚴重程度評估
完成哮喘控制水平、哮喘癥狀評分、哮喘相關生活質量及哮喘用藥情況評估。應用哮喘控制問卷（Asthma Control Questionnaire-6，ACQ-6）[9]來評估患者哮喘控制水平，ACQ-6問卷每個問題分值為0～6分，計算平均分。采用視覺評分量表（Visual Analogue Scale，VAS）評估患者呼吸困難、喘息、咳嗽、胸悶癥狀的嚴重程度。哮喘相關生活質量采用標準化哮喘生活質量問卷（Asthma Questionnaire of Life Quality，AQLQ）[10]進行評估。
1.2.2 實驗室檢查
患者在華西醫院檢驗科采集空腹血，完成外周血常規檢查（Sysmex XN9000，日本）及血清總IgE測定（Beckman DxI-800，美國）。
1.2.3 呼出氣一氧化氮檢測
患者在專業技術人員指導下，參照美國胸科協會標準化操作規程[11]，完成呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）測定（NIOX VERO，Circassia，瑞典）。
1.2.4 肺功能檢查及BDT
肺功能測定及BDT遵循美國胸科協會/歐洲呼吸病學會肺功能測定標準化操作規程[12]，采用標準化肺功能儀（Medical Graphics Corporation，美國）于華西醫院哮喘臨床研究平臺進行。進行肺功能檢測前要求患者停用哮喘藥物24 h，重復測量3次，記錄患者最佳的FEV1、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、最大中段呼氣流速（maximal mid-expiratory flow，MMEF）等指標。在基線肺功能測定后，經儲霧罐吸入硫酸沙丁胺醇氣霧劑400 μg（商品名萬托林，Glaxo Smith Kline，西班牙），15 min后再次測定肺功能。根據沙丁胺醇使用前后FEV1的變化值（ΔFEV1）和FEV1變化的百分比（ΔFEV1%）評估BDR，BDT陽性判定標準為ΔFEV1%>12%且ΔFEV1>200 mL[1]。根據BDT結果將患者分為BDT陽性組與BDT陰性組。
1.2.5 痰誘導及痰標本處理
痰誘導和痰處理參考我們前期研究的規范化操作流程[13-14]。患者完成BDT后，使用超聲霧化吸入器（HEYER Medical AG，德國）予4.5%高滲鹽水霧化吸入20 min，吸入中途囑患者咳痰，用標本杯收集患者誘導痰標本。痰標本收集完成后，4 ℃低溫儲存，2 h內冷鏈運輸至標本處理平臺。取100 μL～1 mL誘導痰黏液塊置于15 mL離心管中，加入4倍黏液塊體積的0.1%二硫蘇糖醇，室溫混勻30～60 min，待黏液塊分散溶解，加入與二硫蘇糖醇等體積的磷酸鹽緩沖液，48 μm孔徑尼龍布過濾后2500 r/min離心10 min，取細胞沉淀加入4倍黏液塊體積的磷酸鹽緩沖液重懸。取20 μL細胞懸液與等體積臺盼藍混勻后進行細胞活力檢測和細胞計數，調整細胞懸液濃度為1×106個/mL后，取70 μL懸液，細胞離心涂片機（Wescor，美國）制作細胞涂片。細胞涂片干燥后，采用邁格吉染色法進行染色，進行炎癥細胞分類計數，每張涂片至少計數400個細胞。
1.3 統計學方法
采用SPSS 26和R 4.1.0軟件進行統計分析。正態分布的連續變量采用均數±標準差（±s）描述，否則采用中位數（四分位數）［M（Q1，Q3）］描述；分類變量應用百分比或率描述。組間比較根據數據類型及分布情況使用t檢驗、Mann-Whitney U檢驗或χ2檢驗，相關性分析使用點二列相關、Pearson積矩相關及Spearman秩相關。對與BDR存在相關關系且P<0.05的變量進行多元logistic回歸分析，探索與BDT陽性相關的臨床特征與炎性指標。雙側檢驗，P≤0.05為差異有統計學意義。
將全部受試者納入模型訓練集，以社會人口學、哮喘控制、基礎肺功能、外周血嗜酸性粒細胞、誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO作為自變量，以BDT陽性為二分類因變量，使用R包{glmnet}、{rms}進行LASSO回歸[15-16]，不設置種子進行多次擬合，調和參數λ取一倍標準誤[17]。選取LASSO回歸得出的變量進行logistic回歸構建預測模型，采用Hosmer-Lemeshow檢驗判別模型的擬合優度，繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線并計算ROC曲線下面積（area under the ROC curve，AUC），通過計算模型的區分度、校準度對模型進行評價。使用R包{boot}進行bootstrap法內部驗證，重復采樣500次后計算模型校正一致性指數（concordance index，C指數）及其95%置信區間。
2 結果
2.1 研究人群人口學及哮喘臨床特征
本研究共篩選BCT陽性且FEV1%pred≥70%的哮喘患者348例，14例未能完成BDT，最終納入334例哮喘患者，其中BDT陽性組94例，陰性組240例。患者納入流程見圖1。在哮喘臨床特征方面，BDT陽性組每日ICS用量低（P=0.028）且具有較差的哮喘控制水平（ACQ：P=0.001）和生活質量（AQLQ：P=0.016）。BDT陽性組基線FEV1、FEV1%pred、FEV1與FVC的比值（FEV1/FVC）均低于BDT陰性組（P均<0.001）；舒張后BDT陽性組FEV1/FVC仍低于BDT陰性組（P均<0.001），但兩組間FEV1比較，差異無統計學意義。兩組在性別、年齡、體重指數（body mass index，BMI）、吸煙、病程等指標間的差異無統計學意義。詳情見表1。
圖1
患者納入流程圖
表1
人口學及臨床特征組間差異比較［例（%）/（）/M（Q1，Q3）］
2.2 炎癥指標及IgE水平組間差異比較
在全身炎癥方面，與BDT陰性組比較，BDT陽性組的外周血白細胞計數（P=0.011）、中性粒細胞計數（P=0.004）和百分比（P=0.026）、嗜酸性粒細胞計數（P<0.001）和百分比（P=0.012）明顯增加。氣道炎癥上，誘導痰細胞學分類顯示，BDT陽性組嗜酸性粒細胞計數（P=0.015）和百分比（P=0.028）較BDT陰性組更高，且BDT陽性組具有更高的FeNO（P=0.001），而IgE在兩組間的差異不具有統計學意義。結果見表2。
表2
炎性指標組間差異比較［（）/M（Q1，Q3）］
2.3 相關性分析與多元logistic回歸
采用點二列相關、Pearson積矩相關及Spearman秩相關分析哮喘患者社會人口學、臨床特征、炎性指標與BDR（ΔFEV1和ΔFEV1%）之間的相關性。結果顯示，與ΔFEV1和ΔFEV1%同時存在相關性的指標包括BMI、ICS用量、ACQ、AQLQ、FEV1%pred、MMEF%pred、FEV1/FVC、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO（均P<0.05）。校正了性別、年齡、病程、BMI、ICS用量、吸煙和過敏的多元回歸分析結果發現，ACQ、AQLQ、FEV1%pred、MMEF%pred、FEV1/FVC、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞及FeNO與BDR存在顯著的相關性（均P<0.05）。結果見表3。
表3
BDT陽性的多因素logistic回歸分析
2.4 LASSO回歸與預測模型建立
以BDT結果為二分類因變量進行的LASSO回歸結果見圖2，基于臨床實踐的可行性，以FEV1%pred、外周血或誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO作為核心潛在變量建立3個預測模型。
圖2
LASSO回歸曲線圖
a. LASSO回歸過程示意圖。左側縱坐標為預測變量的系數，上框線坐標為模型中系數不為零的變量的個數，下框線坐標為調和參數λ以自然對數e為底的對數值。每條曲線表示訓練集中的一個變量，隨著λ參數的增加逐個把意義較小的變量的系數懲罰為0。b. LASSO回歸模型10折交叉驗證過程示意圖。左側縱坐標為模型的二項偏差，上框線坐標為模型預測變量的個數，下框線坐標為log（λ）。紅點表示在LASSO過程中取特定λ時所擬合模型的平均偏差。圖中左側虛線處為偏差最小時的模型［log（λ）=–4.16］，右側虛線處為偏差最小模型的λ增加一倍標準誤時的模型［log（λ）=–3.13］。
模型1包括的預測變量有FEV1%pred、FEV1/FVC、血嗜酸性粒細胞計數和FeNO，AUC為0.810（95%置信區間為0.761～0.860），預測值為0.20，敏感性為90.80%，特異性為60.58%（圖3a）；模型2包括的預測變量有BMI、FEV1%pred、FEV1/FVC、誘導痰嗜酸性粒細胞計數和吸煙包年數，結果顯示AUC為0.834（95%置信區間為0.776～0.892），最佳預測值為0.19，敏感性為96.15%，特異性為61.24%（圖3d）；模型3包括的預測變量有FEV1%pred、FEV1/FVC、血嗜酸性粒細胞計數和吸煙包年數，AUC為0.812（95%置信區間為0.765～0.860），最佳預測值為0.21，敏感性為90.22%，特異性為63.25%（圖3g）。
圖3
預測模型ROC曲線、校準曲線及列線圖
a、d、g分別為模型1、2、3的ROC曲線圖。橫坐標為特異性，縱坐標為敏感性，對角線代表隨機狀態的預測能力，陰影區域為
Hosmer-Lemeshow檢驗結果提示3個模型均具有較好的擬合優度（模型1：χ2=12.389，P=0.135；模型2：χ2=12.443，P=0.133；模型3：χ2=11.173，P=0.192）。進一步對模型進行500次bootstrap重復采樣進行內部驗證，得到模型校正C指數分別為0.810（95%置信區間為0.758～0.864）、0.834（95%置信區間為0.767～0.889）和0.812（95%置信區間為0.766～0.859）。同時繪制校準曲線圖（圖3b、e、 h），提示模型的預測結果與實際結果之間具有較好一致性。
使用R包{rms}的nomogram函數將該模型中的預測因素帶入，繪制列線圖（圖3c、f、i）。將每一位受試者的相關參對應圖中的分值，各項分值相加計算總分，再根據圖中總分軸確定預測概率。
3 討論
我們基于ASAN數據庫，探索了BCT陽性確診的輕中度哮喘患者中與支氣管舒張反應相關的因素，結果發現與BDT陽性相關的因素包括BMI、ICS用量、ACQ、AQLQ、FEV1%pred、FEV1/FVC、MMEF%pred、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞和FeNO。通過多元回歸分析發現，ACQ、AQLQ、FEV1%pred、MMEF%pred、FEV1/FVC、外周血和誘導痰嗜酸性粒細胞及FeNO與BDR存在顯著的相關性。基于臨床實踐的不同狀況，建立的3個模型的AUC為0.810～0.834，而且3個模型存在較好的擬合優度和C指數。這些結果表明，3個模型均可較好預測BDT陽性結果，該模型的建立為哮喘干預性臨床研究篩選提供了一個可靠的工具。
哮喘新藥或新型干預措施的開發，需要嚴格規范的臨床研究，尤其是隨機對照臨床試驗。為了提高涉及新藥與安慰劑等對照藥物臨床研究的內在真實性（internal validity），則需要對參與研究的受試者的入選標準進行嚴格的定義以保證其同質性。相反，哮喘作為慢性氣道炎癥疾病存在著明顯的異質性（heterogeneity），因此哮喘的臨床研究的設計變得相當復雜而有難度。例如，靶向IL-5的美泊利單抗（mepolizumab）作為附加治療，在早期的臨床研究中，未選擇的哮喘患者并沒有受益[18]。但是，當選擇性納入嗜酸性粒細胞哮喘表型后，美泊利單抗可明顯改善生活質量并減少未來哮喘的急性發作[19]。BDT陽性患者所展現的更多的哮喘癥狀及更差的哮喘控制水平，至少與兩方面的因素有關。第一、與BDT陰性的哮喘患者比較，BDT陽性患者展現出更高的與2型炎癥相關的氣道和全身炎癥；第二、BDT陽性患者存在一定程度的ICS治療不足（undertreatment）。因此，在臨床研究中，選擇BDT陽性的患者，可能對治療的反應會更好。我們的研究也發現，當給予400 μg的沙丁胺醇時，BDT陽性患者的FEV1改善明顯高于BDT陰性哮喘患者。事實上，眾多的臨床研究已開始關注且在哮喘患者的入選條件中增加了BDT陽性的條目，旨在選擇存在比較高的、治療相對不足的同質性比較好的哮喘患者[7-8]。
為加快臨床研究進程，參與臨床試驗的受試者絕大多數源于既往研究或就診登記系統，為了減少擬入選患者的篩選失敗率及篩選費用，勢必有建立BDT預測模型的必要。然而，迄今鮮有研究探索預測BDT模型的可能性。Zhao等[20]回顧性分析了384例門診哮喘患者，發現外周血嗜酸性粒細胞預測BDT陽性患者的AUC為0.707，敏感性和特異性分別為63.0%和71.8%。我們建立的模型在預測BDT的準確性方面明顯優于Zhao等[20]的研究，AUC為0.810～0.834，而且我們為特定的臨床篩選環境建立了不同的模型。例如，在缺乏痰誘導的基層或研究醫療機構，可采用模型1或3，在同時缺乏FeNO的醫療機構，則可應用模型3。
本研究還發現基線FEV1及MMEF在BDT陽性組患者中更低，且與BDR呈顯著負相關關系，并在模型中是兩項穩定的BDT陽性預測指標。FEV1通常代表氣道整體的通氣功能，其在BDT中的擴張程度受氣道最大口徑影響。與既往研究結果一致，在哮喘患者中，BDT陽性者具有更明顯的氣道阻塞、殘氣量及氣道阻力，且基線FEV1%pred水平與BDR呈顯著負相關關系[21]。這在一定程度上可能是因為在較低基線水平時更容易達到根據FEV1變化程度定義的BDT陽性標準。MMEF主要反映小氣道通氣功能水平，既往研究表明小氣道通氣功能障礙會先于FEV1下降出現。盡管本研究納入的人群FEV1%pred≥70%，該人群的MMEF已存在不同程度的受損并與BDR存在相關性，提示在此人群中采用小氣道指標為基礎進行BDT或可改善其敏感性而用于輕度氣道阻塞可疑哮喘患者的診斷[22]。
本研究亦存在一定的局限性。首先，本研究以肺功能水平輕中度受損哮喘人群為對象，盡管我們的內部驗證提示模型具有較好的一致性，但樣本量仍然相對較小。其次，模型中肺功能、炎癥指標間可能存在共線性，需考慮他們間可能存在中介或交互效應。
綜上，本研究探索了輕中度氣道阻塞的哮喘患者與BDT陽性相關的臨床和炎癥特征，首次構建了不同臨床實踐狀況下的BDT陽性的預測模型，使臨床醫師或研究人員，特別是處于條件有限的基層醫療機構的醫務人員亦可通過相對簡單易得的臨床指標計算列線圖積分，預測哮喘患者的BDT陽性的概率，為哮喘臨床研究或哮喘評估提供了一項新的參考工具。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
致謝：感謝分子網絡前沿科學研究中心肺免疫炎癥研究室林芝技師在痰標本處理方面所作的工作。
