引用本文： 方章蘭, 田藝, 羅玲. 沙丁胺醇聯合Y-27632對豬氣道平滑肌舒張作用的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(9): 651-657. doi: 10.7507/1671-6205.202208029 復制
哮喘是一種慢性異質性疾病，其發病及致死率仍呈逐漸上升的趨勢，給人們的生活帶來嚴重的負擔[1-3]。目前認為哮喘的主要病理生理特征包括氣道高反應性、氣道重塑和慢性炎癥[4-6]，這些都與哮喘的嚴重程度和較差的長期臨床結局有關。研究表明氣道平滑肌在調節哮喘患者的支氣管運動張力中起著核心作用，其不僅參與炎癥反應、氣道重構等過程，還作為主導和實現氣道收縮–舒張功能的重要靶組織，可以控制氣道管徑大小，從而影響氣流速度，氣道阻力等[7-8]。氣道平滑肌生物力學行為包括收縮力、剛度、僵硬度、順應性以及力–速度曲線、力–功率曲線等力學特性，這些生物力學行為的改變既是哮喘發病的結果，也是導致了氣道收縮–舒張功能失衡，誘發氣道高反應性重要原因之一。由此看來，改變氣道平滑肌生物力學行為，降低收縮性可能是哮喘治療的一個新興靶點。
至今為止，氣道平滑肌生物力學行為的調控仍未完全清楚。研究認為氣道平滑肌主要以“肌動–肌球蛋白”為收縮單位，以“肌絲滑動”原理進行收縮[9]。在平滑肌的收縮單位中，“肌動–肌球蛋白”橫橋決定了收縮力的大小、收縮速度、剛度及順應性的變化。有研究發現Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK）信號轉導通路作為一條非Ca2+依賴的細胞內信號轉導通路，通過Rho激活下游激酶ROCK可產生重要的級聯反應，發揮多種生物學功能[10-12]。在氣道平滑肌，Rho/ROCK信號通路參與調控胞漿內磷酸化和去磷酸化肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC20）相互轉換的動態平衡[13]，在收縮劑刺激的平滑過程中，ROCK促進肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）的活性，使MLC20不斷地被磷酸化，平滑肌收縮力增加。另一方面，ROCK信號同時可抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的作用[14]，減輕MLCP對磷酸基團的水解作用，反方向的增加了MLC20的磷酸化水平，從而增加磷酸化的橫橋數量，增加平滑肌收縮力。
目前，國外的研究者已經針對平滑肌的力學特性及Rho/ROCK信號轉導通路進行研究，旨在于研發新的治療方法來替代傳統藥物治療。Gosens等[15]的研究已經證實Rho/ROCK信號通路參與了人哮喘的病理生理過程。Schaafsma等[16]發現吸入型ROCK抑制劑可防止過敏原引起的急性支氣管收縮、氣道高反應性和炎癥。在動物模型中，大鼠哮喘模型組氣道平滑肌高表達RhoA及ROCK mRNA[17]，吸入ROCK抑制劑法舒地爾（Y-27632）后豚鼠氣道重塑減少，氣道高反應性降低[18]。這些研究表明ROCK抑制劑是一種有希望且新穎的哮喘治療靶標。此外，傳統β2受體激動劑在哮喘的防治領域具有重要作用，臨床上被用作緩解哮喘發作的首選藥物。沙丁胺醇作為經典的β2受體激動劑，通過激活細胞膜上的腺苷酸環化酶，催化ATP生成cAMP，使cAMP含量增加，使細胞內游離Ca2+減少，引起平滑肌舒張，這屬于平滑肌細胞外信號轉導途徑[19]。臨床上長期使用的β2受體激動劑可能加重氣道反應，β2受體減敏，從而在臨床上出現耐藥或無反應[20]。目前認為，β2激動劑受體減敏與其胞內信號通路有著密切的關系[21]，需要鑒定新的藥物來逆轉無反應的氣道收縮。
因此，根據氣道平滑以上兩種藥物作用機制的分析，β2受體激動劑作為傳統的緩解哮喘發作的首選藥物，現臨床療效肯定，而ROCK抑制劑可能是哮喘治療的新靶標。本研究擬探討β2受體激動劑沙丁胺醇與ROCK抑制劑Y-27632聯合對豬氣道平滑肌的舒張作用，旨在于為哮喘的藥物治療找尋新的途徑。
1 材料與方法
1.1 平滑肌組織條帶的制備和平衡化
在當地屠宰場獲取新鮮的豬氣管環標本（體重約120 kg，身長約148 cm，品系為榮昌豬），先將離體豬氣管環保存在4 ℃ Kreb生理溶液中。顯微鏡下剝離平滑肌層，分離出一小條清理干凈的平滑肌組織條帶，寬1～2 mm，長6～10 mm，厚0.2～0.3 mm，然后于平滑肌組織帶條的兩端固定鋁箔夾，置于Kreb生理溶液備用。實驗時將平滑肌條帶取出，測量初始長度及寬度，然后將帶有鋁箔片的平滑肌條帶固定在力/長度傳感器上。之后被置于含有37.5 ℃ Kreb生理溶液的恒溫浴缸中，為保持平滑肌活力及pH穩定，該系統中持續輸入含95%的氧氣和5%的二氧化碳的混合氣體。同時加入吲哚美欣（2×10–2mmol/L，50 μL）以去除平滑肌張力，待藥物充分滲透1 h后開始進行刺激實驗。
1.2 實驗分組及處置
分為空白組（不給予任何刺激）、電場刺激組（Fmax組及50%Fmax兩個亞組）。圖1顯示了在電場刺激情況下平滑肌條帶的收縮曲線。實驗組平滑肌予以電場刺激循環刺激（60 Hz，10～15 V，每次刺激10 ms，每5 min 1次），當外源性刺激使平滑肌達到最大收縮力并保持穩定3個刺激周期，認定為平滑肌最大等長收縮力（maximal isometric force，Fmax），此為Fmax組。達到Fmax后進行電壓調節，使肌力為50%Fmax左右，此為50%Fmax組。每個亞組（Fmax組及50%Fmax組）又根據干預藥物的不同分為對照組（不給予任何藥物）、Y-27632組、沙丁胺醇組、沙丁胺醇+Y-27632組。沙丁胺醇和Y-27632藥物濃度及體積均一致（1×10–7mmol/L，0.01 mL），當實驗藥物效應達到最大時，記錄為藥效達到最大的時間（Tmax）。每組給予相應的干預藥物后繼續完成以下內容：獲取平滑肌收縮力、長度變化等力學指標。
圖1
電場刺激循環下平滑肌條帶收縮力變化
曲線a、b分別為達到Fmax、50%Fmax等張收縮狀態。EFS：電場刺激。
1.3 平滑肌力學指標的獲取
平滑肌的收縮力、長度的變化等可通過計算機系統獲取。平滑肌舒張百分比=舒張變化的長度/最大縮短長度×100%。
1.4 蛋白印跡法測定平滑肌組織條Rock-Ⅱ及MLC20水平
平滑肌條帶在實驗條件下被急速冷凍來檢測MLC20。冷凍方法：在平滑肌還在測量設備上時，給予相應刺激，達到實驗最大效應時，即Fmax，將恒溫浴缸快速移開，將平滑肌組織條浸入用干冰（–78.5 ℃）冷卻好的丙酮液體中急速冷凍，之后將氣管平滑肌組織條帶迅速取下，然后放置入冷凍好的含有丙酮，5%三氯乙酰酸和10 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）的試劑。調整電刺激參數，當肌力達到50% Fmax，同樣的方法冷凍平滑肌條帶。
用蛋白印跡法測定平滑肌組織中Rock-Ⅱ水平。將平滑肌組織置于蛋白提取液中，獲得蛋白勻漿，經過冰浴、離心，取上層清澈蛋白提取物，行15% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，加一抗。應用兔抗人ROCK多克隆抗體（1∶200），兔抗人β-肌動蛋白（β-actin。1∶200）抗體。之后加入羊抗兔二抗（1∶150）孵育，二抗經過辣根過氧化物酶標記。顯色帶通過Quantity One軟件進行灰度分析，以β-actin為參照。
用蛋白印跡法測定平滑肌組織中MLC20磷酸化水平。首先，對平滑肌組織條帶進行蛋白質提取，用含10 mmol/L DTT的丙酮清洗平滑肌組織條帶2次，每次清洗持續30 min，以洗出三氯乙酰酸，之后在裂解緩沖液中被均化（150 μL/mg組織濕重）。裂解緩沖液成分：6.4 mol/L尿素，10 mmol/L DTT，10 mmol/L EDTA，5 mmol/L NaF，28.6 mmol/L甘氨酸，26.4 mmol/L tris堿，1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物。第二，在10%的甘油，3%丙烯酰胺–尿素非變性基層凝膠上分離磷酸化和非磷酸化MLC20。第三，經過處理，樣本已被溶解，在每一個條帶上加入相等的量進行電泳，電壓為200 V，持續2.5 h。電泳緩沖液含有50 mmol/L Tris及100 mmol/L甘氨酸，2 μL/mL β硫基乙醇加入到里層。之后蛋白被以25 V電壓，4 ℃下，隔夜轉移到硝化纖維膜上。非特異性的結合是由TBS-5%，1 h BSA來控制的。第四，進行蛋白質免疫沉淀，順序首先是使用MLC20的單克隆抗體（1∶50000），TBST 5%，BSA。在一抗和二抗之間，用TBST洗膜，二抗之后，再用TBST洗膜。第五，膜使用LI-CORD Odsey系統進行掃描，用帶有Odyssey2.1軟件的計算進行背景分析。第六，計算MLC20磷酸化水平，MLC20磷酸化水平=磷酸化的MLC20/（磷酸化的MLC20+非磷酸化的MLC20）×100%。
1.5 統計學方法
所有統計分析均使用軟件Origin8進行分析。呈正態分布的數據以均數±標準差（
±s）表示，大多數統計分析使用雙向方差分析。一些指標比較通過兩兩獨立t檢驗或者多組間的單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 空白組、電刺場激組50%Fmax組和Fmax組平滑肌組織條帶中Rock-Ⅱ表達水平、MLC20的磷酸化趨勢
在電場刺激組中，給予不同電壓刺激，使收縮力達到Fmax及約50%Fmax，在等張收縮狀態下，分別快速冷凍兩組的平滑肌組織條，用蛋白印跡法分別測定Rock-Ⅱ及MLC20的水平。結果發現，如圖2a所示，在空白組、50%Fmax、Fmax三組中，平滑肌組織條中Rock-Ⅱ表達水平呈遞增趨勢（P=0.037）。此外，如圖2c所示，在空白組、50%Fmax、Fmax等張收縮組中，平滑肌組織條中MLC20的磷酸化水平也呈遞增趨勢（P=0.049），但三組間MLC20總量比較，差異無統計學意義（P=0.725）。
圖2
對照組、Fmax組及50%Fmax組平滑肌條帶在不同收縮狀況下的Rock-Ⅱ和MLC20表達（n=4）
a、b. ROCK-Ⅱ蛋白表達及半定量結果；c、d. 總MLC20（Total-LC20）、磷酸化MLC20（P-MLC20）蛋白表達及半定量結果。*
2.2 電場刺激組在等張收縮狀態下，對照組、沙丁胺醇組、Y-27632組、沙丁胺醇+Y-27632組的舒張百分比的變化
在50%Fmax電場刺激的4個亞組（對照組、沙丁胺醇組、Y-27632組、沙丁胺醇+Y-27632組）中，如圖3，T=10 min時，舒張百分比分別為0.7%、2.5%、6.0%、15.0%；T=20 min時，舒張百分比分別為1.8%、4.5%、7.5%、21.0%；T=40 min時，舒張百分比分別為1.9%、7.5%、7.9%、22.0%；T=60 min舒張百分比分別為2.0%、8.0%、8.8%、22.5%。在Fmax電場刺激的4個亞組中，如圖4，T=10 min時，舒張百分比分別為1.0%、3.0%、7.0%、17.0%；T=20 min時，舒張百分比分別為2.6%、5.5%、9.0%、24.0%；T=40 min時，舒張百分比分別為2.8%、9.0%、9.5%、27.5%；T=60 min時，舒張百分比分別為2.9%、10.5%、10.5%、28.0%。在50%Fmax、Fmax電場刺激組中，對照組、沙丁胺醇組、Y-27632組、沙丁胺醇+Y-27632組的平滑肌舒張百分比均隨時間依次呈遞增趨勢，各組在40 min左右達到最大舒張效果，即Tmax為40 min，繼續延長時間，舒張效應無明顯增加。組間差異分析顯示，在相同作用時間的情況下，沙丁胺醇與Y-27632聯合組的平滑肌舒張百分比明顯大于單用沙丁胺醇組和單用Y-7632組的舒張百分比（P<0.05）。此外，聯合干預的平滑肌舒張百分比也優于二者單藥干預的數學和效應（P<0.05）。
圖3
電場刺激50%Fmax組中，分別給予不同藥物干預，不同組別間平滑肌舒張百分比–時間變化圖（n=4）
沙丁胺醇+Y-27632組分別與沙丁胺醇組、Y-27632組、二者單藥干預的數學總和比較，*
圖4
電場刺激Fmax組中，分別給予不同藥物干預，不同組別間平滑肌舒張百分比–時間變化圖（n=4）
沙丁胺醇+Y-27632組分別與沙丁胺醇組、Y-27632組、二者單藥干預的數學總和比較，*
3 討論
在本研究中，我們發現平滑肌條帶的收縮力及收縮強度越強，ROCK表達水平越高、MLC20磷酸化水平也越高。在空白組、電場刺激組（50%Fmax、Fmax）中，隨著收縮力及強度的增強，平滑肌組織條中ROCK表達水平及MLC20磷酸化水平越高，MLC20總量并無明顯差異，表明ROCK相關的信號通路參與氣道平滑肌的調節。先前的證據表明，Rho激酶可能是哮喘的潛在藥物靶點，RhoA/Rho激酶通過調節MLC磷酸酶活性，以誘導氣道平滑肌松弛[22]。Rho激酶對MLCP以及調節肌動蛋白聚合的酶均具有直接和間接抑制作用[23]。Puetz等[24]發現在實驗性哮喘中RhoA/Rho激酶介導的Ca2+致敏作用顯著增強，并參與了支氣管平滑肌高反應性。Chiba等[25]在哮喘患者中觀察到的RhoA/Rho激酶激活增加與支氣管平滑肌收縮和氣道高反應性有關。此外，最新表明RhoA不僅與氣道高反應性有關，而且與哮喘的其他關鍵特征，例如氣道重塑、過敏性氣道炎癥和氣道屏障功能障礙有關[26-28]。由此可見，ROCK相關的信號通路是氣道平滑肌調節的重要通路，但具體的信號機制仍需進一步研究。
RhoA/Rho激酶是調節MLC磷酸酶肌球蛋白結合亞基磷酸化，從而促進平滑肌收縮的細胞內分子之一。早期相關研究發現Y-27632抑制了氣道平滑肌收縮，而不降低細胞內Ca2+的濃度[29]。在小鼠哮喘模型研究中，ROCK抑制劑能降低MLC的磷酸化和減輕氣道高反應性[30]，Y-27632可通過抑制Rho激酶-1的表達和活性，從而改善哮喘氣道炎癥反應[31]。Pazhoohan等[32]研究發現吸入ROCK抑制劑Y-27632的豚鼠氣道重塑減少，氣道高反應性降低。有研究表明Y-27632可以舒張人離體的支氣管平滑肌，可抑制乙酰膽堿和電場刺激誘導的支氣管收縮，使用后支氣管舒張作用迅速開始并持續超過8 h[33]。RhoA/Rho激酶通過影響哮喘發病機制中各種炎癥細胞（例如嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞和T細胞）的遷移、分化和功能來參與調節氣道炎癥[34]。但Raqeeb等[35]研究提出Y-27632的作用可能與MLCP途徑無關，他們在實驗中觀察到其作用可能與調節細胞骨架組織的信號通路有關，但同時提出涉及Rho激酶激活的途徑在產生被動剛度中也很重要，當ROCK抑制劑Y-27632將主動力降低時，對鈣敏感的被動剛度也降低了。以上實驗均表明ROCK抑制劑在治療哮喘中的重要性，但以上實驗均未對其組織的生物力學行為進行進一步的探索。
我們針對豬氣道平滑肌生物力學的探究發現，無論是在50%Fmax還是Fmax電場刺激的狀態下，在使用ROCK抑制劑Y-27632的亞組中，與對照組相比，平滑肌舒張百分比明顯增加，這表明ROCK抑制劑信號轉導通路與哮喘氣道平滑肌生物力學及收縮–舒張功能關系密切。在沙丁胺醇與Y-27632聯合干預的亞組中，氣道平滑肌的舒張百分比明顯大于單純使用沙丁胺醇組和單純使用Y-27632組的效果，也大于兩組的數學和效應，這表明沙丁胺醇與Y-27632聯合干預對氣道平滑肌的舒張作用優于二者分別干預的效果和。上述結果表明，二者聯合對豬氣道平滑肌的舒張作用增強，可能具有協同作用。既往的研究也表明Rho激酶抑制劑可增強β2激動劑在氣道平滑肌中的松弛作用[36]，與本研究結果具有一致性。但目前二者相互作用的具體機制尚不明確，既往研究表明這可能與腺苷酸環化酶刺激性G蛋白（the stimulatory G protein of adenylyl cyclase，Gs）和RhoA/Rho激酶之間的抑制作用有關，Gs是一種位于Rho激酶和Ca2+通道的上游的G蛋白，它控制細胞內Ca2+的敏感性和濃度。當Gs與RhoA/Rho激酶的抑制性關系失衡時，會導致RhoA激酶活性增加，通過Ca2+致敏作用，使β2腎上腺素能脫敏，而應用Y-27632可以逆轉這種趨勢[37-38]。Kume等[38]提出，腎上腺素能受體激動劑耐藥的主要原因是長期暴露于炎癥細胞釋放的蛋白酶后，通過Ca2+致敏作用，對藥物的反應性降低，而ROCK抑制劑可抑制與哮喘有關的物質（如收縮性激動劑和活性氧）所引起的氣道平滑肌收縮，使腎上腺素能脫敏作用也被減弱。此外，Schellenberg等[39]發現，Y-27632顯著降低了β2腎上腺素受體數，而不影響受體對放射性配體的親和力，相比之下，Y-27632增強了β激動劑刺激的細胞內cAMP產生，使細胞內游離Ca2+減少，引起平滑肌舒張。由此可見，β2激動劑沙丁胺醇與ROCK抑制劑Y-27632聯合干預氣道平滑肌時，二者相互作用的機制仍需進一步研究。
綜上所述，本研究結果表明在電場刺激平滑肌收縮中，平滑肌收縮力及收縮強度越強，ROCK表達水平越高、MLC20磷酸化水平越高。此外，沙丁胺醇聯合Y-27632對收縮的豬氣道平滑肌可能具有協同舒張作用，這可能為哮喘的聯合用藥提供新的思路和方法。但本研究仍存在不足之處，研究對象主要針對豬氣道平滑肌，且為離體實驗，尚未在動物體內實驗或人體試驗進行驗證，也未對沙丁胺醇與Y-27632的藥物劑量和相關不良反應等方面進行觀察，后期仍需要進一步的研究來證實二者聯合用藥的療效及不良反應。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
哮喘是一種慢性異質性疾病，其發病及致死率仍呈逐漸上升的趨勢，給人們的生活帶來嚴重的負擔[1-3]。目前認為哮喘的主要病理生理特征包括氣道高反應性、氣道重塑和慢性炎癥[4-6]，這些都與哮喘的嚴重程度和較差的長期臨床結局有關。研究表明氣道平滑肌在調節哮喘患者的支氣管運動張力中起著核心作用，其不僅參與炎癥反應、氣道重構等過程，還作為主導和實現氣道收縮–舒張功能的重要靶組織，可以控制氣道管徑大小，從而影響氣流速度，氣道阻力等[7-8]。氣道平滑肌生物力學行為包括收縮力、剛度、僵硬度、順應性以及力–速度曲線、力–功率曲線等力學特性，這些生物力學行為的改變既是哮喘發病的結果，也是導致了氣道收縮–舒張功能失衡，誘發氣道高反應性重要原因之一。由此看來，改變氣道平滑肌生物力學行為，降低收縮性可能是哮喘治療的一個新興靶點。
至今為止，氣道平滑肌生物力學行為的調控仍未完全清楚。研究認為氣道平滑肌主要以“肌動–肌球蛋白”為收縮單位，以“肌絲滑動”原理進行收縮[9]。在平滑肌的收縮單位中，“肌動–肌球蛋白”橫橋決定了收縮力的大小、收縮速度、剛度及順應性的變化。有研究發現Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK）信號轉導通路作為一條非Ca2+依賴的細胞內信號轉導通路，通過Rho激活下游激酶ROCK可產生重要的級聯反應，發揮多種生物學功能[10-12]。在氣道平滑肌，Rho/ROCK信號通路參與調控胞漿內磷酸化和去磷酸化肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC20）相互轉換的動態平衡[13]，在收縮劑刺激的平滑過程中，ROCK促進肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）的活性，使MLC20不斷地被磷酸化，平滑肌收縮力增加。另一方面，ROCK信號同時可抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的作用[14]，減輕MLCP對磷酸基團的水解作用，反方向的增加了MLC20的磷酸化水平，從而增加磷酸化的橫橋數量，增加平滑肌收縮力。
目前，國外的研究者已經針對平滑肌的力學特性及Rho/ROCK信號轉導通路進行研究，旨在于研發新的治療方法來替代傳統藥物治療。Gosens等[15]的研究已經證實Rho/ROCK信號通路參與了人哮喘的病理生理過程。Schaafsma等[16]發現吸入型ROCK抑制劑可防止過敏原引起的急性支氣管收縮、氣道高反應性和炎癥。在動物模型中，大鼠哮喘模型組氣道平滑肌高表達RhoA及ROCK mRNA[17]，吸入ROCK抑制劑法舒地爾（Y-27632）后豚鼠氣道重塑減少，氣道高反應性降低[18]。這些研究表明ROCK抑制劑是一種有希望且新穎的哮喘治療靶標。此外，傳統β2受體激動劑在哮喘的防治領域具有重要作用，臨床上被用作緩解哮喘發作的首選藥物。沙丁胺醇作為經典的β2受體激動劑，通過激活細胞膜上的腺苷酸環化酶，催化ATP生成cAMP，使cAMP含量增加，使細胞內游離Ca2+減少，引起平滑肌舒張，這屬于平滑肌細胞外信號轉導途徑[19]。臨床上長期使用的β2受體激動劑可能加重氣道反應，β2受體減敏，從而在臨床上出現耐藥或無反應[20]。目前認為，β2激動劑受體減敏與其胞內信號通路有著密切的關系[21]，需要鑒定新的藥物來逆轉無反應的氣道收縮。
因此，根據氣道平滑以上兩種藥物作用機制的分析，β2受體激動劑作為傳統的緩解哮喘發作的首選藥物，現臨床療效肯定，而ROCK抑制劑可能是哮喘治療的新靶標。本研究擬探討β2受體激動劑沙丁胺醇與ROCK抑制劑Y-27632聯合對豬氣道平滑肌的舒張作用，旨在于為哮喘的藥物治療找尋新的途徑。
1 材料與方法
1.1 平滑肌組織條帶的制備和平衡化
在當地屠宰場獲取新鮮的豬氣管環標本（體重約120 kg，身長約148 cm，品系為榮昌豬），先將離體豬氣管環保存在4 ℃ Kreb生理溶液中。顯微鏡下剝離平滑肌層，分離出一小條清理干凈的平滑肌組織條帶，寬1～2 mm，長6～10 mm，厚0.2～0.3 mm，然后于平滑肌組織帶條的兩端固定鋁箔夾，置于Kreb生理溶液備用。實驗時將平滑肌條帶取出，測量初始長度及寬度，然后將帶有鋁箔片的平滑肌條帶固定在力/長度傳感器上。之后被置于含有37.5 ℃ Kreb生理溶液的恒溫浴缸中，為保持平滑肌活力及pH穩定，該系統中持續輸入含95%的氧氣和5%的二氧化碳的混合氣體。同時加入吲哚美欣（2×10–2mmol/L，50 μL）以去除平滑肌張力，待藥物充分滲透1 h后開始進行刺激實驗。
1.2 實驗分組及處置
分為空白組（不給予任何刺激）、電場刺激組（Fmax組及50%Fmax兩個亞組）。圖1顯示了在電場刺激情況下平滑肌條帶的收縮曲線。實驗組平滑肌予以電場刺激循環刺激（60 Hz，10～15 V，每次刺激10 ms，每5 min 1次），當外源性刺激使平滑肌達到最大收縮力并保持穩定3個刺激周期，認定為平滑肌最大等長收縮力（maximal isometric force，Fmax），此為Fmax組。達到Fmax后進行電壓調節，使肌力為50%Fmax左右，此為50%Fmax組。每個亞組（Fmax組及50%Fmax組）又根據干預藥物的不同分為對照組（不給予任何藥物）、Y-27632組、沙丁胺醇組、沙丁胺醇+Y-27632組。沙丁胺醇和Y-27632藥物濃度及體積均一致（1×10–7mmol/L，0.01 mL），當實驗藥物效應達到最大時，記錄為藥效達到最大的時間（Tmax）。每組給予相應的干預藥物后繼續完成以下內容：獲取平滑肌收縮力、長度變化等力學指標。
圖1
電場刺激循環下平滑肌條帶收縮力變化
曲線a、b分別為達到Fmax、50%Fmax等張收縮狀態。EFS：電場刺激。
1.3 平滑肌力學指標的獲取
平滑肌的收縮力、長度的變化等可通過計算機系統獲取。平滑肌舒張百分比=舒張變化的長度/最大縮短長度×100%。
1.4 蛋白印跡法測定平滑肌組織條Rock-Ⅱ及MLC20水平
平滑肌條帶在實驗條件下被急速冷凍來檢測MLC20。冷凍方法：在平滑肌還在測量設備上時，給予相應刺激，達到實驗最大效應時，即Fmax，將恒溫浴缸快速移開，將平滑肌組織條浸入用干冰（–78.5 ℃）冷卻好的丙酮液體中急速冷凍，之后將氣管平滑肌組織條帶迅速取下，然后放置入冷凍好的含有丙酮，5%三氯乙酰酸和10 mmol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）的試劑。調整電刺激參數，當肌力達到50% Fmax，同樣的方法冷凍平滑肌條帶。
用蛋白印跡法測定平滑肌組織中Rock-Ⅱ水平。將平滑肌組織置于蛋白提取液中，獲得蛋白勻漿，經過冰浴、離心，取上層清澈蛋白提取物，行15% SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，封閉，加一抗。應用兔抗人ROCK多克隆抗體（1∶200），兔抗人β-肌動蛋白（β-actin。1∶200）抗體。之后加入羊抗兔二抗（1∶150）孵育，二抗經過辣根過氧化物酶標記。顯色帶通過Quantity One軟件進行灰度分析，以β-actin為參照。
用蛋白印跡法測定平滑肌組織中MLC20磷酸化水平。首先，對平滑肌組織條帶進行蛋白質提取，用含10 mmol/L DTT的丙酮清洗平滑肌組織條帶2次，每次清洗持續30 min，以洗出三氯乙酰酸，之后在裂解緩沖液中被均化（150 μL/mg組織濕重）。裂解緩沖液成分：6.4 mol/L尿素，10 mmol/L DTT，10 mmol/L EDTA，5 mmol/L NaF，28.6 mmol/L甘氨酸，26.4 mmol/L tris堿，1 mmol/L苯甲基磺酰氟化物。第二，在10%的甘油，3%丙烯酰胺–尿素非變性基層凝膠上分離磷酸化和非磷酸化MLC20。第三，經過處理，樣本已被溶解，在每一個條帶上加入相等的量進行電泳，電壓為200 V，持續2.5 h。電泳緩沖液含有50 mmol/L Tris及100 mmol/L甘氨酸，2 μL/mL β硫基乙醇加入到里層。之后蛋白被以25 V電壓，4 ℃下，隔夜轉移到硝化纖維膜上。非特異性的結合是由TBS-5%，1 h BSA來控制的。第四，進行蛋白質免疫沉淀，順序首先是使用MLC20的單克隆抗體（1∶50000），TBST 5%，BSA。在一抗和二抗之間，用TBST洗膜，二抗之后，再用TBST洗膜。第五，膜使用LI-CORD Odsey系統進行掃描，用帶有Odyssey2.1軟件的計算進行背景分析。第六，計算MLC20磷酸化水平，MLC20磷酸化水平=磷酸化的MLC20/（磷酸化的MLC20+非磷酸化的MLC20）×100%。
1.5 統計學方法
所有統計分析均使用軟件Origin8進行分析。呈正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，大多數統計分析使用雙向方差分析。一些指標比較通過兩兩獨立t檢驗或者多組間的單因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 空白組、電刺場激組50%Fmax組和Fmax組平滑肌組織條帶中Rock-Ⅱ表達水平、MLC20的磷酸化趨勢
在電場刺激組中，給予不同電壓刺激，使收縮力達到Fmax及約50%Fmax，在等張收縮狀態下，分別快速冷凍兩組的平滑肌組織條，用蛋白印跡法分別測定Rock-Ⅱ及MLC20的水平。結果發現，如圖2a所示，在空白組、50%Fmax、Fmax三組中，平滑肌組織條中Rock-Ⅱ表達水平呈遞增趨勢（P=0.037）。此外，如圖2c所示，在空白組、50%Fmax、Fmax等張收縮組中，平滑肌組織條中MLC20的磷酸化水平也呈遞增趨勢（P=0.049），但三組間MLC20總量比較，差異無統計學意義（P=0.725）。
圖2
對照組、Fmax組及50%Fmax組平滑肌條帶在不同收縮狀況下的Rock-Ⅱ和MLC20表達（n=4）
a、b. ROCK-Ⅱ蛋白表達及半定量結果；c、d. 總MLC20（Total-LC20）、磷酸化MLC20（P-MLC20）蛋白表達及半定量結果。*
2.2 電場刺激組在等張收縮狀態下，對照組、沙丁胺醇組、Y-27632組、沙丁胺醇+Y-27632組的舒張百分比的變化
在50%Fmax電場刺激的4個亞組（對照組、沙丁胺醇組、Y-27632組、沙丁胺醇+Y-27632組）中，如圖3，T=10 min時，舒張百分比分別為0.7%、2.5%、6.0%、15.0%；T=20 min時，舒張百分比分別為1.8%、4.5%、7.5%、21.0%；T=40 min時，舒張百分比分別為1.9%、7.5%、7.9%、22.0%；T=60 min舒張百分比分別為2.0%、8.0%、8.8%、22.5%。在Fmax電場刺激的4個亞組中，如圖4，T=10 min時，舒張百分比分別為1.0%、3.0%、7.0%、17.0%；T=20 min時，舒張百分比分別為2.6%、5.5%、9.0%、24.0%；T=40 min時，舒張百分比分別為2.8%、9.0%、9.5%、27.5%；T=60 min時，舒張百分比分別為2.9%、10.5%、10.5%、28.0%。在50%Fmax、Fmax電場刺激組中，對照組、沙丁胺醇組、Y-27632組、沙丁胺醇+Y-27632組的平滑肌舒張百分比均隨時間依次呈遞增趨勢，各組在40 min左右達到最大舒張效果，即Tmax為40 min，繼續延長時間，舒張效應無明顯增加。組間差異分析顯示，在相同作用時間的情況下，沙丁胺醇與Y-27632聯合組的平滑肌舒張百分比明顯大于單用沙丁胺醇組和單用Y-7632組的舒張百分比（P<0.05）。此外，聯合干預的平滑肌舒張百分比也優于二者單藥干預的數學和效應（P<0.05）。
圖3
電場刺激50%Fmax組中，分別給予不同藥物干預，不同組別間平滑肌舒張百分比–時間變化圖（n=4）
沙丁胺醇+Y-27632組分別與沙丁胺醇組、Y-27632組、二者單藥干預的數學總和比較，*
圖4
電場刺激Fmax組中，分別給予不同藥物干預，不同組別間平滑肌舒張百分比–時間變化圖（n=4）
沙丁胺醇+Y-27632組分別與沙丁胺醇組、Y-27632組、二者單藥干預的數學總和比較，*
3 討論
在本研究中，我們發現平滑肌條帶的收縮力及收縮強度越強，ROCK表達水平越高、MLC20磷酸化水平也越高。在空白組、電場刺激組（50%Fmax、Fmax）中，隨著收縮力及強度的增強，平滑肌組織條中ROCK表達水平及MLC20磷酸化水平越高，MLC20總量并無明顯差異，表明ROCK相關的信號通路參與氣道平滑肌的調節。先前的證據表明，Rho激酶可能是哮喘的潛在藥物靶點，RhoA/Rho激酶通過調節MLC磷酸酶活性，以誘導氣道平滑肌松弛[22]。Rho激酶對MLCP以及調節肌動蛋白聚合的酶均具有直接和間接抑制作用[23]。Puetz等[24]發現在實驗性哮喘中RhoA/Rho激酶介導的Ca2+致敏作用顯著增強，并參與了支氣管平滑肌高反應性。Chiba等[25]在哮喘患者中觀察到的RhoA/Rho激酶激活增加與支氣管平滑肌收縮和氣道高反應性有關。此外，最新表明RhoA不僅與氣道高反應性有關，而且與哮喘的其他關鍵特征，例如氣道重塑、過敏性氣道炎癥和氣道屏障功能障礙有關[26-28]。由此可見，ROCK相關的信號通路是氣道平滑肌調節的重要通路，但具體的信號機制仍需進一步研究。
RhoA/Rho激酶是調節MLC磷酸酶肌球蛋白結合亞基磷酸化，從而促進平滑肌收縮的細胞內分子之一。早期相關研究發現Y-27632抑制了氣道平滑肌收縮，而不降低細胞內Ca2+的濃度[29]。在小鼠哮喘模型研究中，ROCK抑制劑能降低MLC的磷酸化和減輕氣道高反應性[30]，Y-27632可通過抑制Rho激酶-1的表達和活性，從而改善哮喘氣道炎癥反應[31]。Pazhoohan等[32]研究發現吸入ROCK抑制劑Y-27632的豚鼠氣道重塑減少，氣道高反應性降低。有研究表明Y-27632可以舒張人離體的支氣管平滑肌，可抑制乙酰膽堿和電場刺激誘導的支氣管收縮，使用后支氣管舒張作用迅速開始并持續超過8 h[33]。RhoA/Rho激酶通過影響哮喘發病機制中各種炎癥細胞（例如嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、肥大細胞和T細胞）的遷移、分化和功能來參與調節氣道炎癥[34]。但Raqeeb等[35]研究提出Y-27632的作用可能與MLCP途徑無關，他們在實驗中觀察到其作用可能與調節細胞骨架組織的信號通路有關，但同時提出涉及Rho激酶激活的途徑在產生被動剛度中也很重要，當ROCK抑制劑Y-27632將主動力降低時，對鈣敏感的被動剛度也降低了。以上實驗均表明ROCK抑制劑在治療哮喘中的重要性，但以上實驗均未對其組織的生物力學行為進行進一步的探索。
我們針對豬氣道平滑肌生物力學的探究發現，無論是在50%Fmax還是Fmax電場刺激的狀態下，在使用ROCK抑制劑Y-27632的亞組中，與對照組相比，平滑肌舒張百分比明顯增加，這表明ROCK抑制劑信號轉導通路與哮喘氣道平滑肌生物力學及收縮–舒張功能關系密切。在沙丁胺醇與Y-27632聯合干預的亞組中，氣道平滑肌的舒張百分比明顯大于單純使用沙丁胺醇組和單純使用Y-27632組的效果，也大于兩組的數學和效應，這表明沙丁胺醇與Y-27632聯合干預對氣道平滑肌的舒張作用優于二者分別干預的效果和。上述結果表明，二者聯合對豬氣道平滑肌的舒張作用增強，可能具有協同作用。既往的研究也表明Rho激酶抑制劑可增強β2激動劑在氣道平滑肌中的松弛作用[36]，與本研究結果具有一致性。但目前二者相互作用的具體機制尚不明確，既往研究表明這可能與腺苷酸環化酶刺激性G蛋白（the stimulatory G protein of adenylyl cyclase，Gs）和RhoA/Rho激酶之間的抑制作用有關，Gs是一種位于Rho激酶和Ca2+通道的上游的G蛋白，它控制細胞內Ca2+的敏感性和濃度。當Gs與RhoA/Rho激酶的抑制性關系失衡時，會導致RhoA激酶活性增加，通過Ca2+致敏作用，使β2腎上腺素能脫敏，而應用Y-27632可以逆轉這種趨勢[37-38]。Kume等[38]提出，腎上腺素能受體激動劑耐藥的主要原因是長期暴露于炎癥細胞釋放的蛋白酶后，通過Ca2+致敏作用，對藥物的反應性降低，而ROCK抑制劑可抑制與哮喘有關的物質（如收縮性激動劑和活性氧）所引起的氣道平滑肌收縮，使腎上腺素能脫敏作用也被減弱。此外，Schellenberg等[39]發現，Y-27632顯著降低了β2腎上腺素受體數，而不影響受體對放射性配體的親和力，相比之下，Y-27632增強了β激動劑刺激的細胞內cAMP產生，使細胞內游離Ca2+減少，引起平滑肌舒張。由此可見，β2激動劑沙丁胺醇與ROCK抑制劑Y-27632聯合干預氣道平滑肌時，二者相互作用的機制仍需進一步研究。
綜上所述，本研究結果表明在電場刺激平滑肌收縮中，平滑肌收縮力及收縮強度越強，ROCK表達水平越高、MLC20磷酸化水平越高。此外，沙丁胺醇聯合Y-27632對收縮的豬氣道平滑肌可能具有協同舒張作用，這可能為哮喘的聯合用藥提供新的思路和方法。但本研究仍存在不足之處，研究對象主要針對豬氣道平滑肌，且為離體實驗，尚未在動物體內實驗或人體試驗進行驗證，也未對沙丁胺醇與Y-27632的藥物劑量和相關不良反應等方面進行觀察，后期仍需要進一步的研究來證實二者聯合用藥的療效及不良反應。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
