引用本文： 張盼盼, 韓曉慶, 王袁, 黃超, 王紅陽. 肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠氧化應激及認知功能的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2023, 22(4): 269-273. doi: 10.7507/1671-6205.202212001 復制
睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（sleep apnea-hypopnea syndrome，SAS）可引起不同程度的間歇低氧，造成多系統損傷[1-2]。認知功能損傷是SAS最常見的并發癥之一[3]，氧化應激是SAS發生認知功能損傷的主要機制[4-6]。緩解SAS患者氧化應激的首選方法是持續氣道正壓通氣[7]，目前關于抗氧化劑改善SAS導致的氧化應激的研究較少。肉蓯蓉總苷是由植物肉蓯蓉提取得到的化合物，苯乙醇苷類是其主要活性成分，現代醫學研究證實肉蓯蓉總苷不僅具有抗氧化及清除自由基等作用，而且具有改善認知功能的作用[8-9]。國內學者發現肉蓯蓉總苷可改善阿爾茨海默病模型大鼠學習認知功能，其機制可能通過抑制體內氧化應激反應，進而提高突觸可塑性來實現[10]。目前肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠認知功能損傷的作用尚不清楚，本研究旨在探討肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠氧化應激水平的影響，闡述其治療SAS認知功能損傷的相關作用機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
成年健康雄性Wistar大鼠72只，體質量（170±10）g，由北京維通利華實驗動物科技有限公司提供。本實驗通過華北理工大學動物倫理委員會的批準（批準號：LAEC-NCST-2020072）。
1.1.2 實驗儀器和設備
自行設計制造間歇低氧艙，低氧控制程序（華北理工大學附屬醫院呼吸科），Morris水迷宮（上海移數信息科技有限公司），全無油潤滑空氣壓縮機（浙江博大實業有限公司），離心機（德國Eppendorf公司），酶標儀（美國Bio-Rad公司），分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。
1.1.3 實驗主要試劑
肉蓯蓉總苷（上海源葉生物科技有限公司，純度規格：85%），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（WST-8法）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（TBA法）均為上海碧云天生物技術有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組
采用隨機數字法將大鼠分為3組：空白對照組、5%間歇性低氧組（簡稱低氧組）、肉蓯蓉總苷干預組（簡稱總苷干預組）。每組又分為2、4、6和8周時間組，各時間組6只大鼠。
1.2.2 間歇低氧大鼠模型的建立以及肉蓯蓉總苷干預
每日8∶00給與總苷干預組大鼠肉蓯蓉總苷灌胃治療，干預劑量為50 mg·kg–1·d–1，采用滅菌注射用水將肉蓯蓉總苷溶解，滅菌注射用水用量按照大鼠的灌胃給藥體積為10 mL/kg計算，30 min后于8∶30～16∶30將總苷干預組及低氧組大鼠置于間歇低氧箱內。間歇低氧大鼠制作方法參照文獻［11］，總苷干預組及低氧組大鼠循環交替給予不同流量氮氣和壓縮空氣。每一循環120 s：前30 s為氮氣，接著40 s為高流量壓縮空氣，最后50 s為低流量壓縮空氣。用數字測氧儀監測艙內氧體積分數變化，使兩個實驗組箱內前30 s氧濃度逐漸降至5%，接著40 s氧濃度逐漸恢復至21%，維持50 s使間歇低氧箱內氧濃度波動范圍在±0.5%以內，兩組低氧艙內氧濃度在5%～21%間循環。空白對照組大鼠不給予任何處理，其艙內氧濃度維持在21%。實驗結束將實驗動物取出，送入常規飼養箱內自由飲水與攝食，生活環境及飼養條件相同。間歇低氧及肉蓯蓉總苷干預分別持續2、4、6、8周。
1.2.3 水迷宮檢測方法
參照文獻[11-12]的方法，采用Morris水迷宮對三組大鼠進行學習記憶功能檢測。每只大鼠晨起訓練5次后分別在上午、下午各測試6次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時間和跨越目標象限時間。
1.2.4 SOD及MDA的檢測
于各間歇低氧時間點結束后給予各組大鼠進行腹腔麻醉，麻醉藥物為10%水合氯醛（300 mg/kg），大鼠被腹腔麻醉之后斷頭取腦，迅速分離海馬組織后，留取標本–80 ℃冰箱保存。采用WST-8法檢測SOD活性，采用TBA法檢測MDA水平，各步驟嚴格按照其試劑盒說明書操作。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件，呈正態分布的計量數據用均數±標準差（
±s）表示，組間及組內比較采用單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 三組大鼠水迷宮結果
2.1.1 定位航行實驗
與空白對照組比較，低氧組和總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6、8周的逃避潛伏期均顯著延長（P<0.05）。與低氧組比較，總苷干預組大鼠的逃避潛伏期在間歇低氧2、4、6、8周均顯著縮短（P<0.05）。總苷干預組和低氧組大鼠從間歇低氧2周開始逃避潛伏期逐漸延長，隨著間歇低氧時間的延長，于8周達到高峰（P<0.05）。空白對照組在2、4、6、8周逃避潛伏期無顯著差異。結果見表1。
表1
各組大鼠逃避潛伏期、跨越目標象限時間、海馬組織SOD和MDA水平（
）
2.1.2 空間探索實驗
與空白對照組比較，在間歇低氧2、4、6、8周低氧組和總苷干預組大鼠的跨越目標象限時間均顯著減少（P<0.05）。與低氧組相比，總苷干預組大鼠跨越目標象限時間分別于間歇低氧2、4、6、8周顯著增加（P<0.05）。低氧組和總苷干預組大鼠的跨越目標象限時間均于間歇低氧2周開始降低，隨著間歇低氧時間的延長，于8周降到最低（P<0.05）。空白對照組的跨越目標象限時間在2、4、6、8周無顯著差異。結果見表1。
2.2 三組大鼠氧化應激實驗結果
與空白對照組比較，低氧組和總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6和8周時海馬組織SOD表達水平均顯著降低（P<0.05）。與間歇低氧組比較，總苷干預組大鼠SOD水平分別在2、4、6、8周顯著升高（P<0.05）。間歇低氧組和總苷干預組大鼠的SOD表達水平從間歇低氧2周開始下降，并于8周達到最低（P<0.05）。但空白對照組的SOD表達水平在2、4、6、8周無顯著差異。結果見表1。
與空白對照組比較，低氧組和總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6和8周時海馬組織MDA水平均顯著升高（P<0.05）。與低氧組比較，總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6、8周MDA表達水平均顯著下降（P<0.05）。低氧組和總苷干預組大鼠的MDA水平從間歇低氧2周開始升高，并于8周達到最高（P<0.05）。空白對照組的MDA水平在2、4、6、8周無顯著差異。結果見表1。
3 討論
在臨床上SAS的發病率逐漸升高，可造成神經系統損傷，尤以認知功能障礙最為顯著[13]。氧化應激是SAS并發認知功能障礙的主要病理機制，因此在臨床上常采用持續氣道正壓通氣緩解SAS患者間歇低氧，進而改善其氧化應激，具有明顯療效[14-15]。但是由于部分患者不能有效耐受持續氣道正壓通氣的治療，從而造成一部分患者治療效果差，嚴重影響其生存質量。抗氧化藥物逐漸用于研究治療SAS并發的認知功能障礙，但目前用于臨床試驗的抗氧化藥物療效欠佳[16]。
目前研究表明依達拉奉、白藜蘆醇等抗氧化劑可抑制間歇低氧大鼠氧化應激，進而改善其認知障礙[17-18]。肉蓯蓉總苷為強抗氧化劑，能有效清除自由基及抗炎作用，從而起到神經保護作用，同時具有促進神經功能恢復的功效[19-20]。SOD和MDA是反映機體氧化應激反應的關鍵指標，已在間歇低氧大鼠模型中被廣泛研究[21-22]。然而肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠海馬氧化應激的影響尚不明確，為此本研究探討肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠海馬氧化應激的影響。結果發現低氧組及總苷干預組海馬區神經細胞MDA表達均多于空白對照組，而SOD表達均低于空白對照組；與低氧組比較，總苷干預組海馬區神經細胞MDA表達均降低，而SOD表達增加。王璐等[10]研究發現肉蓯蓉總苷能提高改善阿爾茨海默病模型大鼠血清SOD活性，降低MDA的含量，從而抑制氧化應激來改善海馬CA1區錐體細胞的存活率。樊燕燕等[23]發現不同劑量肉蓯蓉總苷可提高缺血再灌注神經細胞細胞活力，降低凋亡率，具有神經保護作用。同時劉恩寵等[24]也發現于飲水中補充肉蓯蓉毛蕊花苷能升高慢性全腦低灌小鼠模型小鼠腦組織MDA水平，上調其SOD活性，逆轉乙酰膽堿酯酶活性，提示肉蓯蓉毛蕊花苷對慢性腦低灌注導致的神經損傷有一定神經保護作用，其機制通過抑制氧化應激來實現。這充分說明肉蓯蓉總苷具有較強的抗氧化特性和神經保護作用。結合國內已有的研究結果及本實驗結果證實肉蓯蓉總苷能有效降低間歇低氧大鼠海馬氧化應激的水平，進而可能改善間歇低氧大鼠海馬區神經細胞的損傷。
肉蓯蓉總苷不僅具有抗氧化作用，而且也具有改善認知功能的神經保護作用[25]。本研究采用Morris水迷宮檢測肉蓯蓉總苷治療間歇大鼠后學習記憶功能的變化。實驗結果顯示與空白對照組比較，低氧組及總苷干預組大鼠逃避潛伏期時間均逐漸延長，而跨越目標象限時間均逐漸縮短；與低氧組比較，總苷干預組大鼠逃避潛伏期時間均逐漸縮短，而跨越目標象限時間均逐漸延長。水迷宮實驗結果表明肉蓯蓉總苷可以改善間歇大鼠的學習記憶功能。國內學者已經進行關于肉蓯蓉總苷改善認知功能的基礎和臨床研究，黃惠蓮等[26]報道了肉蓯蓉總苷可有效提高血管性癡呆患者的認知功能，改善其日常生活能力；同時劉心朗等[27]研究發現肉蓯蓉總苷有助于改善快速老化小鼠學習和記憶，提高突觸可塑性作用更顯著；賈建新等[28]報道肉蓯蓉總苷可能是通過提高快速老化小鼠海馬區自由基清除酶活性，減輕脂質過氧化反應來改善其空間學習記憶能力。本研究進一步證實肉蓯蓉總苷能在一定程度上升高間歇大鼠海馬區SOD的水平，同時減少MDA含量，具有改善認知功能的作用，推測其改善認知功能的機制可能與抑制間歇低氧大鼠海馬區神經細胞氧化應激有關。
本研究還存在一些不足，主要包括缺乏不同劑量肉蓯蓉總苷干預間歇低氧大鼠的療效觀察，同時未分析肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠海馬區神經細胞形態的影響。下一步應增加相關研究，繼續深入探討肉蓯蓉總苷的抗氧化作用在間歇低氧大鼠腦損傷中的神經保護機制。
綜上所述，本研究證實肉蓯蓉總苷能在一定程度上改善間歇低氧大鼠的認知功能，進一步為臨床上防治SAS并發認知功能障礙提供理論依據，具有一定的應用價值。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（sleep apnea-hypopnea syndrome，SAS）可引起不同程度的間歇低氧，造成多系統損傷[1-2]。認知功能損傷是SAS最常見的并發癥之一[3]，氧化應激是SAS發生認知功能損傷的主要機制[4-6]。緩解SAS患者氧化應激的首選方法是持續氣道正壓通氣[7]，目前關于抗氧化劑改善SAS導致的氧化應激的研究較少。肉蓯蓉總苷是由植物肉蓯蓉提取得到的化合物，苯乙醇苷類是其主要活性成分，現代醫學研究證實肉蓯蓉總苷不僅具有抗氧化及清除自由基等作用，而且具有改善認知功能的作用[8-9]。國內學者發現肉蓯蓉總苷可改善阿爾茨海默病模型大鼠學習認知功能，其機制可能通過抑制體內氧化應激反應，進而提高突觸可塑性來實現[10]。目前肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠認知功能損傷的作用尚不清楚，本研究旨在探討肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠氧化應激水平的影響，闡述其治療SAS認知功能損傷的相關作用機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
成年健康雄性Wistar大鼠72只，體質量（170±10）g，由北京維通利華實驗動物科技有限公司提供。本實驗通過華北理工大學動物倫理委員會的批準（批準號：LAEC-NCST-2020072）。
1.1.2 實驗儀器和設備
自行設計制造間歇低氧艙，低氧控制程序（華北理工大學附屬醫院呼吸科），Morris水迷宮（上海移數信息科技有限公司），全無油潤滑空氣壓縮機（浙江博大實業有限公司），離心機（德國Eppendorf公司），酶標儀（美國Bio-Rad公司），分光光度計（上海光譜儀器有限公司）。
1.1.3 實驗主要試劑
肉蓯蓉總苷（上海源葉生物科技有限公司，純度規格：85%），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（WST-8法）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（TBA法）均為上海碧云天生物技術有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組
采用隨機數字法將大鼠分為3組：空白對照組、5%間歇性低氧組（簡稱低氧組）、肉蓯蓉總苷干預組（簡稱總苷干預組）。每組又分為2、4、6和8周時間組，各時間組6只大鼠。
1.2.2 間歇低氧大鼠模型的建立以及肉蓯蓉總苷干預
每日8∶00給與總苷干預組大鼠肉蓯蓉總苷灌胃治療，干預劑量為50 mg·kg–1·d–1，采用滅菌注射用水將肉蓯蓉總苷溶解，滅菌注射用水用量按照大鼠的灌胃給藥體積為10 mL/kg計算，30 min后于8∶30～16∶30將總苷干預組及低氧組大鼠置于間歇低氧箱內。間歇低氧大鼠制作方法參照文獻［11］，總苷干預組及低氧組大鼠循環交替給予不同流量氮氣和壓縮空氣。每一循環120 s：前30 s為氮氣，接著40 s為高流量壓縮空氣，最后50 s為低流量壓縮空氣。用數字測氧儀監測艙內氧體積分數變化，使兩個實驗組箱內前30 s氧濃度逐漸降至5%，接著40 s氧濃度逐漸恢復至21%，維持50 s使間歇低氧箱內氧濃度波動范圍在±0.5%以內，兩組低氧艙內氧濃度在5%～21%間循環。空白對照組大鼠不給予任何處理，其艙內氧濃度維持在21%。實驗結束將實驗動物取出，送入常規飼養箱內自由飲水與攝食，生活環境及飼養條件相同。間歇低氧及肉蓯蓉總苷干預分別持續2、4、6、8周。
1.2.3 水迷宮檢測方法
參照文獻[11-12]的方法，采用Morris水迷宮對三組大鼠進行學習記憶功能檢測。每只大鼠晨起訓練5次后分別在上午、下午各測試6次，分別記錄各組大鼠逃避潛伏期時間和跨越目標象限時間。
1.2.4 SOD及MDA的檢測
于各間歇低氧時間點結束后給予各組大鼠進行腹腔麻醉，麻醉藥物為10%水合氯醛（300 mg/kg），大鼠被腹腔麻醉之后斷頭取腦，迅速分離海馬組織后，留取標本–80 ℃冰箱保存。采用WST-8法檢測SOD活性，采用TBA法檢測MDA水平，各步驟嚴格按照其試劑盒說明書操作。
1.3 統計學方法
采用SPSS 19.0統計軟件，呈正態分布的計量數據用均數±標準差（±s）表示，組間及組內比較采用單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 三組大鼠水迷宮結果
2.1.1 定位航行實驗
與空白對照組比較，低氧組和總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6、8周的逃避潛伏期均顯著延長（P<0.05）。與低氧組比較，總苷干預組大鼠的逃避潛伏期在間歇低氧2、4、6、8周均顯著縮短（P<0.05）。總苷干預組和低氧組大鼠從間歇低氧2周開始逃避潛伏期逐漸延長，隨著間歇低氧時間的延長，于8周達到高峰（P<0.05）。空白對照組在2、4、6、8周逃避潛伏期無顯著差異。結果見表1。
表1
各組大鼠逃避潛伏期、跨越目標象限時間、海馬組織SOD和MDA水平（）
2.1.2 空間探索實驗
與空白對照組比較，在間歇低氧2、4、6、8周低氧組和總苷干預組大鼠的跨越目標象限時間均顯著減少（P<0.05）。與低氧組相比，總苷干預組大鼠跨越目標象限時間分別于間歇低氧2、4、6、8周顯著增加（P<0.05）。低氧組和總苷干預組大鼠的跨越目標象限時間均于間歇低氧2周開始降低，隨著間歇低氧時間的延長，于8周降到最低（P<0.05）。空白對照組的跨越目標象限時間在2、4、6、8周無顯著差異。結果見表1。
2.2 三組大鼠氧化應激實驗結果
與空白對照組比較，低氧組和總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6和8周時海馬組織SOD表達水平均顯著降低（P<0.05）。與間歇低氧組比較，總苷干預組大鼠SOD水平分別在2、4、6、8周顯著升高（P<0.05）。間歇低氧組和總苷干預組大鼠的SOD表達水平從間歇低氧2周開始下降，并于8周達到最低（P<0.05）。但空白對照組的SOD表達水平在2、4、6、8周無顯著差異。結果見表1。
與空白對照組比較，低氧組和總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6和8周時海馬組織MDA水平均顯著升高（P<0.05）。與低氧組比較，總苷干預組大鼠在間歇低氧2、4、6、8周MDA表達水平均顯著下降（P<0.05）。低氧組和總苷干預組大鼠的MDA水平從間歇低氧2周開始升高，并于8周達到最高（P<0.05）。空白對照組的MDA水平在2、4、6、8周無顯著差異。結果見表1。
3 討論
在臨床上SAS的發病率逐漸升高，可造成神經系統損傷，尤以認知功能障礙最為顯著[13]。氧化應激是SAS并發認知功能障礙的主要病理機制，因此在臨床上常采用持續氣道正壓通氣緩解SAS患者間歇低氧，進而改善其氧化應激，具有明顯療效[14-15]。但是由于部分患者不能有效耐受持續氣道正壓通氣的治療，從而造成一部分患者治療效果差，嚴重影響其生存質量。抗氧化藥物逐漸用于研究治療SAS并發的認知功能障礙，但目前用于臨床試驗的抗氧化藥物療效欠佳[16]。
目前研究表明依達拉奉、白藜蘆醇等抗氧化劑可抑制間歇低氧大鼠氧化應激，進而改善其認知障礙[17-18]。肉蓯蓉總苷為強抗氧化劑，能有效清除自由基及抗炎作用，從而起到神經保護作用，同時具有促進神經功能恢復的功效[19-20]。SOD和MDA是反映機體氧化應激反應的關鍵指標，已在間歇低氧大鼠模型中被廣泛研究[21-22]。然而肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠海馬氧化應激的影響尚不明確，為此本研究探討肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠海馬氧化應激的影響。結果發現低氧組及總苷干預組海馬區神經細胞MDA表達均多于空白對照組，而SOD表達均低于空白對照組；與低氧組比較，總苷干預組海馬區神經細胞MDA表達均降低，而SOD表達增加。王璐等[10]研究發現肉蓯蓉總苷能提高改善阿爾茨海默病模型大鼠血清SOD活性，降低MDA的含量，從而抑制氧化應激來改善海馬CA1區錐體細胞的存活率。樊燕燕等[23]發現不同劑量肉蓯蓉總苷可提高缺血再灌注神經細胞細胞活力，降低凋亡率，具有神經保護作用。同時劉恩寵等[24]也發現于飲水中補充肉蓯蓉毛蕊花苷能升高慢性全腦低灌小鼠模型小鼠腦組織MDA水平，上調其SOD活性，逆轉乙酰膽堿酯酶活性，提示肉蓯蓉毛蕊花苷對慢性腦低灌注導致的神經損傷有一定神經保護作用，其機制通過抑制氧化應激來實現。這充分說明肉蓯蓉總苷具有較強的抗氧化特性和神經保護作用。結合國內已有的研究結果及本實驗結果證實肉蓯蓉總苷能有效降低間歇低氧大鼠海馬氧化應激的水平，進而可能改善間歇低氧大鼠海馬區神經細胞的損傷。
肉蓯蓉總苷不僅具有抗氧化作用，而且也具有改善認知功能的神經保護作用[25]。本研究采用Morris水迷宮檢測肉蓯蓉總苷治療間歇大鼠后學習記憶功能的變化。實驗結果顯示與空白對照組比較，低氧組及總苷干預組大鼠逃避潛伏期時間均逐漸延長，而跨越目標象限時間均逐漸縮短；與低氧組比較，總苷干預組大鼠逃避潛伏期時間均逐漸縮短，而跨越目標象限時間均逐漸延長。水迷宮實驗結果表明肉蓯蓉總苷可以改善間歇大鼠的學習記憶功能。國內學者已經進行關于肉蓯蓉總苷改善認知功能的基礎和臨床研究，黃惠蓮等[26]報道了肉蓯蓉總苷可有效提高血管性癡呆患者的認知功能，改善其日常生活能力；同時劉心朗等[27]研究發現肉蓯蓉總苷有助于改善快速老化小鼠學習和記憶，提高突觸可塑性作用更顯著；賈建新等[28]報道肉蓯蓉總苷可能是通過提高快速老化小鼠海馬區自由基清除酶活性，減輕脂質過氧化反應來改善其空間學習記憶能力。本研究進一步證實肉蓯蓉總苷能在一定程度上升高間歇大鼠海馬區SOD的水平，同時減少MDA含量，具有改善認知功能的作用，推測其改善認知功能的機制可能與抑制間歇低氧大鼠海馬區神經細胞氧化應激有關。
本研究還存在一些不足，主要包括缺乏不同劑量肉蓯蓉總苷干預間歇低氧大鼠的療效觀察，同時未分析肉蓯蓉總苷對間歇低氧大鼠海馬區神經細胞形態的影響。下一步應增加相關研究，繼續深入探討肉蓯蓉總苷的抗氧化作用在間歇低氧大鼠腦損傷中的神經保護機制。
綜上所述，本研究證實肉蓯蓉總苷能在一定程度上改善間歇低氧大鼠的認知功能，進一步為臨床上防治SAS并發認知功能障礙提供理論依據，具有一定的應用價值。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
