引用本文： 黃碩, 胡瑞成, 譚雙香, 符代炎, 甘桂香. Runt相關轉錄因子1調控上皮間質轉化在卷煙煙霧誘導的氣道上皮細胞中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(9): 658-664. doi: 10.7507/1671-6205.202205037 復制
上皮–間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞緊密連接和細胞極性等特性發生改變，轉化為間質樣細胞過程，EMT在器官纖維化、腫瘤發生、損傷修復等過程中起著至關重要的作用[1-3]。體外研究表明，正常人支氣管上皮細胞接觸卷煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）會誘發EMT活性，并增加間質標記物的表達。上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）表達的喪失是EMT中的關鍵事件，它與細胞之間的連接相關，且涉及到與細胞極性相關的細胞骨架和細胞外基質的重塑。EMT可能是肺部多種疾病如支氣管哮喘、肺纖維化以及慢性阻塞性肺疾病發生發展過程中核心病理生理因素[4-6]。
Runt相關轉錄因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）是1991年染色體重排中被發現，其易位和點突變可導致急性白血病的發生，基因定位于染色體21q22.3，由12個外顯子構成，全長超過260 kb[7]。2001年相關研究發現Runx1蛋白在小鼠胚胎中的多個部位如肝臟、胸腺、鼻腔、食管、胃、支氣管以及氣道上皮等廣泛表達[7-8]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是機體重要的轉錄因子之一，研究顯示NF-κB在氣道炎癥疾病如慢性阻塞性肺疾病中發揮了關鍵作用[9]。鋅指轉錄因子Snail能夠調節EMT，在促進EMT的進程中發揮重要作用[10]。研究發現RUNX1通過調節NF-κB調控炎癥反應，在急性肺損傷中RUNX1的缺失導致NF-κB信號的活化[11]，提示RUNX1是NF-κB的上游調控因子。近期研究顯示NF-κB是通過增加EMT關鍵轉錄因子Snail促進EMT的發生發展[12-13]。本研究采用轉染RUNX1干擾和過表達載體進行基因干預，借助免疫組織化學、蛋白印跡法（Western blot）等方法進行研究，探討在支氣管上皮細胞在卷煙煙霧刺激下RUNX1的表達情況，并探討其對上皮間質轉化的調控作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和設備
CSE、RUNX1過表達載體、RUNX1干擾載體、SD大鼠均由中洪博元分子實驗室提供；抗RUNX1（ab92336，英國Abcam公司），抗NF-κB（8242T，美國CST公司），抗Snail（13099-1-ap）、抗波形蛋白（vimentin，VIM。10366-1-ap）和抗E-cad（20874-1-ap，美國Proteintech公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。TA-08，中國中杉金橋）；全自動酶標儀（北京六一生物科技），離心機（長沙英泰儀器有限公司），DMEM/F-12培養基（10565018，中國賽默飛世爾科技有限公司），CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒（KGA317）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS。KGB5001）均由江蘇凱基生物技術股份有限公司提供，微型離心機（D1008E，美國賽洛捷克公司），干式電加熱器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），旋渦混合器（常州越新儀器制造有限公司），倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電有限公司），低溫高速離心機（5424R，德國Eppendorf公司），紫外分光光度儀（NP80，德國茵普恩公司）。
1.2 方法
1.2.1 原代細胞分離及鑒定
大鼠全身消毒3 min，無菌條件下連著肺組織將氣管–支氣管剪下，放入預冷的PBS中，去除肺組織和氣管表面殘留的脂肪和筋膜，反復灌洗干凈，剪碎組織至0.5～1 mm3的小塊后轉移至離心管中，靜置，棄上清液，加入DMEM/F-12培養基重懸，調整密度后加入到準備好的培養皿中貼壁培養。培養條件為37 ℃，5% CO2。免疫熒光鑒定分離的細胞，鑒定目的蛋白-廣譜細胞角蛋白（Pan cytokeratin）（bs-1712R，Bioss）[14]。將已貼壁生長的細胞用PBS浸洗3次后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養皿，用0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS浸洗培養皿后移液槍吸干PBS，在培養皿內滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），37 ℃封閉30 min。移液槍吸掉封閉液，培養皿內滴加足夠量的稀釋好的一抗anti- Pan cytokeratin（1∶200）；4 ℃孵育過夜。浸洗培養皿3次，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1∶200），37 ℃孵育45 min，PBS浸洗，滴加6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）避光孵育5 min，對標本進行核染，用PBS沖洗多余的DAPI；用50%甘油封閉培養皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。從加熒光二抗起，后面的操作步驟都在暗室進行。實驗進行3次重復。
1.2.2 細胞處理及CCK-8檢測
為了探討在卷煙誘導下RUNX1對支氣管上皮細胞EMT的影響，在體外構建CSE對支氣管上皮細胞暴露模型，對照組不進行CSE處理。將細胞鋪板，細胞狀態良好后用1%、5%、10%、15%、20%濃度CSE處理細胞，24 h和48 h后細胞消化、重懸，計數，鋪板，細胞密度為5×103個/孔，繼續培養48 h后進行檢測；將待測的96孔板細胞換成每孔100 μL的相同培養基，加入CCK-8試劑，每孔10 μL，然后置于培養箱中孵育2 h；每孔的吸光度（optical density，OD）通過酶標儀在450 nm波長處檢測，計算細胞活力，細胞活力=（OD處理組/OD對照組）×100% 。實驗進行3次重復。
1.2.3 RUNX1基因轉染干擾及過表達
NCBI數據庫中查找RUNX1基因序列，引入酶切位點，生物合成目的基因片段并連接到pcDNA3.1（+）載體上。質粒轉化大腸桿菌DH5α，菌液擴大培養后去內毒素提取質粒，進行質粒酶切分析和電泳檢測驗證。將構建好的過表達載體和干擾載體用脂質體轉染提取的支氣管上皮細胞。造模后的細胞分為5組：CSE處理組（模型組）、干擾RUNX1對照組、干擾RUNX1組（siRNA-1/siRNA-2/siRNA-3）、過表達RUNX1對照組以及過表達RUNX1組。細胞按照實驗分組鋪板，細胞狀態良好后進行轉染。載體轉染：當細胞密度達70%時，將細胞的培養基更換為不含血清的培養基，體積為1 mL。取滅菌的EP管2個，每管加125 μL Opti-MEM，其中一管加入5 μL lipofectamine3000，另一管干擾RUNX1組EP管加入12.5 μL siRNA，而過表達RUNX1組EP管加入2.5 μg質粒、5 μL P3000，混勻后室溫孵育5 min將上述兩個EP管混勻，室溫孵育15 min。將混合液滴到六孔板中對應的孔內，將細胞放回孵箱培養；干擾組轉染4 h過表達組轉染6 h后在六孔板中加入血清含量為20%的完全培養基1 mL；轉染48 h后進行下游聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和免疫印跡（Western blot）驗證。
1.2.4 定量聚合酶鏈反應（quantitative PCR，qPCR）驗證
用移液槍吸掉培養皿中的細胞培養液，加入Trizon 裂解液，用移液槍吹打，使貼壁細胞懸浮與裂解液充分接觸，收集全部細胞懸液以提取miRNA。利用紫外可見分光光度計測定RNA的濃度和純度（OD260/OD280）。將miRNA通過miRNA逆轉錄試劑盒合成micDNA。利用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應體系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free ddH2O 8.2 μL。反應步驟如下：預變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40個循環。引物序列由通用生物系統（安徽）有限公司合成，β-肌動蛋白（β-actin）作為內參，序列見表1。RUNX1的相對表達量根據2–△△Ct法計算。實驗進行3次重復。
表1
RUNX1和β-actin引物序列
1.2.5 免疫細胞化學
在培養板中將已爬好的培養皿用PBS浸洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養皿3次，每次3 min；用0.5%TritonX-100（PBS配制）室溫通透20 min，將切片移入濕盒中，加入新鮮配制的3%雙氧水，以去除內源性過氧化酶封閉液，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗。用PBS浸洗玻片3次，每次5 min，吸收紙吸干組織周圍的PBS，在玻片上滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min。用移液槍吸干培養皿內的封閉液，不洗，每個培養皿中滴加足夠量的稀釋好的一抗RUNX1（AF6379，美國艾菲公司），放入濕盒中，4 °C孵育過夜，然后進行二抗孵育，滴加辣根酶標記的山羊抗兔IgG（H+L） （ZB-2305，北京中杉金橋生物技術有限公司），37 °C下孵育30 min。最后進行顯色復染。實驗進行3次重復。
1.2.6 Western blot檢測
用移液槍吸掉培養皿中的細胞培養液，每孔加入100 μL的細胞裂解液，置于冰上20 min。用細胞刮將細胞刮至一側，移液槍吸入已做好標記的EP管中。12000 r/min 高速離心機離心10 min，上清液即得總蛋白。根據二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h，后用300 mA恒流轉膜80 min。一抗RUNX1，NF-κB、Snail、VIM、E-cad和GAPDH溶液孵育，4 ℃過夜；二抗溶液中室溫孵育2 h。在膜上滴加ECL發光液，在凝膠成像系統中曝光。實驗進行3次重復。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 24.0統計軟件。定量數值結果采用均數±標準差（
±s）表示。多組之間的定量數值比較采用單因素的方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法。采用Graphpad5.0軟件作圖，采用Imagepro J軟件進行灰度值分析。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 原代大鼠支氣管上皮細胞分離及鑒定
原代分離的大鼠支氣管上皮細胞呈多邊形，形態呈鋪路石樣，從免疫熒光的結果上看，支氣管上皮細胞中的角蛋白表達量比較高，提示分離的細胞是純度較高的支氣管上皮細胞。結果見圖1。
圖1
原代大鼠支氣管上皮細胞分離及鑒定
a. 原代大鼠支氣管上皮細胞鑒定（×100）；b. 免疫熒光鑒定：目標蛋白呈紅色熒光細胞核呈藍色熒光（×200）。
2.2 不同的卷煙濃度對細胞活力的影響
在體外構建的CSE對支氣管上皮細胞暴露模型中，24 h和48 h后各卷煙濃度組細胞活力均比對照組顯著降低（P<0.05），隨著CSE濃度的升高，支氣管上皮細胞活力下降，結果見圖2。選擇使用10% CSE的濃度，處理48 h進行后續實驗。
圖2
不同的卷煙濃度對細胞活力的影響（n=3）
a. CSE處理24 h CCK-8 結果；b. CSE處理48 h CCK-8 結果。與對照組比較，*
2.3 qPCR和Western blot驗證轉染效果
qPCR和Western blot結果顯示，與對照組比較，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干擾組RUNX1表達水平均顯著降低，RUNX1過表達組RUNX1表達水平顯著升高，差異有統計學意義（均P<0.05），提示RUNX1轉染成功。結果見圖3。
圖3
qPCR和Western blot驗證轉染效果（n=3）
a. 干擾RUNX1組mRNA表達；b. 過表達RUNX1組mRNA表達；c. 干擾RUNX1組蛋白表達；d. 過表達RUNX1組蛋白表達。與對照組比較，*
2.4 CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞RUNX1蛋白的表達
與正常對照組比較，模型組中RUNX1表達水平顯著升高，與干擾對照組比較，干擾RUNX1組的RUNX1表達水平顯著降低，差異有統計學意義（均P<0.05）。與過表達對照組比較，過表達RUNX1組的RUNX1表達水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖4。
圖4
CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞RUNX1蛋白的表達（n=3）
a. 免疫細胞化學（×400）；b. 免疫細胞化學結果圖像分析半定量結果。與對照組比較，*
2.5 RUNX1 對CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞EMT的影響
Western blot結果表明，與對照組相比，CSE處理細胞后E-cad的表達顯著降低（P<0.05），RUNX1、NF-κB、Snail、VIM的表達水平顯著上升（均P<0.05）。這些結果顯示經過CSE處理細胞后，細胞由上皮向間充質發生轉化，同時伴隨發生炎癥反應。同時在干擾或過表達RUNX1后，E-cad的表達分別上調和下調（P<0.05），NF-κB、Snail、VIM的表達分別下調和上調（P<0.05）。結果提示RUNX1在調控EMT起到重要作用，下調RUNX1后，盡管在CSE處理細胞后，細胞由間充質向上皮發生轉化。結果見圖5。
圖5
RUNX1對CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞EMT的影響（n=3）
a. 與GAPDH歸一化處理的E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平；b. E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平半定量結果（內參為GAPDH）。與對照組比較，*
3 討論
RUNX1是一種重要的轉錄因子，參與機體腫瘤形成、炎癥反應、免疫反應等[15-18]。Runx基因家族編碼與DNA結合的α亞基，與核心結合因子β結合后形成異二聚體轉錄因子RUNX蛋白，在正常生長發育和疾病狀態下RUNX蛋白既是靶基因的抑制子又是激活劑[7]。本研究在CSE誘導的大鼠支氣管上皮細胞中進行觀察，發現在CSE刺激下，過表達RUNX1對照組較對照組的RUNX1蛋白表達水平顯著升高，干擾RUNX1組較對照組RUNX1蛋白表達水平顯著降低。本實驗結果在細胞水平說明CSE刺激促進了大鼠支氣管上皮細胞RUNX1的表達，很可能在慢性氣道炎癥疾病中發揮重要作用。
我們在研究中發現，采用CSE處理原代大鼠支氣管上皮細胞后，上皮細胞標志物E-cad的表達明顯下降，間充質表現標志物VIM的表達明顯上調，這一結果充分表明CSE會誘導細胞發生EMT。大量的調控因子及多種信號通路參與調控EMT。NF-κB是具有一種多向轉錄調節作用的轉錄因子，參與機體炎癥、氧化應激、免疫等多種病理生理過程[9，19-20]。本研究組前期研究提示NF-κB是慢性氣道炎癥疾病如慢性阻塞性肺疾病等的發病中的重要轉錄因子[9]。而Snail是調控細胞EMT的關鍵轉錄因子之一[10]，能夠降低上皮細胞標志E-鈣黏蛋白等表達，促進間葉細胞標志物VIM等表達等，從而達到調控EMT的進程。研究顯示NF-κB可以與Snail基因啟動子的–194 bp及78 bp相結合，增加EMT相關轉錄因子Snail促進EMT的發生發展[21]。研究顯示RUNX1調控炎癥反應可以通過調節NF-κB來實現，在急性肺損傷中缺失RUNX1時NF-κB信號被活化，提示NF-κB的上游調控因子是RUNX1[11]。RUNX1能否調控NF-κB/Snail的表達，以及能否通過該作用調控影響EMT進程，我們進行了一系列實驗研究。結果顯示，CSE刺激后RUNX1、NF-κB、Snail的蛋白表達上調，在此基礎上采用轉染技術干擾降低RUNX1水平后，NF-κB、Snail蛋白表達水平下降，而過表達RUNX1水平后，NF-κB、Snail表達水平上升，表明RUNX1可以調控NF-κB/Snail表達。同時伴隨E-cad表達升高或降低，VIM間充質表達降低或升高，從而調控EMT進程。
綜上所述，CSE促進了大鼠氣道上皮細胞中RUNX1的表達，RUNX1參與調控NF-κB/Snail的表達，并且可能通過該作用調節EMT進程。然而本研究僅通過細胞實驗層面探索了RUNX1對CSE誘導的上皮間質轉化的作用影響，下一步還需深入研究RUNX1在動物模型體內CSE誘導EMT發生過程的作用機制，以及可能的調控因素。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
上皮–間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮細胞緊密連接和細胞極性等特性發生改變，轉化為間質樣細胞過程，EMT在器官纖維化、腫瘤發生、損傷修復等過程中起著至關重要的作用[1-3]。體外研究表明，正常人支氣管上皮細胞接觸卷煙煙霧提取物（cigarette smoking extract，CSE）會誘發EMT活性，并增加間質標記物的表達。上皮標志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-cad）表達的喪失是EMT中的關鍵事件，它與細胞之間的連接相關，且涉及到與細胞極性相關的細胞骨架和細胞外基質的重塑。EMT可能是肺部多種疾病如支氣管哮喘、肺纖維化以及慢性阻塞性肺疾病發生發展過程中核心病理生理因素[4-6]。
Runt相關轉錄因子1（Runt-related transcription factor 1，RUNX1）是1991年染色體重排中被發現，其易位和點突變可導致急性白血病的發生，基因定位于染色體21q22.3，由12個外顯子構成，全長超過260 kb[7]。2001年相關研究發現Runx1蛋白在小鼠胚胎中的多個部位如肝臟、胸腺、鼻腔、食管、胃、支氣管以及氣道上皮等廣泛表達[7-8]。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是機體重要的轉錄因子之一，研究顯示NF-κB在氣道炎癥疾病如慢性阻塞性肺疾病中發揮了關鍵作用[9]。鋅指轉錄因子Snail能夠調節EMT，在促進EMT的進程中發揮重要作用[10]。研究發現RUNX1通過調節NF-κB調控炎癥反應，在急性肺損傷中RUNX1的缺失導致NF-κB信號的活化[11]，提示RUNX1是NF-κB的上游調控因子。近期研究顯示NF-κB是通過增加EMT關鍵轉錄因子Snail促進EMT的發生發展[12-13]。本研究采用轉染RUNX1干擾和過表達載體進行基因干預，借助免疫組織化學、蛋白印跡法（Western blot）等方法進行研究，探討在支氣管上皮細胞在卷煙煙霧刺激下RUNX1的表達情況，并探討其對上皮間質轉化的調控作用。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和設備
CSE、RUNX1過表達載體、RUNX1干擾載體、SD大鼠均由中洪博元分子實驗室提供；抗RUNX1（ab92336，英國Abcam公司），抗NF-κB（8242T，美國CST公司），抗Snail（13099-1-ap）、抗波形蛋白（vimentin，VIM。10366-1-ap）和抗E-cad（20874-1-ap，美國Proteintech公司），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。TA-08，中國中杉金橋）；全自動酶標儀（北京六一生物科技），離心機（長沙英泰儀器有限公司），DMEM/F-12培養基（10565018，中國賽默飛世爾科技有限公司），CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒（KGA317）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS。KGB5001）均由江蘇凱基生物技術股份有限公司提供，微型離心機（D1008E，美國賽洛捷克公司），干式電加熱器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），旋渦混合器（常州越新儀器制造有限公司），倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電有限公司），低溫高速離心機（5424R，德國Eppendorf公司），紫外分光光度儀（NP80，德國茵普恩公司）。
1.2 方法
1.2.1 原代細胞分離及鑒定
大鼠全身消毒3 min，無菌條件下連著肺組織將氣管–支氣管剪下，放入預冷的PBS中，去除肺組織和氣管表面殘留的脂肪和筋膜，反復灌洗干凈，剪碎組織至0.5～1 mm3的小塊后轉移至離心管中，靜置，棄上清液，加入DMEM/F-12培養基重懸，調整密度后加入到準備好的培養皿中貼壁培養。培養條件為37 ℃，5% CO2。免疫熒光鑒定分離的細胞，鑒定目的蛋白-廣譜細胞角蛋白（Pan cytokeratin）（bs-1712R，Bioss）[14]。將已貼壁生長的細胞用PBS浸洗3次后用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養皿，用0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min，PBS浸洗培養皿后移液槍吸干PBS，在培養皿內滴加5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），37 ℃封閉30 min。移液槍吸掉封閉液，培養皿內滴加足夠量的稀釋好的一抗anti- Pan cytokeratin（1∶200）；4 ℃孵育過夜。浸洗培養皿3次，移液槍吸干培養皿內多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3（1∶200），37 ℃孵育45 min，PBS浸洗，滴加6-二脒基-2-苯基吲哚（4', 6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）避光孵育5 min，對標本進行核染，用PBS沖洗多余的DAPI；用50%甘油封閉培養皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。從加熒光二抗起，后面的操作步驟都在暗室進行。實驗進行3次重復。
1.2.2 細胞處理及CCK-8檢測
為了探討在卷煙誘導下RUNX1對支氣管上皮細胞EMT的影響，在體外構建CSE對支氣管上皮細胞暴露模型，對照組不進行CSE處理。將細胞鋪板，細胞狀態良好后用1%、5%、10%、15%、20%濃度CSE處理細胞，24 h和48 h后細胞消化、重懸，計數，鋪板，細胞密度為5×103個/孔，繼續培養48 h后進行檢測；將待測的96孔板細胞換成每孔100 μL的相同培養基，加入CCK-8試劑，每孔10 μL，然后置于培養箱中孵育2 h；每孔的吸光度（optical density，OD）通過酶標儀在450 nm波長處檢測，計算細胞活力，細胞活力=（OD處理組/OD對照組）×100% 。實驗進行3次重復。
1.2.3 RUNX1基因轉染干擾及過表達
NCBI數據庫中查找RUNX1基因序列，引入酶切位點，生物合成目的基因片段并連接到pcDNA3.1（+）載體上。質粒轉化大腸桿菌DH5α，菌液擴大培養后去內毒素提取質粒，進行質粒酶切分析和電泳檢測驗證。將構建好的過表達載體和干擾載體用脂質體轉染提取的支氣管上皮細胞。造模后的細胞分為5組：CSE處理組（模型組）、干擾RUNX1對照組、干擾RUNX1組（siRNA-1/siRNA-2/siRNA-3）、過表達RUNX1對照組以及過表達RUNX1組。細胞按照實驗分組鋪板，細胞狀態良好后進行轉染。載體轉染：當細胞密度達70%時，將細胞的培養基更換為不含血清的培養基，體積為1 mL。取滅菌的EP管2個，每管加125 μL Opti-MEM，其中一管加入5 μL lipofectamine3000，另一管干擾RUNX1組EP管加入12.5 μL siRNA，而過表達RUNX1組EP管加入2.5 μg質粒、5 μL P3000，混勻后室溫孵育5 min將上述兩個EP管混勻，室溫孵育15 min。將混合液滴到六孔板中對應的孔內，將細胞放回孵箱培養；干擾組轉染4 h過表達組轉染6 h后在六孔板中加入血清含量為20%的完全培養基1 mL；轉染48 h后進行下游聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和免疫印跡（Western blot）驗證。
1.2.4 定量聚合酶鏈反應（quantitative PCR，qPCR）驗證
用移液槍吸掉培養皿中的細胞培養液，加入Trizon 裂解液，用移液槍吹打，使貼壁細胞懸浮與裂解液充分接觸，收集全部細胞懸液以提取miRNA。利用紫外可見分光光度計測定RNA的濃度和純度（OD260/OD280）。將miRNA通過miRNA逆轉錄試劑盒合成micDNA。利用熒光PCR儀進行熒光定量PCR。反應體系如下：2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、cDNA 1 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、RNase Free ddH2O 8.2 μL。反應步驟如下：預變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，10 s；退火58 ℃，30 s；延伸72 ℃，30 s；40個循環。引物序列由通用生物系統（安徽）有限公司合成，β-肌動蛋白（β-actin）作為內參，序列見表1。RUNX1的相對表達量根據2–△△Ct法計算。實驗進行3次重復。
表1
RUNX1和β-actin引物序列
1.2.5 免疫細胞化學
在培養板中將已爬好的培養皿用PBS浸洗3次，每次3 min，用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS浸洗培養皿3次，每次3 min；用0.5%TritonX-100（PBS配制）室溫通透20 min，將切片移入濕盒中，加入新鮮配制的3%雙氧水，以去除內源性過氧化酶封閉液，室溫孵育10 min，PBS充分淋洗。用PBS浸洗玻片3次，每次5 min，吸收紙吸干組織周圍的PBS，在玻片上滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min。用移液槍吸干培養皿內的封閉液，不洗，每個培養皿中滴加足夠量的稀釋好的一抗RUNX1（AF6379，美國艾菲公司），放入濕盒中，4 °C孵育過夜，然后進行二抗孵育，滴加辣根酶標記的山羊抗兔IgG（H+L） （ZB-2305，北京中杉金橋生物技術有限公司），37 °C下孵育30 min。最后進行顯色復染。實驗進行3次重復。
1.2.6 Western blot檢測
用移液槍吸掉培養皿中的細胞培養液，每孔加入100 μL的細胞裂解液，置于冰上20 min。用細胞刮將細胞刮至一側，移液槍吸入已做好標記的EP管中。12000 r/min 高速離心機離心10 min，上清液即得總蛋白。根據二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h，后用300 mA恒流轉膜80 min。一抗RUNX1，NF-κB、Snail、VIM、E-cad和GAPDH溶液孵育，4 ℃過夜；二抗溶液中室溫孵育2 h。在膜上滴加ECL發光液，在凝膠成像系統中曝光。實驗進行3次重復。用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。
1.3 統計學方法
采用SPSS 24.0統計軟件。定量數值結果采用均數±標準差（±s）表示。多組之間的定量數值比較采用單因素的方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法。采用Graphpad5.0軟件作圖，采用Imagepro J軟件進行灰度值分析。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 原代大鼠支氣管上皮細胞分離及鑒定
原代分離的大鼠支氣管上皮細胞呈多邊形，形態呈鋪路石樣，從免疫熒光的結果上看，支氣管上皮細胞中的角蛋白表達量比較高，提示分離的細胞是純度較高的支氣管上皮細胞。結果見圖1。
圖1
原代大鼠支氣管上皮細胞分離及鑒定
a. 原代大鼠支氣管上皮細胞鑒定（×100）；b. 免疫熒光鑒定：目標蛋白呈紅色熒光細胞核呈藍色熒光（×200）。
2.2 不同的卷煙濃度對細胞活力的影響
在體外構建的CSE對支氣管上皮細胞暴露模型中，24 h和48 h后各卷煙濃度組細胞活力均比對照組顯著降低（P<0.05），隨著CSE濃度的升高，支氣管上皮細胞活力下降，結果見圖2。選擇使用10% CSE的濃度，處理48 h進行后續實驗。
圖2
不同的卷煙濃度對細胞活力的影響（n=3）
a. CSE處理24 h CCK-8 結果；b. CSE處理48 h CCK-8 結果。與對照組比較，*
2.3 qPCR和Western blot驗證轉染效果
qPCR和Western blot結果顯示，與對照組比較，siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3干擾組RUNX1表達水平均顯著降低，RUNX1過表達組RUNX1表達水平顯著升高，差異有統計學意義（均P<0.05），提示RUNX1轉染成功。結果見圖3。
圖3
qPCR和Western blot驗證轉染效果（n=3）
a. 干擾RUNX1組mRNA表達；b. 過表達RUNX1組mRNA表達；c. 干擾RUNX1組蛋白表達；d. 過表達RUNX1組蛋白表達。與對照組比較，*
2.4 CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞RUNX1蛋白的表達
與正常對照組比較，模型組中RUNX1表達水平顯著升高，與干擾對照組比較，干擾RUNX1組的RUNX1表達水平顯著降低，差異有統計學意義（均P<0.05）。與過表達對照組比較，過表達RUNX1組的RUNX1表達水平顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖4。
圖4
CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞RUNX1蛋白的表達（n=3）
a. 免疫細胞化學（×400）；b. 免疫細胞化學結果圖像分析半定量結果。與對照組比較，*
2.5 RUNX1 對CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞EMT的影響
Western blot結果表明，與對照組相比，CSE處理細胞后E-cad的表達顯著降低（P<0.05），RUNX1、NF-κB、Snail、VIM的表達水平顯著上升（均P<0.05）。這些結果顯示經過CSE處理細胞后，細胞由上皮向間充質發生轉化，同時伴隨發生炎癥反應。同時在干擾或過表達RUNX1后，E-cad的表達分別上調和下調（P<0.05），NF-κB、Snail、VIM的表達分別下調和上調（P<0.05）。結果提示RUNX1在調控EMT起到重要作用，下調RUNX1后，盡管在CSE處理細胞后，細胞由間充質向上皮發生轉化。結果見圖5。
圖5
RUNX1對CSE誘導的原代大鼠支氣管上皮細胞EMT的影響（n=3）
a. 與GAPDH歸一化處理的E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平；b. E-cad、NF-κB、Snail、VIM、RUNX1蛋白水平半定量結果（內參為GAPDH）。與對照組比較，*
3 討論
RUNX1是一種重要的轉錄因子，參與機體腫瘤形成、炎癥反應、免疫反應等[15-18]。Runx基因家族編碼與DNA結合的α亞基，與核心結合因子β結合后形成異二聚體轉錄因子RUNX蛋白，在正常生長發育和疾病狀態下RUNX蛋白既是靶基因的抑制子又是激活劑[7]。本研究在CSE誘導的大鼠支氣管上皮細胞中進行觀察，發現在CSE刺激下，過表達RUNX1對照組較對照組的RUNX1蛋白表達水平顯著升高，干擾RUNX1組較對照組RUNX1蛋白表達水平顯著降低。本實驗結果在細胞水平說明CSE刺激促進了大鼠支氣管上皮細胞RUNX1的表達，很可能在慢性氣道炎癥疾病中發揮重要作用。
我們在研究中發現，采用CSE處理原代大鼠支氣管上皮細胞后，上皮細胞標志物E-cad的表達明顯下降，間充質表現標志物VIM的表達明顯上調，這一結果充分表明CSE會誘導細胞發生EMT。大量的調控因子及多種信號通路參與調控EMT。NF-κB是具有一種多向轉錄調節作用的轉錄因子，參與機體炎癥、氧化應激、免疫等多種病理生理過程[9，19-20]。本研究組前期研究提示NF-κB是慢性氣道炎癥疾病如慢性阻塞性肺疾病等的發病中的重要轉錄因子[9]。而Snail是調控細胞EMT的關鍵轉錄因子之一[10]，能夠降低上皮細胞標志E-鈣黏蛋白等表達，促進間葉細胞標志物VIM等表達等，從而達到調控EMT的進程。研究顯示NF-κB可以與Snail基因啟動子的–194 bp及78 bp相結合，增加EMT相關轉錄因子Snail促進EMT的發生發展[21]。研究顯示RUNX1調控炎癥反應可以通過調節NF-κB來實現，在急性肺損傷中缺失RUNX1時NF-κB信號被活化，提示NF-κB的上游調控因子是RUNX1[11]。RUNX1能否調控NF-κB/Snail的表達，以及能否通過該作用調控影響EMT進程，我們進行了一系列實驗研究。結果顯示，CSE刺激后RUNX1、NF-κB、Snail的蛋白表達上調，在此基礎上采用轉染技術干擾降低RUNX1水平后，NF-κB、Snail蛋白表達水平下降，而過表達RUNX1水平后，NF-κB、Snail表達水平上升，表明RUNX1可以調控NF-κB/Snail表達。同時伴隨E-cad表達升高或降低，VIM間充質表達降低或升高，從而調控EMT進程。
綜上所述，CSE促進了大鼠氣道上皮細胞中RUNX1的表達，RUNX1參與調控NF-κB/Snail的表達，并且可能通過該作用調節EMT進程。然而本研究僅通過細胞實驗層面探索了RUNX1對CSE誘導的上皮間質轉化的作用影響，下一步還需深入研究RUNX1在動物模型體內CSE誘導EMT發生過程的作用機制，以及可能的調控因素。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
