引用本文： 茆曉妍, 萬宗仁, 楊丹, 馬婷, 李瑤, 史鵬飛, 朱蓉. 宏基因組二代測序下慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者痰菌群研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(3): 168-175. doi: 10.7507/1671-6205.202301011 復制
慢性阻塞性肺疾病全球倡議（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）2023指出，慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種由于氣道和或肺泡異常導致的以慢性呼吸道癥狀和持續性（常為進展性）的氣流限制為特征的異質性肺部狀態[1]。慢阻肺目前是全球三大死亡原因之一，其中90%的死亡發生在中低收入國家[2]。在我國，慢阻肺是導致我國公民壽命損失年的五大原因之一[3]。慢阻肺與主動吸煙（香煙煙霧、其他類型的煙草和大麻等）及被動吸煙相關。隨著發展中國家吸煙率上升和發達國家人口老齡化，預計慢阻肺患病率、發病率、病死率、經濟及社會負擔將在未來幾十年內持續上升。慢阻肺急性加重指呼吸道癥狀的惡化，通常與局部及全身炎癥增加有關，是慢阻肺患者住院的主要原因，并導致肺功能顯著下降及病死率顯著增加。慢阻肺急性加重的觸發因素包括感染性(細菌和病毒)和環境（空氣污染和氣象效應）因素。Hilty等[4]首次通過16S核糖核苷酸測序技術使我們認識到健康人肺中含有一種傳統培養方法無法檢測到的復雜微生物群落。肺微生物群失調與慢阻肺的發生、氣流受限程度、惡化次數及病死率有關[5-9]。痰是一種容易獲得的樣本，已成為微生物組研究的首選樣本類型。盡管痰微生物組可能僅部分反映了呼吸道微生物組，但越來越多的證據表明慢阻肺患者痰微生物菌群結構及多樣性改變與疾病嚴重程度、病情惡化、炎癥程度和治療方案（如吸入或全身糖皮質激素和抗生素）等因素相關[10-13]。目前，我國基于高通量測序的慢阻肺相關研究較少，本研究使用宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）分析慢阻肺患者穩定期及急性加重期痰菌群間的差異及與臨床指標的關系，探究其在不明原因的慢阻肺惡化中的作用，從而指導個性化治療。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取我院2021年12月—2022年6月間就診或出院后隨訪的57例吸煙的慢阻肺患者作為研究對象，并簽署知情同意書。本研究在開始前已經我院醫學倫理委員會批準通過（編號YX-2021-098-01）。納入標準：慢阻肺診斷符合最新GOLD指南診斷標準。慢阻肺穩定期患者：患者近3個月內咳嗽、咳痰或喘息癥狀穩定；近1個月內未使用全身糖皮質激素或抗生素。慢阻肺急性加重期患者：慢阻肺患者原有的呼吸道癥狀出現急性惡化，超出患者日常的變異，導致患者需要額外藥物治療。排除標準：重癥肺炎、支氣管擴張癥、肺結核、囊性纖維化、間質性肺疾病、急性肺栓塞、急性肺水腫、急性心力衰竭、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等；近1個月內使用抗生素及全身糖皮質激素的患者。共納入慢阻肺穩定期患者25例（穩定組），慢阻肺急性加重期患者29例（急性加重組）。
1.2 方法
1.2.1 標本采集
穩定期患者于清晨采集痰標本，而急性加重期患者于入院后用藥前采集痰標本。所有參與者咳痰前先用清水漱口，保持口腔清潔，再用0.9%生理鹽水漱口3次，每次10 mL，充分沖洗口腔及咽后壁，從而減少口腔細菌污染，然后用力咳出氣管深部的痰液3～5 mL。用無菌痰杯收集痰液，痰標本均經痰涂片鏡檢為合格痰標本后于2 h內迅速送至–80 ℃冰箱保存。由迪飛醫學公司行mNGS測序。采集慢阻肺患者治療前的血標本，檢測外周血C反應蛋白水平。收集患者一般資料，包括年齡、性別、吸煙指數、體重指數（body mass index，BMI）、營養風險篩查（nutrition risk screening，NRS）2002量表評分、第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in first second/forced vital capacity，FEV1/FVC）、GOLD分級、改良版英國醫學研究委員會呼吸困難問卷（modified British medical research council，mMRC）、慢阻肺自我評分測試（COPD assessment test，CAT）、既往1年加重次數和既往1年住院次數。
1.2.2 mNGS測序
采用Qiagen試劑盒進行痰液核酸提取，提取的DNA經超聲破碎，得到150～300 bp長度的片段。使用Qubit（Thermo Fisher Scientific，美國）和NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，美國）評估DNA濃度和質量，使用KAPA Hyper Prep試劑盒（KAPA Biosystems，美國）制備DNA文庫。對文庫進行質量控制并定量文庫濃度，最后在Illumina NovaSeq 6000（Illumina，美國）上進行150 bp雙端測序。
1.2.3 測序分析
使用Trimmomatic工具對原始fastq數據進行過濾，從而生成高質量測序數據。使用bowtie2去除宿主序列，使用Kraken2與微生物基因組數據庫比對（
1.3 統計學方法
采用R軟件4.0、SPSS 25.0進行統計分析。計數資料用例數和百分比表示，比較采用皮爾森χ2檢驗（不超過20%的格子理論頻數或期望頻數T<5）或Fisher精確概率檢驗（超過20%的格子理論頻數或期望頻數T<5，或者至少1個T<1）。對計量指標進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，滿足正態分布及方差齊性的計量資料采用均數±標準差（
±s）表示，組間比較用獨立樣本t檢驗；不滿足正態分布或方差齊性的計量資料采用中位數（四分位數間距）［M（Q）］，組間比較使用非參數秩和檢驗。Mann-Whitney U檢驗用于比較兩組間微生物菌群豐度的差異。通過置換多元方差分析即ADONIS檢驗評估兩組間β多樣性的統計學差異，并通過主成分分析及主坐標分析實現可視化。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
穩定期慢阻肺患者25例，平均年齡68.4歲，其中男21例（84.0%）。急性加重期慢阻肺患者29例，平均年齡71歲，其中男26例（89.7%）。兩組在年齡、性別、吸煙指數、BMI、NRS2002評分、FEV1/FVC和GOLD分級方面差異無統計學意義（P>0.05）。在mMRC、CAT、既往1年加重次數、既往1年住院次數及外周血C反應蛋白方面差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。
表1
入組慢阻肺患者的一般臨床特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物組成
選取豐度前20的物種，計算百分比，繪制物種組成柱狀圖（圖1）。在門水平，穩定組依次為厚壁菌門（35.3%）、放線菌門（30.6%）、變形菌門（19.5%）、擬桿菌門（11.1%）和梭桿菌門（3.3%）等。急性加重組依次為放線菌門（35.2%）、厚壁菌門（32.7%）、變形菌門（24.4%）、擬桿菌門（6.0%）和梭桿菌門（1.5%）等。在屬水平，穩定組鏈球菌屬（20.4%）、羅氏菌屬（15.0%）、放線菌屬（9.8%）、奈瑟菌屬（6.7%）、嗜血桿菌屬（6.5%）、普雷沃氏菌屬（6.0%）、孿生球菌（3.7%）和韋榮氏球菌（3.6%）等。急性加重組依次為羅氏菌屬（23.3%）、鏈球菌屬（18.4%）、嗜血桿菌屬（8.9%）、放線菌屬（8.9%）、奈瑟菌屬（7.3%）、普雷沃氏菌屬（3.9%）、孿生球菌（3.9%）、莫拉氏菌屬（3.5%）和韋榮氏球菌（2.3%）等。在種水平，穩定組黏液羅氏菌（11.9%）、嬰兒鏈球菌（6.2%）、Actinomyces graevenitzii（4.8%）、齲齒放線菌（4.0%）、微黃奈瑟菌（4.0%）、輕型鏈球菌（3.1%）、副流感嗜血桿菌（3.1%）、肺炎鏈球菌（2.7%）、干燥奈瑟菌（2.1%）、流感嗜血桿菌（2.0%）和Rothia aeria（0.7%）等。急性加重組黏液羅氏菌（20.1%）、流感嗜血桿菌（6.0%）、嬰兒鏈球菌（5.6%）、齲齒放線菌（4.7%）、卡他莫拉菌（3.5%）、干燥奈瑟菌（3.3%）、微黃奈瑟菌（3.2%）、Actinomyces graevenitzii（3.2%）、輕型鏈球菌（2.6%）、副流感嗜血桿菌（2.4%）和Rothia aeria（2.0%）等。
圖1
兩組慢阻肺患者痰微生物菌群組成柱狀圖
a. 門水平；b. 屬水平；c. 種水平
2.2.2 微生物多樣性
對微生物α多樣性的各指數進行分析的結果見表 2。結果顯示，與穩定組比較，急性加重組痰菌群均勻度即Shannon指數顯著降低（P=0.019，Mann-Whitney U檢驗），痰菌群豐富度即Ace、Chao1指數間差異無統計學意義（P=0.050，P=0.050，Mann-Whitney U檢驗）。對微生物β多樣性進行分析的結果見圖2。結果顯示，兩組間痰菌群結構間差異無統計學意義（R2=0.028，P=0.091，P=0.106，Adonis檢驗），PC1貢獻率為8.93%，PC2貢獻率為8.08%，PCoA1貢獻率為18.78%，PCoA2貢獻率為12.56%。
表2
兩組慢阻肺患者痰菌群α多樣性的各指數比較［M（Q）］
圖2
兩組慢阻肺患者基于Weighted Unifrac距離的主成分分析及主坐標分析
a. 主成分分析；b. 主坐標分析
2.2.3 物種相對豐度分析
采用Mann-Whitney U檢驗分析兩組之間物種差異。在門水平，急性加重組變形菌門相對豐度較穩定組升高，但差異無統計學意義（Z=–0.147，P=0.883），梭桿菌門相對豐度較穩定組顯著下降（Z=–2.669，P=0.008）（圖3a）。在屬水平，與穩定組比較，急性加重組梭桿菌屬、嗜血桿菌屬相對豐度顯著下降（Z=–3.062，P=0.002；Z=–2.143，P=0.032），顆粒鏈球菌屬相對豐度顯著升高（Z=–2.186，P=0.029）（圖3b）。在種水平，急性加重組Rothia aeria較穩定組略升高（Z=–0.581，P=0.561），副流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌及流感嗜血桿菌相對豐度較穩定組顯著下降（Z=–2.230，P=0.026；Z=–2.125，P=0.034；Z=–2.099，P=0.036）（圖3c）。其他門、屬、種水平菌群差異不顯著。
圖3
兩組慢阻肺患者痰微生物菌群相對豐度比較
a. 門水平；b. 屬水平；c. 種水平
2.3 慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群與臨床指標的關系
通過Spearman相關系數分析慢阻肺急性加重痰微生物菌群與臨床指標的關系，結果見表3。在慢阻肺急性加重時，痰孿生球菌屬相對豐度與FEV1/FVC以及BMI呈正相關，與NRS2002評分呈負相關，痰奈瑟菌屬、微黃奈瑟菌相對豐度與GOLD分級呈顯著負相關，Rothia aeria相對豐度與C反應蛋白水平呈顯著正相關。
表3
慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群相對豐度與臨床指標相關性分析
3 討論
本研究使用mNGS測序法分析慢阻肺患者急性加重期痰菌群及其與臨床指標的相關性。結果發現無論是在穩定期還是急性加重期，慢阻肺患者痰中常見的菌門為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門，常見的菌屬為鏈球菌屬、羅氏菌屬、放線菌屬、奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、普雷沃氏菌屬等，這與我國研究[14-15]及國外研究[16-18]結果相似；還發現在種水平，慢阻肺患者痰液常見的細菌有黏液羅氏菌、嬰兒鏈球菌、齲齒放線菌、微黃奈瑟菌、干燥奈瑟菌、流感嗜血桿菌及卡他莫拉菌等。其他研究發現慢阻肺急性加重患者痰菌群α多樣性較穩定期患者顯著下降[9，19-22]。本研究結果也顯示兩組間痰菌群α多樣性中的均勻度即Shannon指數差異有統計學意義，但β多樣性差異無統計學意義。
在健康個體中，細菌主要通過口腔微吸入或直接黏膜擴散進入肺部，與上呼吸道、口腔和上消化道等部位相比較，下呼吸道微生物與口腔微生物最相似[23-24]。健康成人口腔中常見菌門有變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門及梭桿菌門等，常見的菌種有馬氏棒狀桿菌、副流感嗜血桿菌、產黑色素普雷沃菌、奇異勞特普羅菌及丙酸丙酸桿菌等[25]。研究表示，與從未吸煙的人比較，吸煙者口腔微生物α多樣性下降[26]。因此，吸煙可能通過改變口腔微生物菌群的豐度影響菌群間聯系及其代謝功能，創造出不同的環境，從而影響口腔或呼吸道健康。Liu等[27]研究發現慢阻肺急性加重患者口咽微生物與痰微生物的分類特征相似，但顯示較高的多樣性。我們也發現慢阻肺吸煙者痰微生物中存在一些來源于口腔的細菌。梭桿菌門屬于革蘭陰性細菌，其中梭桿菌屬正常寄生于口腔、消化道及泌尿生殖道等。盛美玲等[28]發現穩定期慢阻肺急性加重風險高危患者支氣管肺泡灌洗液中梭桿菌門豐度顯著低于低危患者。本研究發現慢阻肺急性加重患者痰梭桿菌門、梭桿菌屬相對豐度較慢阻肺穩定期患者顯著下降，因此可推測痰梭桿菌門及梭桿菌屬減少與慢阻肺惡化相關，可能是呼吸道有益菌。顆粒鏈球菌屬是人類口腔優勢菌，可引起機會性感染。Diao等[29]發現慢阻肺穩定期患者誘導痰中此菌相對豐度較健康人顯著下降。本研究發現慢阻肺急性加重患者痰中顆粒鏈球菌相對豐度顯著高于慢阻肺穩定期患者，考慮可能受口腔微生物影響，但較難解釋痰顆粒鏈球菌相對豐度改變與慢阻肺急性加重之間的關系。孿生球菌為人的口腔、腸道和呼吸道的專性寄生菌。本研究發現在慢阻肺急性加重時，痰中孿生球菌屬低于穩定期患者，且FEV1/FVC或BMI越低，患者痰孿生球菌越少，NRS2002量表評分越高，因此認為孿生球菌在慢阻肺中可能起保護作用，具體機制尚不明確。奈瑟菌屬是β-變形菌類，屬于革蘭陰性雙球菌，其中，淋病奈瑟菌與腦膜奈瑟菌為致病菌，而干燥奈瑟菌、微黃奈瑟菌等為呼吸道中正常的寄生菌。本研究發現GOLD分級越低，患者痰奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）越多，且急性加重患者痰奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）低于穩定期患者，提示其減少與重度慢阻肺患者疾病惡化有關，故認為痰奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）可能在慢阻肺中發揮有益作用。另外，本研究中慢阻肺急性加重患者嗜血桿菌屬與既往1年住院次數呈顯著負相關，認為慢阻肺急性加重患者痰嗜血桿菌屬（流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌）及卡他莫拉菌相對豐度顯著低于慢阻肺患者可能受既往1年住院及治療用藥次數影響。
細菌定植在慢阻肺發病機制中具有重要作用，宿主微生物相互作用可能是慢性炎癥性肺疾病的基礎。呼吸道菌群延長有害的免疫應答，證實慢性細菌定植在慢阻肺發病機制中的作用[30]。另一項對肺氣腫小鼠的研究表明，肺微生物群可通過增強IL-17A和自身抗體促進慢性肺部炎癥[31]。Wang等[10]發現中性粒細胞性慢阻肺以嗜血桿菌為主的亞組中，痰白細胞介素（interleukin，IL）-1β和腫瘤壞死因子α升高，且隨著時間的推移相對穩定；而具有平衡微生物的亞組中痰液和血清IL-17A水平升高，具有時間動態性，在病情惡化期間易受最大微生物群變化的影響；還發現嗜血桿菌與嗜酸性粒細胞向中性粒細胞炎性狀態轉變相關，而彎曲桿菌、孿生球菌、二氧化碳嗜纖維菌和顆粒鏈球菌與中性粒細胞向嗜酸性粒細胞狀態轉變相關。因此，監測氣道微生物組的時間變異性可以跟蹤患者的炎癥狀態。C反應蛋白是一種非特異性炎癥標志物，當感染等誘發慢阻肺急性加重時，全身炎癥反應加劇，C反應蛋白往往會升高。本研究發現與慢阻肺穩定期患者比較，慢阻肺急性加重患者痰Rothia aeria相對豐度升高，且與C反應蛋白呈顯著正相關，故推測痰Rothia aeria增多與疾病惡化及體內炎癥水平升高有關，其機制有待進一步研究。
囊性纖維化患者呼吸道中黏液羅氏菌可能通過降低IκB-α的磷酸化來抑制核因子-κB通路的激活，從而抑制炎癥，提示黏液羅氏菌在呼吸道可能起有益作用[32]。但本研究發現慢阻肺急性加重患者黏液羅氏菌高于慢阻肺穩定期患者，因此該菌在體內的耐受負荷及其在慢阻肺中的作用還需進一步研究。泛福舒作為一種細菌溶解產物膠囊，含流感嗜血桿菌、肺炎雙球菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷白菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、卡他奈瑟菌的凍干溶解物，可通過腸–肺軸激活免疫反應，提高呼吸道免疫力，被建議用于預防呼吸道感染、慢性支氣管炎及哮喘的急性發作[33-34]。痰中部分微生物可能在慢阻肺中具有免疫調節特性，進而調控體內炎癥水平。但目前還需要對呼吸道微生物進行更全面更深入的研究，進一步明確宿主微生物作用機制，以制定更精準的慢阻肺防治策略。
本研究還存在以下不足：（1）研究選擇痰樣本，難以避免口腔污染；（2）樣本量相對較少；（3）采用橫斷面研究，未追蹤患者疾病變化及結局。此外，微生物研究個體差異性較大，且容易受氣候及環境因素干擾，故研究結果存在不一致性。未來需要更大規模的研究并結合代謝組學、蛋白質組學及轉錄組學進一步分析微生物–宿主相互作用機制，從而指導靶向治療。
綜上所述，慢阻肺穩定期和急性加重期患者痰菌群在門、屬、種水平存在顯著差異，急性加重期患者痰菌群均勻度顯著低于穩定期患者。痰梭桿菌門、梭桿菌屬、孿生球菌屬和奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）可能在慢阻肺中發揮有益作用，而Rothia aeria可能與慢阻肺惡化有關。目前，呼吸道微生物在慢阻肺中的作用及機制尚不明確，呼吸道菌群失衡是慢阻肺急性加重的原因還是結果，這種失衡是如何與宿主炎癥途徑相關，以及針對呼吸道特定細菌分類群的抑制治療是否可以減慢慢阻肺進展仍需進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病全球倡議（Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease，GOLD）2023指出，慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種由于氣道和或肺泡異常導致的以慢性呼吸道癥狀和持續性（常為進展性）的氣流限制為特征的異質性肺部狀態[1]。慢阻肺目前是全球三大死亡原因之一，其中90%的死亡發生在中低收入國家[2]。在我國，慢阻肺是導致我國公民壽命損失年的五大原因之一[3]。慢阻肺與主動吸煙（香煙煙霧、其他類型的煙草和大麻等）及被動吸煙相關。隨著發展中國家吸煙率上升和發達國家人口老齡化，預計慢阻肺患病率、發病率、病死率、經濟及社會負擔將在未來幾十年內持續上升。慢阻肺急性加重指呼吸道癥狀的惡化，通常與局部及全身炎癥增加有關，是慢阻肺患者住院的主要原因，并導致肺功能顯著下降及病死率顯著增加。慢阻肺急性加重的觸發因素包括感染性(細菌和病毒)和環境（空氣污染和氣象效應）因素。Hilty等[4]首次通過16S核糖核苷酸測序技術使我們認識到健康人肺中含有一種傳統培養方法無法檢測到的復雜微生物群落。肺微生物群失調與慢阻肺的發生、氣流受限程度、惡化次數及病死率有關[5-9]。痰是一種容易獲得的樣本，已成為微生物組研究的首選樣本類型。盡管痰微生物組可能僅部分反映了呼吸道微生物組，但越來越多的證據表明慢阻肺患者痰微生物菌群結構及多樣性改變與疾病嚴重程度、病情惡化、炎癥程度和治療方案（如吸入或全身糖皮質激素和抗生素）等因素相關[10-13]。目前，我國基于高通量測序的慢阻肺相關研究較少，本研究使用宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）分析慢阻肺患者穩定期及急性加重期痰菌群間的差異及與臨床指標的關系，探究其在不明原因的慢阻肺惡化中的作用，從而指導個性化治療。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取我院2021年12月—2022年6月間就診或出院后隨訪的57例吸煙的慢阻肺患者作為研究對象，并簽署知情同意書。本研究在開始前已經我院醫學倫理委員會批準通過（編號YX-2021-098-01）。納入標準：慢阻肺診斷符合最新GOLD指南診斷標準。慢阻肺穩定期患者：患者近3個月內咳嗽、咳痰或喘息癥狀穩定；近1個月內未使用全身糖皮質激素或抗生素。慢阻肺急性加重期患者：慢阻肺患者原有的呼吸道癥狀出現急性惡化，超出患者日常的變異，導致患者需要額外藥物治療。排除標準：重癥肺炎、支氣管擴張癥、肺結核、囊性纖維化、間質性肺疾病、急性肺栓塞、急性肺水腫、急性心力衰竭、自身免疫性疾病及惡性腫瘤等；近1個月內使用抗生素及全身糖皮質激素的患者。共納入慢阻肺穩定期患者25例（穩定組），慢阻肺急性加重期患者29例（急性加重組）。
1.2 方法
1.2.1 標本采集
穩定期患者于清晨采集痰標本，而急性加重期患者于入院后用藥前采集痰標本。所有參與者咳痰前先用清水漱口，保持口腔清潔，再用0.9%生理鹽水漱口3次，每次10 mL，充分沖洗口腔及咽后壁，從而減少口腔細菌污染，然后用力咳出氣管深部的痰液3～5 mL。用無菌痰杯收集痰液，痰標本均經痰涂片鏡檢為合格痰標本后于2 h內迅速送至–80 ℃冰箱保存。由迪飛醫學公司行mNGS測序。采集慢阻肺患者治療前的血標本，檢測外周血C反應蛋白水平。收集患者一般資料，包括年齡、性別、吸煙指數、體重指數（body mass index，BMI）、營養風險篩查（nutrition risk screening，NRS）2002量表評分、第1秒用力呼氣容積與用力肺活量比值（forced expiratory volume in first second/forced vital capacity，FEV1/FVC）、GOLD分級、改良版英國醫學研究委員會呼吸困難問卷（modified British medical research council，mMRC）、慢阻肺自我評分測試（COPD assessment test，CAT）、既往1年加重次數和既往1年住院次數。
1.2.2 mNGS測序
采用Qiagen試劑盒進行痰液核酸提取，提取的DNA經超聲破碎，得到150～300 bp長度的片段。使用Qubit（Thermo Fisher Scientific，美國）和NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，美國）評估DNA濃度和質量，使用KAPA Hyper Prep試劑盒（KAPA Biosystems，美國）制備DNA文庫。對文庫進行質量控制并定量文庫濃度，最后在Illumina NovaSeq 6000（Illumina，美國）上進行150 bp雙端測序。
1.2.3 測序分析
使用Trimmomatic工具對原始fastq數據進行過濾，從而生成高質量測序數據。使用bowtie2去除宿主序列，使用Kraken2與微生物基因組數據庫比對（
1.3 統計學方法
采用R軟件4.0、SPSS 25.0進行統計分析。計數資料用例數和百分比表示，比較采用皮爾森χ2檢驗（不超過20%的格子理論頻數或期望頻數T<5）或Fisher精確概率檢驗（超過20%的格子理論頻數或期望頻數T<5，或者至少1個T<1）。對計量指標進行正態性檢驗及方差齊性檢驗，滿足正態分布及方差齊性的計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較用獨立樣本t檢驗；不滿足正態分布或方差齊性的計量資料采用中位數（四分位數間距）［M（Q）］，組間比較使用非參數秩和檢驗。Mann-Whitney U檢驗用于比較兩組間微生物菌群豐度的差異。通過置換多元方差分析即ADONIS檢驗評估兩組間β多樣性的統計學差異，并通過主成分分析及主坐標分析實現可視化。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
穩定期慢阻肺患者25例，平均年齡68.4歲，其中男21例（84.0%）。急性加重期慢阻肺患者29例，平均年齡71歲，其中男26例（89.7%）。兩組在年齡、性別、吸煙指數、BMI、NRS2002評分、FEV1/FVC和GOLD分級方面差異無統計學意義（P>0.05）。在mMRC、CAT、既往1年加重次數、既往1年住院次數及外周血C反應蛋白方面差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表1。
表1
入組慢阻肺患者的一般臨床特征
2.2 微生物分析
2.2.1 微生物組成
選取豐度前20的物種，計算百分比，繪制物種組成柱狀圖（圖1）。在門水平，穩定組依次為厚壁菌門（35.3%）、放線菌門（30.6%）、變形菌門（19.5%）、擬桿菌門（11.1%）和梭桿菌門（3.3%）等。急性加重組依次為放線菌門（35.2%）、厚壁菌門（32.7%）、變形菌門（24.4%）、擬桿菌門（6.0%）和梭桿菌門（1.5%）等。在屬水平，穩定組鏈球菌屬（20.4%）、羅氏菌屬（15.0%）、放線菌屬（9.8%）、奈瑟菌屬（6.7%）、嗜血桿菌屬（6.5%）、普雷沃氏菌屬（6.0%）、孿生球菌（3.7%）和韋榮氏球菌（3.6%）等。急性加重組依次為羅氏菌屬（23.3%）、鏈球菌屬（18.4%）、嗜血桿菌屬（8.9%）、放線菌屬（8.9%）、奈瑟菌屬（7.3%）、普雷沃氏菌屬（3.9%）、孿生球菌（3.9%）、莫拉氏菌屬（3.5%）和韋榮氏球菌（2.3%）等。在種水平，穩定組黏液羅氏菌（11.9%）、嬰兒鏈球菌（6.2%）、Actinomyces graevenitzii（4.8%）、齲齒放線菌（4.0%）、微黃奈瑟菌（4.0%）、輕型鏈球菌（3.1%）、副流感嗜血桿菌（3.1%）、肺炎鏈球菌（2.7%）、干燥奈瑟菌（2.1%）、流感嗜血桿菌（2.0%）和Rothia aeria（0.7%）等。急性加重組黏液羅氏菌（20.1%）、流感嗜血桿菌（6.0%）、嬰兒鏈球菌（5.6%）、齲齒放線菌（4.7%）、卡他莫拉菌（3.5%）、干燥奈瑟菌（3.3%）、微黃奈瑟菌（3.2%）、Actinomyces graevenitzii（3.2%）、輕型鏈球菌（2.6%）、副流感嗜血桿菌（2.4%）和Rothia aeria（2.0%）等。
圖1
兩組慢阻肺患者痰微生物菌群組成柱狀圖
a. 門水平；b. 屬水平；c. 種水平
2.2.2 微生物多樣性
對微生物α多樣性的各指數進行分析的結果見表 2。結果顯示，與穩定組比較，急性加重組痰菌群均勻度即Shannon指數顯著降低（P=0.019，Mann-Whitney U檢驗），痰菌群豐富度即Ace、Chao1指數間差異無統計學意義（P=0.050，P=0.050，Mann-Whitney U檢驗）。對微生物β多樣性進行分析的結果見圖2。結果顯示，兩組間痰菌群結構間差異無統計學意義（R2=0.028，P=0.091，P=0.106，Adonis檢驗），PC1貢獻率為8.93%，PC2貢獻率為8.08%，PCoA1貢獻率為18.78%，PCoA2貢獻率為12.56%。
表2
兩組慢阻肺患者痰菌群α多樣性的各指數比較［M（Q）］
圖2
兩組慢阻肺患者基于Weighted Unifrac距離的主成分分析及主坐標分析
a. 主成分分析；b. 主坐標分析
2.2.3 物種相對豐度分析
采用Mann-Whitney U檢驗分析兩組之間物種差異。在門水平，急性加重組變形菌門相對豐度較穩定組升高，但差異無統計學意義（Z=–0.147，P=0.883），梭桿菌門相對豐度較穩定組顯著下降（Z=–2.669，P=0.008）（圖3a）。在屬水平，與穩定組比較，急性加重組梭桿菌屬、嗜血桿菌屬相對豐度顯著下降（Z=–3.062，P=0.002；Z=–2.143，P=0.032），顆粒鏈球菌屬相對豐度顯著升高（Z=–2.186，P=0.029）（圖3b）。在種水平，急性加重組Rothia aeria較穩定組略升高（Z=–0.581，P=0.561），副流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌及流感嗜血桿菌相對豐度較穩定組顯著下降（Z=–2.230，P=0.026；Z=–2.125，P=0.034；Z=–2.099，P=0.036）（圖3c）。其他門、屬、種水平菌群差異不顯著。
圖3
兩組慢阻肺患者痰微生物菌群相對豐度比較
a. 門水平；b. 屬水平；c. 種水平
2.3 慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群與臨床指標的關系
通過Spearman相關系數分析慢阻肺急性加重痰微生物菌群與臨床指標的關系，結果見表3。在慢阻肺急性加重時，痰孿生球菌屬相對豐度與FEV1/FVC以及BMI呈正相關，與NRS2002評分呈負相關，痰奈瑟菌屬、微黃奈瑟菌相對豐度與GOLD分級呈顯著負相關，Rothia aeria相對豐度與C反應蛋白水平呈顯著正相關。
表3
慢阻肺急性加重患者痰微生物菌群相對豐度與臨床指標相關性分析
3 討論
本研究使用mNGS測序法分析慢阻肺患者急性加重期痰菌群及其與臨床指標的相關性。結果發現無論是在穩定期還是急性加重期，慢阻肺患者痰中常見的菌門為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、擬桿菌門和梭桿菌門，常見的菌屬為鏈球菌屬、羅氏菌屬、放線菌屬、奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、普雷沃氏菌屬等，這與我國研究[14-15]及國外研究[16-18]結果相似；還發現在種水平，慢阻肺患者痰液常見的細菌有黏液羅氏菌、嬰兒鏈球菌、齲齒放線菌、微黃奈瑟菌、干燥奈瑟菌、流感嗜血桿菌及卡他莫拉菌等。其他研究發現慢阻肺急性加重患者痰菌群α多樣性較穩定期患者顯著下降[9，19-22]。本研究結果也顯示兩組間痰菌群α多樣性中的均勻度即Shannon指數差異有統計學意義，但β多樣性差異無統計學意義。
在健康個體中，細菌主要通過口腔微吸入或直接黏膜擴散進入肺部，與上呼吸道、口腔和上消化道等部位相比較，下呼吸道微生物與口腔微生物最相似[23-24]。健康成人口腔中常見菌門有變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、厚壁菌門及梭桿菌門等，常見的菌種有馬氏棒狀桿菌、副流感嗜血桿菌、產黑色素普雷沃菌、奇異勞特普羅菌及丙酸丙酸桿菌等[25]。研究表示，與從未吸煙的人比較，吸煙者口腔微生物α多樣性下降[26]。因此，吸煙可能通過改變口腔微生物菌群的豐度影響菌群間聯系及其代謝功能，創造出不同的環境，從而影響口腔或呼吸道健康。Liu等[27]研究發現慢阻肺急性加重患者口咽微生物與痰微生物的分類特征相似，但顯示較高的多樣性。我們也發現慢阻肺吸煙者痰微生物中存在一些來源于口腔的細菌。梭桿菌門屬于革蘭陰性細菌，其中梭桿菌屬正常寄生于口腔、消化道及泌尿生殖道等。盛美玲等[28]發現穩定期慢阻肺急性加重風險高危患者支氣管肺泡灌洗液中梭桿菌門豐度顯著低于低危患者。本研究發現慢阻肺急性加重患者痰梭桿菌門、梭桿菌屬相對豐度較慢阻肺穩定期患者顯著下降，因此可推測痰梭桿菌門及梭桿菌屬減少與慢阻肺惡化相關，可能是呼吸道有益菌。顆粒鏈球菌屬是人類口腔優勢菌，可引起機會性感染。Diao等[29]發現慢阻肺穩定期患者誘導痰中此菌相對豐度較健康人顯著下降。本研究發現慢阻肺急性加重患者痰中顆粒鏈球菌相對豐度顯著高于慢阻肺穩定期患者，考慮可能受口腔微生物影響，但較難解釋痰顆粒鏈球菌相對豐度改變與慢阻肺急性加重之間的關系。孿生球菌為人的口腔、腸道和呼吸道的專性寄生菌。本研究發現在慢阻肺急性加重時，痰中孿生球菌屬低于穩定期患者，且FEV1/FVC或BMI越低，患者痰孿生球菌越少，NRS2002量表評分越高，因此認為孿生球菌在慢阻肺中可能起保護作用，具體機制尚不明確。奈瑟菌屬是β-變形菌類，屬于革蘭陰性雙球菌，其中，淋病奈瑟菌與腦膜奈瑟菌為致病菌，而干燥奈瑟菌、微黃奈瑟菌等為呼吸道中正常的寄生菌。本研究發現GOLD分級越低，患者痰奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）越多，且急性加重患者痰奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）低于穩定期患者，提示其減少與重度慢阻肺患者疾病惡化有關，故認為痰奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）可能在慢阻肺中發揮有益作用。另外，本研究中慢阻肺急性加重患者嗜血桿菌屬與既往1年住院次數呈顯著負相關，認為慢阻肺急性加重患者痰嗜血桿菌屬（流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌）及卡他莫拉菌相對豐度顯著低于慢阻肺患者可能受既往1年住院及治療用藥次數影響。
細菌定植在慢阻肺發病機制中具有重要作用，宿主微生物相互作用可能是慢性炎癥性肺疾病的基礎。呼吸道菌群延長有害的免疫應答，證實慢性細菌定植在慢阻肺發病機制中的作用[30]。另一項對肺氣腫小鼠的研究表明，肺微生物群可通過增強IL-17A和自身抗體促進慢性肺部炎癥[31]。Wang等[10]發現中性粒細胞性慢阻肺以嗜血桿菌為主的亞組中，痰白細胞介素（interleukin，IL）-1β和腫瘤壞死因子α升高，且隨著時間的推移相對穩定；而具有平衡微生物的亞組中痰液和血清IL-17A水平升高，具有時間動態性，在病情惡化期間易受最大微生物群變化的影響；還發現嗜血桿菌與嗜酸性粒細胞向中性粒細胞炎性狀態轉變相關，而彎曲桿菌、孿生球菌、二氧化碳嗜纖維菌和顆粒鏈球菌與中性粒細胞向嗜酸性粒細胞狀態轉變相關。因此，監測氣道微生物組的時間變異性可以跟蹤患者的炎癥狀態。C反應蛋白是一種非特異性炎癥標志物，當感染等誘發慢阻肺急性加重時，全身炎癥反應加劇，C反應蛋白往往會升高。本研究發現與慢阻肺穩定期患者比較，慢阻肺急性加重患者痰Rothia aeria相對豐度升高，且與C反應蛋白呈顯著正相關，故推測痰Rothia aeria增多與疾病惡化及體內炎癥水平升高有關，其機制有待進一步研究。
囊性纖維化患者呼吸道中黏液羅氏菌可能通過降低IκB-α的磷酸化來抑制核因子-κB通路的激活，從而抑制炎癥，提示黏液羅氏菌在呼吸道可能起有益作用[32]。但本研究發現慢阻肺急性加重患者黏液羅氏菌高于慢阻肺穩定期患者，因此該菌在體內的耐受負荷及其在慢阻肺中的作用還需進一步研究。泛福舒作為一種細菌溶解產物膠囊，含流感嗜血桿菌、肺炎雙球菌、肺炎克雷伯菌、臭鼻克雷白菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、草綠色鏈球菌、卡他奈瑟菌的凍干溶解物，可通過腸–肺軸激活免疫反應，提高呼吸道免疫力，被建議用于預防呼吸道感染、慢性支氣管炎及哮喘的急性發作[33-34]。痰中部分微生物可能在慢阻肺中具有免疫調節特性，進而調控體內炎癥水平。但目前還需要對呼吸道微生物進行更全面更深入的研究，進一步明確宿主微生物作用機制，以制定更精準的慢阻肺防治策略。
本研究還存在以下不足：（1）研究選擇痰樣本，難以避免口腔污染；（2）樣本量相對較少；（3）采用橫斷面研究，未追蹤患者疾病變化及結局。此外，微生物研究個體差異性較大，且容易受氣候及環境因素干擾，故研究結果存在不一致性。未來需要更大規模的研究并結合代謝組學、蛋白質組學及轉錄組學進一步分析微生物–宿主相互作用機制，從而指導靶向治療。
綜上所述，慢阻肺穩定期和急性加重期患者痰菌群在門、屬、種水平存在顯著差異，急性加重期患者痰菌群均勻度顯著低于穩定期患者。痰梭桿菌門、梭桿菌屬、孿生球菌屬和奈瑟菌屬（微黃奈瑟菌）可能在慢阻肺中發揮有益作用，而Rothia aeria可能與慢阻肺惡化有關。目前，呼吸道微生物在慢阻肺中的作用及機制尚不明確，呼吸道菌群失衡是慢阻肺急性加重的原因還是結果，這種失衡是如何與宿主炎癥途徑相關，以及針對呼吸道特定細菌分類群的抑制治療是否可以減慢慢阻肺進展仍需進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
