引用本文： 賀彬嬋, 徐小勇, 閔海燕, 蘇欣. miR-22-3p對人肺微血管內皮細胞HMGB1/NLRP3信號通路的調控作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(12): 878-884. doi: 10.7507/1671-6205.202206057 復制
急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床危重癥，一旦患病，病死率高達20%～50%[1]。最近研究認為肺血管內皮細胞是ARDS炎癥風暴中心[2]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種非組蛋白，之前認為其僅起到增強轉錄的作用[2-3]，目前發現在ARDS中HMGB1可由活化的免疫細胞釋放，在ARDS的發病機制中扮演著重要的角色[4]。在ARDS患者中外周血HMGB1水平升高[5-6]，血漿HMGB1水平被證明與疾病的嚴重程度、生存率和病死率相關[7-8]。動物實驗發現小鼠氣管滴注HMGB1會直接導致ARDS[9]。在脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）誘導的小鼠ARDS模型中，給與HMGB1中和抗體或通過抑制HMGB1可顯著減輕ARDS的嚴重程度[10]。以上研究說明HMGB1可能作為一種關鍵促炎因子參與ARDS的病理過程。
Nod樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization segment like receptor family 3，NLRP3）炎癥小體是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）前體、胞漿PRRs蛋白質家族NOD樣受體NLRP3蛋白和細胞質DNA傳感器AIM2組成的多蛋白復合體。NLRP3炎癥小體的活化會導致下游炎癥因子的釋放，在ARDS的發生發展中發揮著重要作用[11]，也是近年來研究的熱點。NLRP3炎癥小體的活化將無活性的Caspase-1的前體激活成為有活性的Caspase-1（cleaved-caspase-1），切割白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18的前體，使之成熟釋放，從而發揮相應的生物學功能[12]。因此，cleaved-caspase-1是判斷NLRP3炎癥小體活化的標準之一。研究顯示，特異性抑制NLRP3炎癥小體的活化可顯著抑制中性粒細胞的聚集和炎癥因子的產生，從而減輕肺損傷[13]。
微RNA（microRNA，miRNA）是長約22個核苷酸的非編碼小RNA，miRNA通過其種子序列（5′端第2～8位核苷酸）識別其靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）3′非翻譯區（3′UTR）上的結合位點，起到抑制翻譯、切割或降解mRNA的作用，是基因表達過程的負性調控因子[14]。在ARDS中，外周血中HMGB1顯著升高[15]，NLRP3炎癥小體顯著活化[16-17]。本研究旨在探究在ARDS中能同時靶向HMGB1和NLRP3的miRNA，在人肺微血管內皮細胞（human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMEC）中干預miRNA的表達，驗證其對ARDS炎癥反應的作用。
1 材料與方法
1.1 ARDS患者血漿收集
選擇東部戰區總醫院2019年1月—6月重癥醫學科（intensive care unit，ICU）住院治療的由于腹腔感染導致的ARDS患者，確診后立即收集患者外周血。另外，在東部戰區總醫院體檢中心選擇年齡相匹配的健康志愿者作為對照組。通過體檢結果及詢問病史查體，所有健康志愿者都沒有基礎疾病史，沒有肺部不適癥狀和體征，經胸部X線檢查未發現肺部異常。ARDS患者入選標準：ARDS診斷符合2012年的柏林定義；在血漿收集前24 h內入住ICU的患者；ARDS由腹腔感染引起。腹腔感染的診斷標準：有腹腔感染相關的臨床表現，如發熱、轉移性右下腹痛、麥氏點壓痛、Murphy征陽性、停止排氣排便、腹部壓痛、反跳痛及肌緊張等；實驗室檢查結果：白細胞計數、中性粒細胞百分比、C反應蛋白及降鈣素原增高等；超聲和CT提示腹腔感染；腹腔積液培養提示細菌感染。排除標準：年齡<18歲；妊娠期；免疫功能缺陷患者，包括有干細胞移植史的患者和使用免疫抑制劑的患者；惡性腫瘤患者；預計住院時間<48 h。研究方案符合醫學倫理學標準，經東部戰區總醫院倫理委員會同意實施。健康志愿者及患者家屬均簽署知情同意書。所有參與者留取外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，3000 r/min離心15 min，留取上層血漿至EP管中，–80 ℃保存備用。
1.2 miRNA芯片分析
利用TRIzol和miRNeasy mini kit（QIAGEN）提取血漿總RNA，NanoDrop-2000超微量分光光度計鑒定RNA的純度和質量。根據標準流程進行樣品標記（Flash Tag Biotin HSR RNA Labeling Kit，Affymetrix）、微陣列雜交（GeneChip2 Hybridization Oven 640，Affymetrix）、洗滌（GeneChip2 Fluidics Station 450）和掃描（GeneChip2 Scanner 3000 7G，Affymetrix）。信號強度值采用Affymetrix Expression Console?軟件（版本1.3.1）進行評估，并將實驗結果分析運算，將樣本表達數據歸一化。
1.3 主要實驗材料
LPS（美國Sigma公司），脂質體轉染試劑（美國Invitrogen公司），miRNA模擬物、miRNA抑制劑（廣州銳博公司），Trizol（美國Ambion公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCT）試劑盒（日本TAKARA公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司），β-肌動蛋白（β-actin）一抗（南京巴傲得公司），HMGB1、NLRP3、Caspase-1一抗（美國Abcam公司）。
1.4 細胞培養
HPMEC原代細胞、ECM培養基、胎牛血清、內皮細胞生長因子、雙抗（以上均購買自美國ScienCell公司）。用含5%胎牛血清，1%內皮細胞生長因子，1%雙抗的ECM培養基培養，培養條件為37 ℃、5% CO2、常規濕度，選用第4～6代快速生長期細胞進行實驗。
1.5 實驗分組及細胞處理
（1）空白組：HPMEC用LPS刺激；（2）miR-22-3p模擬物陰性對照組：HPMEC轉染miR-22-3p模擬物陰性對照后用LPS刺激；（3）miR-22-3p模擬物組：HPMEC轉染miR-22-3p模擬物后用LPS刺激；（4）miR-22-3p抑制劑陰性對照組：HPMEC轉染miR-22-3p抑制劑陰性對照后用LPS刺激；（5）miR-22-3p抑制劑組：轉染miR-22-3p抑制劑后用LPS刺激。約1×106個HPMEC接種于6孔板中，至70%～80%左右的細胞密度。用125 μL Opti-MEM稀釋Lipofectamin?3000，溫和混勻并恒溫孵育5 min，用125 μL Opti-MEM分別稀釋10 μL miR-22-3p模擬物、miR-22-3p抑制劑及其陰性對照，溫和混勻并恒溫孵育5 min。將兩者溫和混勻，室溫孵育20 min，后將混合液加入到各孔中，置于培養箱中培養24～48 h。在每孔中加入終濃度為10 μg/mL LPS進行刺激，放入恒溫箱培養6 h。
1.6 RT-qPCR實驗
收集細胞，Trizol提取總RNA，按照TAKARA逆轉錄試劑盒說明書合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），并以cDNA作為模板進行RT-qPCR。反應在viia7 PCR System上操作（美國ABI公司），反應體系：cDNA 1 μL，SYBR Green 5 μL，前后引物（10 μmol/L）各0.2 μL，Dnase-Free ddH2O 3.6 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，隨后95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，HMGB1、NLRP3、IL-6、IL-8、IL-1β的相對表達量以2–ΔΔCt方法計算。引物序列如下：HMGB1上游5′-GCTCCATAGAGACAGCGCCGGG-3′，下游5′-CCTCAGCGAGGCACAGAGTCGC-3′；NLRP3上游5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′，下游5′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-3′；IL-6上游5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′，下游5′- CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′；IL-8上游5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3′，下游5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3′，IL-1β上游5′-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3′，下游5′-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3′；GAPDH上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。實驗重復4次。
1.7 蛋白印跡法檢測蛋白表達
細胞處理完成后，提取各組總蛋白測定蛋白濃度，各組取40 μg蛋白進行電泳，冰浴電轉至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜4次，室溫下二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，ECL發光系統曝光檢測。實驗重復3次。
1.8 酶聯免疫吸附試驗檢測細胞上清的炎癥因子
HPMEC按細胞處理完成后收集細胞上清液，按照酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒中的說明，測定炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量。
1.9 統計學方法
采用SPSS 24.0統計軟件。數值變量如果服從正態分布，采用方差分析進行組間比較，如果組間差異有統計學意義，且符合方差齊性，進一步采用LSD法進行兩兩比較，若不符合方差齊性，則采用Dunnett's T3法進行兩兩比較。如果不服從正態分布，組間比較采用非參數檢驗（Kruskal-Wallis秩和檢驗），當組間總的有統計學差異，進一步采用Dunn法進行多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 miR-22-3p在腹腔感染的ARDS患者中表達下降
對3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受試者的血漿行Affymetrix miRNA 4.0 Array芯片分析。芯片分析結果顯示，miR-22-3p在腹腔感染所致的ARDS患者中的表達下調顯著，為健康受試者的0.062倍。
2.2 miR-22-3p對HMGB1表達的影響
用10 μg/mL的LPS刺激的HPMEC細胞，miR-22-3p模擬物組細胞內HMGB1 mRNA表達與空白組相比明顯下調（0.70±0.15比1.00±0.00，P<0.01），蛋白水平與mRNA趨勢相同；miR-22-3p抑制劑組HMBG1 mRNA（1.20±0.10比1.00±0.00，P<0.05）表達水平明顯上調，蛋白呈現出與mRNA相同的趨勢。 結果見圖1。
圖1
miR-22-3p對LPS刺激的HPMEC中HMGB1表達的影響
a. 蛋白印跡檢測像；b. RT-qPCR定量分析柱狀圖。miR-22-3p的過表達使HMGB1蛋白和mRNA水平降低，miR-22-3p的低表達使HMGB1蛋白和mRNA水平升高。1. 空白組；2. miR-22-3p模擬物陰性對照組；3. miR-22-3p模擬物組；4. miR-22-3p抑制劑陰性對照組；5. miR-22-3p抑制劑組。與空白組比較，*
2.3 miR-22-3p對LPS刺激下NLRP3炎癥小體形成的影響
與空白組相比，miR-22-3p模擬物組細胞內NLRP3的mRNA水平顯著下調（0.52±0.06比1.00±0.00，P<0.001），miR-22-3p抑制劑組NLRP3的mRNA水平顯著上調（1.46±0.06比1.00±0.00，P<0.001），蛋白也呈現出與mRNA相同的趨勢。與空白組相比，miR-22-3p模擬物組細胞內活化的Caspase-1的表達顯著降低，IL-1β mRNA（1.78±1.12比4.80±1.13，P<0.01）及細胞上清中的IL-1β［（26.26±1.46）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］顯著降低；miR-22-3p抑制劑組細胞內活化的Caspase-1的表達顯著升高，IL-1β mRNA（7.77±0.66比4.80±1.13，P<0.01）及細胞上清中的IL-1β［（48.22±2.14）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］顯著升高。 結果見圖2。
圖2
miR-22-3p對LPS刺激的HPMEC中炎癥小體的影響
a. NLRP3 RT-qPCR定量分析柱狀圖；b. IL-1β RT-qPCR定量分析柱狀圖；c. 上清IL-1β ELISA檢測柱狀圖；d. 蛋白印跡檢測像。miR-22-3p的過表達使 NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平降低，miR-22-3p的低表達使NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平升高。1. 空白組；2. miR-22-3p模擬物陰性對照組；3. miR-22-3p模擬物組；4. miR-22-3p抑制劑陰性對照組；5. miR-22-3p抑制劑組。與空白組比較，**
2.4 miR-22-3p對LPS刺激下HPMEC炎癥的影響
與空白組相比，miR-22-3p模擬物組炎癥因子IL-6 mRNA（4.06±1.60比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（10.64±7.16比32.08±2.01，P<0.001），以及上清中的IL-6［（287.83±3.22）pg/mL比(322.51±3.99) pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白濃度［（2436.54±53.24）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］顯著下調，miR-22-3p抑制劑組炎癥因子IL-6 mRNA（10.98±1.55比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（44.97±5.62比32.08±2.01，P<0.01），以及上清中的IL-6［（340.30±4.51）pg/mL比（322.51±3.99）pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白濃度［（3119.19±221.63）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］顯著上調。 結果見圖3。
圖3
miR-22-3p對LPS刺激的HPMEC中炎癥因子的影響
a. IL-6 RT-qPCR定量分析柱狀圖；b. 上清IL-6 ELISA檢測柱狀圖；c. IL-8 RT-qPCR定量分析柱狀圖；d. 上清IL-8 ELISA檢測柱狀圖。與空白組相比，miR-22-3p的過表達使IL-6、IL-8水平下調，miR-22-3p的低表達使IL-6、IL-8水平上調。1. 空白組；2. miR-22-3p模擬物陰性對照組；3. miR-22-3p模擬物組；4. miR-22-3p抑制劑陰性對照組；5. miR-22-3p抑制劑組。與空白組比較，**
3 討論
ARDS以級聯放大的“炎癥風暴”為特征。盡管對ARDS的發病機制有了較深入的了解，但目前仍對基因水平的調控機制知之甚少。HMGB1與多種疾病均存在關聯，包括膿毒癥、自身免疫疾病、獲得性免疫缺陷綜合征、糖尿病、腫瘤等，且目前研究證實HMGB1在ARDS的發病機制中扮演著重要的角色[18]。NLRP3炎癥小體是天然免疫系統中一種重要的細胞內多蛋白復合物，其活化可以在一定程度上幫助機體抵御病原體的入侵，但是在ARDS中其過度活化則會導致炎癥相關的組織損傷[19-20]。一系列研究證明HMGB1與NLRP3炎癥小體有密切的關聯，兩者可相互激活活化。HMGB1通過TLR2通路增加NLRP3和Caspase-1的表達，通過RAGE通路增加ASC和Caspase-1的表達，通過TLR4通路增加Caspase-1的表達[21]。另外，也有文獻報道炎癥小體的活化促進HMGB1的表達釋放[22]。因此，HMGB1和NLRP3的相互活化可能在ARDS中起到重要的推動作用，若能同時減少兩者表達，可能對ARDS的進展有減緩作用。
許多研究表明miRNA在細胞增殖、分化、凋亡、遷移、炎癥、免疫應答、代謝、器官發生和腫瘤形成等基本生理和病理過程中起著重要的作用。與此同時，多種生理病理過程也會影響miRNA的生物合成。在ARDS中，機體多種miRNA的表達發生變化，變化的miRNA也起到重要的調控作用。本研究收集了3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受試者的血漿，行miRNA芯片分析，數種miRNA在ARDS患者中表達下調。查閱文獻后發現，在口腔鱗癌細胞模型中，miR-22-3p可通過靶向NLRP3抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[23]。在胃癌模型中，幽門螺桿菌的感染抑制了miR-22-3p的表達，減少其對NLRP3表達的抑制，導致胃上皮細胞不可控的持續增殖，最終導致胃癌的發生[24]。亦有報道miR-22-3p可通過靶向HMGB1減輕急性腎損傷[25]。在肝癌細胞中，miR-22-3p可通過靶向HMGB1影響腫瘤的遷移和增值[26]。不同疾病模型發病機制不同，在ARDS中，miR-22-3p能否靶向HMGB1和NLRP3從而發揮功能仍無相關研究，推測miR-22-3p可能通過同時靶向HMGB1和NLRP3減輕炎癥反應。
有研究證實，在肺部感染導致的ARDS中，直接損傷主要影響肺泡上皮，并產生局部肺泡炎癥反應，而在肺外因素導致的ARDS中，間接損傷通過血流中的炎癥介質影響血管內皮[27]。腹腔感染導致的ARDS，人肺微血管內皮細胞起到“主控者”的重要作用，因此，本試驗擬通過HPMEC作為細胞模型，通過過表達和低表達細胞內的miR-22-3p，研究miR-22-3p對人肺微血管內皮細胞炎癥的影響及其作用靶點。研究發現，在HPMEC炎癥模型中，miR-22-3p可同時抑制HMGB1及NLRP3 mRNA和蛋白表達。研究顯示，miRNA沉默靶標主要通過使mRNA衰變或抑制翻譯的方式發揮作用。本研究顯示，miR-22-3p可能通過促進HMGB1和NLRP3 mRNA衰減，最終起到抑制HMGB1和NLRP3蛋白表達的作用。既往的研究表明，在炎癥細胞中，HMGB1和NLRP3炎癥小體可以互相激活從而增強炎癥反應[28-29]，因此，降低HMGB1的水平和（或）減少NLRP3炎癥小體的激活可以破壞這種相互激活產生的正反饋。筆者認為，在生理情況下，miR-22-3p部分抑制了HMGB1及NLRP3的表達，使其表達水平在正常范圍內。而在ARDS等急性炎癥時，miR-22-3p水平降低，對HMBG1和NLRP3的抑制作用大大減弱，使其表達升高，更易相互激活產生正反饋作用，從而進一步惡化炎癥水平。
綜上所述，本研究證實miR-22-3p 可下調HMGB1和NLRP3的蛋白表達，從而減緩LPS刺激HPMEC所致炎癥反應，有望成為ARDS防治的新靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是臨床危重癥，一旦患病，病死率高達20%～50%[1]。最近研究認為肺血管內皮細胞是ARDS炎癥風暴中心[2]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）是一種非組蛋白，之前認為其僅起到增強轉錄的作用[2-3]，目前發現在ARDS中HMGB1可由活化的免疫細胞釋放，在ARDS的發病機制中扮演著重要的角色[4]。在ARDS患者中外周血HMGB1水平升高[5-6]，血漿HMGB1水平被證明與疾病的嚴重程度、生存率和病死率相關[7-8]。動物實驗發現小鼠氣管滴注HMGB1會直接導致ARDS[9]。在脂多糖（lipopoly-saccharide，LPS）誘導的小鼠ARDS模型中，給與HMGB1中和抗體或通過抑制HMGB1可顯著減輕ARDS的嚴重程度[10]。以上研究說明HMGB1可能作為一種關鍵促炎因子參與ARDS的病理過程。
Nod樣受體蛋白3（nucleotide binding oligomerization segment like receptor family 3，NLRP3）炎癥小體是由半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）前體、胞漿PRRs蛋白質家族NOD樣受體NLRP3蛋白和細胞質DNA傳感器AIM2組成的多蛋白復合體。NLRP3炎癥小體的活化會導致下游炎癥因子的釋放，在ARDS的發生發展中發揮著重要作用[11]，也是近年來研究的熱點。NLRP3炎癥小體的活化將無活性的Caspase-1的前體激活成為有活性的Caspase-1（cleaved-caspase-1），切割白細胞介素（interleukin，IL）-1β和IL-18的前體，使之成熟釋放，從而發揮相應的生物學功能[12]。因此，cleaved-caspase-1是判斷NLRP3炎癥小體活化的標準之一。研究顯示，特異性抑制NLRP3炎癥小體的活化可顯著抑制中性粒細胞的聚集和炎癥因子的產生，從而減輕肺損傷[13]。
微RNA（microRNA，miRNA）是長約22個核苷酸的非編碼小RNA，miRNA通過其種子序列（5′端第2～8位核苷酸）識別其靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）3′非翻譯區（3′UTR）上的結合位點，起到抑制翻譯、切割或降解mRNA的作用，是基因表達過程的負性調控因子[14]。在ARDS中，外周血中HMGB1顯著升高[15]，NLRP3炎癥小體顯著活化[16-17]。本研究旨在探究在ARDS中能同時靶向HMGB1和NLRP3的miRNA，在人肺微血管內皮細胞（human pulmonary microvascular endothelial cell，HPMEC）中干預miRNA的表達，驗證其對ARDS炎癥反應的作用。
1 材料與方法
1.1 ARDS患者血漿收集
選擇東部戰區總醫院2019年1月—6月重癥醫學科（intensive care unit，ICU）住院治療的由于腹腔感染導致的ARDS患者，確診后立即收集患者外周血。另外，在東部戰區總醫院體檢中心選擇年齡相匹配的健康志愿者作為對照組。通過體檢結果及詢問病史查體，所有健康志愿者都沒有基礎疾病史，沒有肺部不適癥狀和體征，經胸部X線檢查未發現肺部異常。ARDS患者入選標準：ARDS診斷符合2012年的柏林定義；在血漿收集前24 h內入住ICU的患者；ARDS由腹腔感染引起。腹腔感染的診斷標準：有腹腔感染相關的臨床表現，如發熱、轉移性右下腹痛、麥氏點壓痛、Murphy征陽性、停止排氣排便、腹部壓痛、反跳痛及肌緊張等；實驗室檢查結果：白細胞計數、中性粒細胞百分比、C反應蛋白及降鈣素原增高等；超聲和CT提示腹腔感染；腹腔積液培養提示細菌感染。排除標準：年齡<18歲；妊娠期；免疫功能缺陷患者，包括有干細胞移植史的患者和使用免疫抑制劑的患者；惡性腫瘤患者；預計住院時間<48 h。研究方案符合醫學倫理學標準，經東部戰區總醫院倫理委員會同意實施。健康志愿者及患者家屬均簽署知情同意書。所有參與者留取外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸抗凝，3000 r/min離心15 min，留取上層血漿至EP管中，–80 ℃保存備用。
1.2 miRNA芯片分析
利用TRIzol和miRNeasy mini kit（QIAGEN）提取血漿總RNA，NanoDrop-2000超微量分光光度計鑒定RNA的純度和質量。根據標準流程進行樣品標記（Flash Tag Biotin HSR RNA Labeling Kit，Affymetrix）、微陣列雜交（GeneChip2 Hybridization Oven 640，Affymetrix）、洗滌（GeneChip2 Fluidics Station 450）和掃描（GeneChip2 Scanner 3000 7G，Affymetrix）。信號強度值采用Affymetrix Expression Console?軟件（版本1.3.1）進行評估，并將實驗結果分析運算，將樣本表達數據歸一化。
1.3 主要實驗材料
LPS（美國Sigma公司），脂質體轉染試劑（美國Invitrogen公司），miRNA模擬物、miRNA抑制劑（廣州銳博公司），Trizol（美國Ambion公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCT）試劑盒（日本TAKARA公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司），β-肌動蛋白（β-actin）一抗（南京巴傲得公司），HMGB1、NLRP3、Caspase-1一抗（美國Abcam公司）。
1.4 細胞培養
HPMEC原代細胞、ECM培養基、胎牛血清、內皮細胞生長因子、雙抗（以上均購買自美國ScienCell公司）。用含5%胎牛血清，1%內皮細胞生長因子，1%雙抗的ECM培養基培養，培養條件為37 ℃、5% CO2、常規濕度，選用第4～6代快速生長期細胞進行實驗。
1.5 實驗分組及細胞處理
（1）空白組：HPMEC用LPS刺激；（2）miR-22-3p模擬物陰性對照組：HPMEC轉染miR-22-3p模擬物陰性對照后用LPS刺激；（3）miR-22-3p模擬物組：HPMEC轉染miR-22-3p模擬物后用LPS刺激；（4）miR-22-3p抑制劑陰性對照組：HPMEC轉染miR-22-3p抑制劑陰性對照后用LPS刺激；（5）miR-22-3p抑制劑組：轉染miR-22-3p抑制劑后用LPS刺激。約1×106個HPMEC接種于6孔板中，至70%～80%左右的細胞密度。用125 μL Opti-MEM稀釋Lipofectamin?3000，溫和混勻并恒溫孵育5 min，用125 μL Opti-MEM分別稀釋10 μL miR-22-3p模擬物、miR-22-3p抑制劑及其陰性對照，溫和混勻并恒溫孵育5 min。將兩者溫和混勻，室溫孵育20 min，后將混合液加入到各孔中，置于培養箱中培養24～48 h。在每孔中加入終濃度為10 μg/mL LPS進行刺激，放入恒溫箱培養6 h。
1.6 RT-qPCR實驗
收集細胞，Trizol提取總RNA，按照TAKARA逆轉錄試劑盒說明書合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），并以cDNA作為模板進行RT-qPCR。反應在viia7 PCR System上操作（美國ABI公司），反應體系：cDNA 1 μL，SYBR Green 5 μL，前后引物（10 μmol/L）各0.2 μL，Dnase-Free ddH2O 3.6 μL。反應條件：95 ℃ 30 s，隨后95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，HMGB1、NLRP3、IL-6、IL-8、IL-1β的相對表達量以2–ΔΔCt方法計算。引物序列如下：HMGB1上游5′-GCTCCATAGAGACAGCGCCGGG-3′，下游5′-CCTCAGCGAGGCACAGAGTCGC-3′；NLRP3上游5′-GAGCTGGACCTCAGTGACAATGC-3′，下游5′-ACCAATGCGAGATCCTGACAACAC-3′；IL-6上游5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′，下游5′- CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′；IL-8上游5′-ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3′，下游5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3′，IL-1β上游5′-AGCTACGAATCTCCGACCAC-3′，下游5′-CGTTATCCCATGTGTCGAAGAA-3′；GAPDH上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。實驗重復4次。
1.7 蛋白印跡法檢測蛋白表達
細胞處理完成后，提取各組總蛋白測定蛋白濃度，各組取40 μg蛋白進行電泳，冰浴電轉至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗孵育4 ℃過夜，TBST洗膜4次，室溫下二抗孵育1.5 h，TBST洗膜4次，ECL發光系統曝光檢測。實驗重復3次。
1.8 酶聯免疫吸附試驗檢測細胞上清的炎癥因子
HPMEC按細胞處理完成后收集細胞上清液，按照酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒中的說明，測定炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-8的含量。
1.9 統計學方法
采用SPSS 24.0統計軟件。數值變量如果服從正態分布，采用方差分析進行組間比較，如果組間差異有統計學意義，且符合方差齊性，進一步采用LSD法進行兩兩比較，若不符合方差齊性，則采用Dunnett's T3法進行兩兩比較。如果不服從正態分布，組間比較采用非參數檢驗（Kruskal-Wallis秩和檢驗），當組間總的有統計學差異，進一步采用Dunn法進行多重比較。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 miR-22-3p在腹腔感染的ARDS患者中表達下降
對3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受試者的血漿行Affymetrix miRNA 4.0 Array芯片分析。芯片分析結果顯示，miR-22-3p在腹腔感染所致的ARDS患者中的表達下調顯著，為健康受試者的0.062倍。
2.2 miR-22-3p對HMGB1表達的影響
用10 μg/mL的LPS刺激的HPMEC細胞，miR-22-3p模擬物組細胞內HMGB1 mRNA表達與空白組相比明顯下調（0.70±0.15比1.00±0.00，P<0.01），蛋白水平與mRNA趨勢相同；miR-22-3p抑制劑組HMBG1 mRNA（1.20±0.10比1.00±0.00，P<0.05）表達水平明顯上調，蛋白呈現出與mRNA相同的趨勢。 結果見圖1。
圖1
miR-22-3p對LPS刺激的HPMEC中HMGB1表達的影響
a. 蛋白印跡檢測像；b. RT-qPCR定量分析柱狀圖。miR-22-3p的過表達使HMGB1蛋白和mRNA水平降低，miR-22-3p的低表達使HMGB1蛋白和mRNA水平升高。1. 空白組；2. miR-22-3p模擬物陰性對照組；3. miR-22-3p模擬物組；4. miR-22-3p抑制劑陰性對照組；5. miR-22-3p抑制劑組。與空白組比較，*
2.3 miR-22-3p對LPS刺激下NLRP3炎癥小體形成的影響
與空白組相比，miR-22-3p模擬物組細胞內NLRP3的mRNA水平顯著下調（0.52±0.06比1.00±0.00，P<0.001），miR-22-3p抑制劑組NLRP3的mRNA水平顯著上調（1.46±0.06比1.00±0.00，P<0.001），蛋白也呈現出與mRNA相同的趨勢。與空白組相比，miR-22-3p模擬物組細胞內活化的Caspase-1的表達顯著降低，IL-1β mRNA（1.78±1.12比4.80±1.13，P<0.01）及細胞上清中的IL-1β［（26.26±1.46）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］顯著降低；miR-22-3p抑制劑組細胞內活化的Caspase-1的表達顯著升高，IL-1β mRNA（7.77±0.66比4.80±1.13，P<0.01）及細胞上清中的IL-1β［（48.22±2.14）pg/mL比（35.50±1.86）pg/mL，P<0.001］顯著升高。 結果見圖2。
圖2
miR-22-3p對LPS刺激的HPMEC中炎癥小體的影響
a. NLRP3 RT-qPCR定量分析柱狀圖；b. IL-1β RT-qPCR定量分析柱狀圖；c. 上清IL-1β ELISA檢測柱狀圖；d. 蛋白印跡檢測像。miR-22-3p的過表達使 NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平降低，miR-22-3p的低表達使NLRP3、IL-1β、cleaved-caspase-1水平升高。1. 空白組；2. miR-22-3p模擬物陰性對照組；3. miR-22-3p模擬物組；4. miR-22-3p抑制劑陰性對照組；5. miR-22-3p抑制劑組。與空白組比較，**
2.4 miR-22-3p對LPS刺激下HPMEC炎癥的影響
與空白組相比，miR-22-3p模擬物組炎癥因子IL-6 mRNA（4.06±1.60比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（10.64±7.16比32.08±2.01，P<0.001），以及上清中的IL-6［（287.83±3.22）pg/mL比(322.51±3.99) pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白濃度［（2436.54±53.24）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］顯著下調，miR-22-3p抑制劑組炎癥因子IL-6 mRNA（10.98±1.55比7.10±0.82，P<0.01）和IL-8 mRNA水平（44.97±5.62比32.08±2.01，P<0.01），以及上清中的IL-6［（340.30±4.51）pg/mL比（322.51±3.99）pg/mL，P<0.01］和IL-8蛋白濃度［（3119.19±221.63）pg/mL比（2827.86±98.47）pg/mL，P<0.01］顯著上調。 結果見圖3。
圖3
miR-22-3p對LPS刺激的HPMEC中炎癥因子的影響
a. IL-6 RT-qPCR定量分析柱狀圖；b. 上清IL-6 ELISA檢測柱狀圖；c. IL-8 RT-qPCR定量分析柱狀圖；d. 上清IL-8 ELISA檢測柱狀圖。與空白組相比，miR-22-3p的過表達使IL-6、IL-8水平下調，miR-22-3p的低表達使IL-6、IL-8水平上調。1. 空白組；2. miR-22-3p模擬物陰性對照組；3. miR-22-3p模擬物組；4. miR-22-3p抑制劑陰性對照組；5. miR-22-3p抑制劑組。與空白組比較，**
3 討論
ARDS以級聯放大的“炎癥風暴”為特征。盡管對ARDS的發病機制有了較深入的了解，但目前仍對基因水平的調控機制知之甚少。HMGB1與多種疾病均存在關聯，包括膿毒癥、自身免疫疾病、獲得性免疫缺陷綜合征、糖尿病、腫瘤等，且目前研究證實HMGB1在ARDS的發病機制中扮演著重要的角色[18]。NLRP3炎癥小體是天然免疫系統中一種重要的細胞內多蛋白復合物，其活化可以在一定程度上幫助機體抵御病原體的入侵，但是在ARDS中其過度活化則會導致炎癥相關的組織損傷[19-20]。一系列研究證明HMGB1與NLRP3炎癥小體有密切的關聯，兩者可相互激活活化。HMGB1通過TLR2通路增加NLRP3和Caspase-1的表達，通過RAGE通路增加ASC和Caspase-1的表達，通過TLR4通路增加Caspase-1的表達[21]。另外，也有文獻報道炎癥小體的活化促進HMGB1的表達釋放[22]。因此，HMGB1和NLRP3的相互活化可能在ARDS中起到重要的推動作用，若能同時減少兩者表達，可能對ARDS的進展有減緩作用。
許多研究表明miRNA在細胞增殖、分化、凋亡、遷移、炎癥、免疫應答、代謝、器官發生和腫瘤形成等基本生理和病理過程中起著重要的作用。與此同時，多種生理病理過程也會影響miRNA的生物合成。在ARDS中，機體多種miRNA的表達發生變化，變化的miRNA也起到重要的調控作用。本研究收集了3例因腹腔感染所致ARDS患者和3例健康受試者的血漿，行miRNA芯片分析，數種miRNA在ARDS患者中表達下調。查閱文獻后發現，在口腔鱗癌細胞模型中，miR-22-3p可通過靶向NLRP3抑制腫瘤細胞的增殖和遷移[23]。在胃癌模型中，幽門螺桿菌的感染抑制了miR-22-3p的表達，減少其對NLRP3表達的抑制，導致胃上皮細胞不可控的持續增殖，最終導致胃癌的發生[24]。亦有報道miR-22-3p可通過靶向HMGB1減輕急性腎損傷[25]。在肝癌細胞中，miR-22-3p可通過靶向HMGB1影響腫瘤的遷移和增值[26]。不同疾病模型發病機制不同，在ARDS中，miR-22-3p能否靶向HMGB1和NLRP3從而發揮功能仍無相關研究，推測miR-22-3p可能通過同時靶向HMGB1和NLRP3減輕炎癥反應。
有研究證實，在肺部感染導致的ARDS中，直接損傷主要影響肺泡上皮，并產生局部肺泡炎癥反應，而在肺外因素導致的ARDS中，間接損傷通過血流中的炎癥介質影響血管內皮[27]。腹腔感染導致的ARDS，人肺微血管內皮細胞起到“主控者”的重要作用，因此，本試驗擬通過HPMEC作為細胞模型，通過過表達和低表達細胞內的miR-22-3p，研究miR-22-3p對人肺微血管內皮細胞炎癥的影響及其作用靶點。研究發現，在HPMEC炎癥模型中，miR-22-3p可同時抑制HMGB1及NLRP3 mRNA和蛋白表達。研究顯示，miRNA沉默靶標主要通過使mRNA衰變或抑制翻譯的方式發揮作用。本研究顯示，miR-22-3p可能通過促進HMGB1和NLRP3 mRNA衰減，最終起到抑制HMGB1和NLRP3蛋白表達的作用。既往的研究表明，在炎癥細胞中，HMGB1和NLRP3炎癥小體可以互相激活從而增強炎癥反應[28-29]，因此，降低HMGB1的水平和（或）減少NLRP3炎癥小體的激活可以破壞這種相互激活產生的正反饋。筆者認為，在生理情況下，miR-22-3p部分抑制了HMGB1及NLRP3的表達，使其表達水平在正常范圍內。而在ARDS等急性炎癥時，miR-22-3p水平降低，對HMBG1和NLRP3的抑制作用大大減弱，使其表達升高，更易相互激活產生正反饋作用，從而進一步惡化炎癥水平。
綜上所述，本研究證實miR-22-3p 可下調HMGB1和NLRP3的蛋白表達，從而減緩LPS刺激HPMEC所致炎癥反應，有望成為ARDS防治的新靶點。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
