引用本文： 周永召, 陸思芬, 劉丹, 范紅, 王業, 李為民. 宏基因組高通量測序技術能夠引領呼吸感染性疾病邁進精準醫學時代嗎？. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(2): 137-141. doi: 10.7507/1671-6205.202202029 復制
Bassetti等發文預測，至2050年，抗生素耐藥每年將造成世界上約1000萬人死亡，高于惡性腫瘤致死人數[1]，而下呼吸道感染的耐藥性對抗生素耐藥性的影響最大[2]。我國是抗生素使用大國，據統計僅2013年我國一年的抗生素使用量高達16.2萬噸，約占世界用量的一半，其中約48%為人用[3]。大量抗生素使用的原因之一在于感染性疾病病原學診斷困難，62%的社區獲得性肺炎難以獲得病原學依據[4]，只能經驗性使用抗生素治療，這造成了一定程度上的抗生素濫用。近年來，學界一直在探討如何精準獲得呼吸感染性疾病的病原學依據，并基于病原學依據規范使用抗生素，實現抗生素濫用及抗生素耐藥的雙降低，最終邁進呼吸感染性疾病的精準診療時代[5]。目前宏基因組高通量測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術已經廣泛應用于感染性疾病的病原學臨床診斷[6-7]，我國也發表了多篇專家共識指導mNGS技術在臨床上的規范應用[8-14]，呼吸感染領域甚至在2018年，就已經將mNGS技術寫進了相關指南以指導呼吸感染臨床實踐[15]，隨著近年來mNGS在呼吸感染領域中更加廣泛的應用，mNGS技術是否能夠引領呼吸感染性疾病邁進精準醫學時代？呼吸領域專業醫生觀點不一，本文就此談一談我們的看法。
mNGS技術是通過對臨床樣本的所有DNA或RNA進行鳥槍法測序，可以無偏倚地同時檢測多種病原微生物（包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲）。二代和三代測序平臺均可用于該項技術。按從樣本中提取的核酸類型不同可以分為宏基因組測序和宏轉錄組測序。按照測序模式可以分為單端測序和雙端測序[12]。隨著技術的逐步推廣，目前已逐漸實現臨床樣本不出“醫院”或者不出“本地區”的本地化檢測模式。
1 mNGS技術在呼吸感染性疾病各類病原體臨床診斷中應用實踐
1.1 mNGS在呼吸系統細菌感染中的臨床實踐
呼吸系統細菌感染的主要病原體主要包括需氧菌，兼性厭氧菌及厭氧菌，此外還包括非典型病原體及結核分支桿菌及非結核分支桿菌等特殊類型[16]。對于肺部感染患者，mNGS的病原檢測陽性檢出率顯著優于常規病原菌診斷方法（115/140，82.14%比50/140，35.71%，P<0.05)[17]。最近我國發起的一項全國多中心前瞻性臨床研究也進一步證實，mNGS對于重癥社區獲得性肺炎病原檢出率為90.3%，而傳統微生物檢測技術的病原檢出率僅有39.5%[18]。此外，mNGS對于肺部厭氧菌相關感染也有很好的診斷效率[19]，顯著彌補了傳統微生物檢測對于肺部厭氧菌感染診療的不足。研究顯示，肺部厭氧菌感染的標本中mNGS病原檢出率為71.43%（10/14），遠高于培養7.14%（1/14）（P<0.01）[20]。此外，mNGS檢測還進一步明確了以前認識非常不足的肺部感染病原微生物，比如微小微單胞菌肺部感染[21]。對于非典型病原體感染，例如鸚鵡熱衣原體，近兩年，這種以前少見的重癥肺炎致病病原體因mNGS技術的廣泛應用，發現的越來越多，臨床醫生對此類病原體的認識也越來越深入[22-24]。一項回顧性研究證實mNGS診斷肺結核的敏感性為59%（59/100），顯著高于涂片法（15%，15/100）和培養法（26%，26/100），差異均有統計學意義（均P<0.001），但與Xpert法（52%，52/100）比較差異無統計學意義（P=0.090）[25]；國內多項相關研究也得出了類似的相似結論，但是mNGS在明確結核合并其他感染時具有獨特優勢[26-27]。需要明確的是，在排除污染情況下，即使測到一條結核序列也要考慮其是致病菌可能性[11]。目前階段，對于肺結核診斷，可以通過mNGS聯合Xpert及傳統結核診斷方法提高診斷的敏感性。而需要強調的是測序深度對低豐度物種鑒定、對測序數據可信度均有影響[28]，且測序深度影響mNGS的敏感性[10, 12, 29]，或許提高測序深度能進一步調高mNGS對于肺結核的診斷敏感性，這需要進一步的研究證實。
1.2 mNGS在呼吸系統真菌感染中的臨床實踐
真菌是呼吸系統重要的感染病原之一[15-16]。最近的臨床實踐研究證實mNGS對于隱球菌、肺孢子菌、曲霉以及根霉等都有很好的診斷效率，可以提高重癥肺炎真菌病原學診斷的敏感性，可作為傳統真菌微生檢測手段的有效補充方法[30-32]，同時能夠明確少見真菌感染，如波氏假阿利什霉[33]。尤其是對于免疫力低下患者常繼發的肺孢子菌肺炎，mNGS不但敏感性高、特異性好，還可以檢出合并的其他病毒或細菌混合感染，并且發現肺泡灌洗液和血液樣本中mNGS檢測肺孢子菌結果高度一致[18, 31]。需要注意的是對于在核酸提取過程中破壁困難的真菌，主要包括曲霉、毛霉、隱球菌屬與雙相真菌等，即使在檢測報告中序列數較低，也要考慮其為致病微生物[12]。
1.3 mNGS在呼吸系統病毒感染中的臨床實踐
病毒作為呼吸系統感染的主要病原微生物之一[15-16]，近年來越發受到臨床重視，尤其是近年來新型冠狀病毒肺炎疫情的出現[34-35]。由于呼吸道樣本中病毒的核酸提取難度相對較簡單[12]，因此只要有合適的引物，理論上講mNGS對于呼吸系統病毒感染的診斷敏感性不優于相應的病毒PCR檢測[36]，而且如果是RNA病毒引起的相關感染，必須行mNGS RNA測序才能明確診斷，mNGS DNA檢測是不能識別RNA病毒相關感染的[12, 32]。mNGS對于呼吸系統病毒感染的優勢主要在于新發未知病毒感染（如SARS-CoV-2[34]）及少見病毒感染診斷，例如最近報道的運用mNGS技術快速明確單純皰疹病毒性肺炎案例[37]，另外一項研究也證實了mNGS技術在重癥腺病毒７型肺炎快速精準診斷中的重要作用[38]。
1.4 mNGS在呼吸系統混合病原體感染中的臨床實踐
最近中國疾病預防控制中心基于傳統微生物檢測技術的一項來自我國106個城市、277家哨點醫院和92個參考實驗室，歷時11年的呼吸道傳染病監測數據明確了我國呼吸道感染的主要病原譜特征，其中混合感染不容忽視[39]。最近一項基于mNGS技術的研究也提示在納入的329例重癥社區獲得性肺炎患者中使用mNGS技術聯合常規微生物檢測方法進行病原體檢測，117例患者（35.9%）僅有1種潛在病原體，60例患者（18.2%）有2種潛在病原體，73例患者（22.2%）有3種潛在病原體，54例患者（16.41%）至少有4種潛在病原體[18]。因此，臨床醫生應進一步提高對呼吸系統混合病原體感染的診療認識。一項納入159例社區獲得性肺炎患者的隊列研究提示mNGS相對傳統檢測能夠明確更多的混合病原體感染[40]。尤其是對免疫抑制患者相關的呼吸系統感染，存在更多的混合病原體感染，mNGS技術體現出了其檢測范圍廣的獨特優勢[18, 21, 41]。因此，在mNGS技術時代，如何根據mNGS檢測報告，結合傳統微生物檢測結果及患者臨床信息準確識別并精準確定真正的“責任”病原菌是實現呼吸道混合病原菌感染的關鍵[7, 11-12]。
2 mNGS技術在呼吸感染性疾病診療實踐中的關鍵點
2.1 缺乏統一規范的mNGS技術及報告解讀標準
mNGS技術目前已經是一項成熟的技術，國內也有數十家從事相關技術臨床應用的公司及機構，不同機構mNGS技術具體實施細節也不盡相同，臨床醫生對于報告的臨床解讀也缺乏統一規范標準，存在基于個人臨床微生物經驗性認知的“經驗性”解讀狀況。為進一步規范mNGS技術在臨床上的規范應用，我國相關部門開展了全國多中心的mNGS試劑質量評價聯合研究與mNGS室間質量評價研究[42-43]，結果不容樂觀。現階段制約mNGS臨床規范應用的主要瓶頸，逐漸由技術本身的局限和挑戰轉變為相關試劑耗材及生物信息學分析的質量控制與評價方法以及質量標準等的缺失[44]。此外，不同室間對標準品檢測結果存在差異，且假陽性和假陰性問題突出[42]。對于報告結果解讀，尤其是呼吸道感染相關檢測報告，缺乏臨床醫生及微生物相關專家的深度參與。相關研究也進一步提出并建議開展基于“本醫院”的本地化mNGS應用模式，以規避并解決影響mNGS技術臨床規范應用的相關因素[42, 45]。
2.2 mNGS技術在感染性疾病臨床實踐中的關鍵點
2.2.1 抗生素提前應用對mNGS檢測結果的影響比傳統微生物檢測小
相關研究顯示在96例mNGS檢測前2周接受抗生素治療的患者中，血標本的mNGS病原檢出率47.9%；血培養則只有19.6%[46]。主要原因是因為mNGS技術檢測的是微生物的核酸物質，因此只要有微生物的核酸物質存在，理論上講就能夠被檢測出來。
2.2.2 對于免疫力低下患者，糖皮質激素使用量不影響mNGS病原檢出率
關于糖皮質激素等對mNGS病原檢出率的影響，一項研究納入了108例接受糖皮質激素治療的免疫抑制疑似感染的患者，結果提示，累計使用糖皮質激素量大的免疫抑制患者中，mNGS病原檢出率不受糖皮質激素藥量影響[47]。
2.2.3 mNGS技術指導臨床更改抗生素治療方案并改善呼吸系統感染患者預后
既往一項回顧研究發現，依據mNGS檢測結果，感染性疾病患者初始經驗性抗生素治療未覆蓋可能致病菌的概率高達58.6%[48]。而在近年來的呼吸感染診療臨床實踐中，多數臨床醫生已經開始根據mNGS檢測報告調整初始的經驗性抗生素使用[18]，且根據mNGS檢測結果進行相關臨床用藥調整，能夠顯著提高呼吸系統感染患者的預后[49-51]。
2.2.4 血液mNGS檢測可替代難以獲得肺泡灌洗液樣本的重癥呼吸感染
一項納入20例重癥肺炎患者的研究顯示，同時送檢血液和肺泡灌洗液行mNGS檢測，肺泡灌洗液中的病原菌與血液樣本中的病原菌高度一致[52]。但是相關研究病例數少，還需要大樣本量的隊列研究進一步驗證相關結論。
2.2.5 實驗室環境、耗材、實驗操作及參考數據庫可能影響mNGS檢測結果
已有研究使用腦脊液樣本探討mNGS技術20 M數據量對不同的病原微生物檢出下限：巨細胞病毒（14拷貝數/mL），肺炎克雷伯菌（8 CFU/mL），人類免疫缺陷病毒（313拷貝數/mL），無乳鏈球菌（10 CFU/mL），黑曲霉菌（220 CFU/mL），新型隱球菌（0.2 CFU/mL），弓形蟲（81個/mL）[44, 53]。可見，mNGS對于樣本中的微生物檢測靈敏度之高，但這也帶來了另一個問題—“污染”，主要包括實驗耗材、環境（包括空氣環境）、實驗技術人員皮膚、實驗操作、甚至同批次強陽性樣本中微生物導致的污染[54]。因此，當mNGS檢測結果陽性，而和臨床傳統檢測結果及臨床疑似感染病原菌不符，尤其是肺泡灌洗液樣本，除了要考慮上呼吸道微生物污染，也要考慮上述實驗環境及實驗操作相關微生物污染的可能性。此外，各個機構所自有的mNGS微生物注釋參考數據庫不同，主要分為全基因組核酸序列數據庫、編碼蛋白的核酸序列數據庫和含有物種特征基因序列數據庫，基于全基因組核酸序列數據庫可能對比到的測序序列數最高，其他兩類數據庫對比到的測序序列數相對較少，但是特異性卻更高。因此，單純基于mNGS測序序列數設置閾值，再判斷所發現微生物是否具有致病性是不合時宜的[55]。綜上，對于mNGS技術臨床規范應用，需要臨床醫生和檢測機構實驗操作人員深入的實時溝通，這也凸顯了以“醫院”為主體，mNGS本地化檢測的優勢[42]。
2.2.6 測序數據量、破壁及去宿主DNA實驗操作顯著影響mNGS檢測結果
測序深度對低豐度物種鑒定和測序數據可信度均有影響[28]，且測序深度影響mNGS的敏感性[10, 12, 29]，為避免假陰性，一般20 M數據量是較好的測序深度選擇[43]，而如果疑似致病菌量少，可選擇提高測序深度以提高陽性率。
細菌、真菌、病毒和寄生蟲的特性不同，增加破壁（例如使用玻璃珠研磨樣本）有利于提高難破壁細菌和真菌的核酸提取效率，但是可能損失病毒核酸[56]。因此，臨床醫生需要根據臨床疑似致病菌結合是否行破壁操作，綜合判斷mNGS報告的臨床符合率[11-12]。
目前去除宿主DNA的方法主要包括去污劑處理（皂苷）、低滲溶液破壞宿主細胞及抗甲基化DNA磁珠等[11]，目前所有的去宿主DNA操作均可能導致樣本中微生物數的絕對損失，尤其是對樣本中病毒、革蘭陰性菌及可能致病的少量微生物影響較大，導致假陰性結果[43]。因此，目前技術條件下，為確保mNGS檢測結果陽性率，提高測序數據量相對來說優于去宿主DNA操作[11-12, 14]。
2.2.7 依據呼吸道樣本mNGS檢測結果中的抗生素耐藥基因指導臨床抗生素使用任重道遠
相關專家共識目前不建議使用mNGS技術檢測呼吸道樣本中微生物的耐藥性[12]。目前mNGS檢測細菌、真菌耐藥性基因存在較高的假陽性和假陰性，基因型和表型可能不一致，尤其對于呼吸道樣本，微生物種類多樣，而且目前大部分的mNGS都是以二代測序的短片度測序為主，組裝后明確的耐藥基因不能確定來自具體的哪個菌種，耐藥基因的解釋存在較大難度[12, 43, 45]。
2.2.8 mNGS技術的規范化應用需要檢測人員和臨床醫生形成討論集體
mNGS技術是不同于傳統微生物檢測技術，涉及適宜患者選擇、規范樣本采集、復雜實驗室操作、生物信息學分析及報告規范解讀，需要檢測人員與臨床醫生形成實時討論集體，實現mNGS技術的規范化臨床應用[45, 57]。
3 mNGS三代測序平臺應用是實現呼吸系統感染性疾病快速診療的主要未來方向
mNGS技術三代測序平臺納米孔測序近年來飛速發展，牛津納米孔技術（Oxford Nanopore Technologies，ONT）測序的準確性已經從最早的64%增加至如今的95%，目前的測序長度也可以達到50 kb，隨著已有的及新的微生物參考基因組序列完善，更高的測序準確性（>99%）、更長的測序長度，以及測序所需的DNA和RNA樣品量進一步降低[58]，納米孔測序技術將實現呼吸系統感染性疾病8小時以內的床旁快速診斷[59]。目前納米孔測序技術在耐藥基因的檢測應用上還主要集中在單菌檢測上[60-61]，未來隨著技術的進步，對于呼吸道復雜微生物樣本，基于長片段的納米孔測序技術將來自不同細菌基因組的抗生素耐藥基因彼此分開，以進行后續分析及臨床應用。
mNGS技術目前已引領呼吸系統感染性疾病邁向精準醫學時代，但是其臨床應用還存在眾多不足，迫切需要各個機構推動基于“本醫院”的本地化mNGS技術臨床應用模式，從而解決mNGS技術臨床規范應用難題，真正讓mNGS這個“明天的技術”解決今天呼吸系統感染的快速、精準、規范診療難題。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。
Bassetti等發文預測，至2050年，抗生素耐藥每年將造成世界上約1000萬人死亡，高于惡性腫瘤致死人數[1]，而下呼吸道感染的耐藥性對抗生素耐藥性的影響最大[2]。我國是抗生素使用大國，據統計僅2013年我國一年的抗生素使用量高達16.2萬噸，約占世界用量的一半，其中約48%為人用[3]。大量抗生素使用的原因之一在于感染性疾病病原學診斷困難，62%的社區獲得性肺炎難以獲得病原學依據[4]，只能經驗性使用抗生素治療，這造成了一定程度上的抗生素濫用。近年來，學界一直在探討如何精準獲得呼吸感染性疾病的病原學依據，并基于病原學依據規范使用抗生素，實現抗生素濫用及抗生素耐藥的雙降低，最終邁進呼吸感染性疾病的精準診療時代[5]。目前宏基因組高通量測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）技術已經廣泛應用于感染性疾病的病原學臨床診斷[6-7]，我國也發表了多篇專家共識指導mNGS技術在臨床上的規范應用[8-14]，呼吸感染領域甚至在2018年，就已經將mNGS技術寫進了相關指南以指導呼吸感染臨床實踐[15]，隨著近年來mNGS在呼吸感染領域中更加廣泛的應用，mNGS技術是否能夠引領呼吸感染性疾病邁進精準醫學時代？呼吸領域專業醫生觀點不一，本文就此談一談我們的看法。
mNGS技術是通過對臨床樣本的所有DNA或RNA進行鳥槍法測序，可以無偏倚地同時檢測多種病原微生物（包括病毒、細菌、真菌和寄生蟲）。二代和三代測序平臺均可用于該項技術。按從樣本中提取的核酸類型不同可以分為宏基因組測序和宏轉錄組測序。按照測序模式可以分為單端測序和雙端測序[12]。隨著技術的逐步推廣，目前已逐漸實現臨床樣本不出“醫院”或者不出“本地區”的本地化檢測模式。
1 mNGS技術在呼吸感染性疾病各類病原體臨床診斷中應用實踐
1.1 mNGS在呼吸系統細菌感染中的臨床實踐
呼吸系統細菌感染的主要病原體主要包括需氧菌，兼性厭氧菌及厭氧菌，此外還包括非典型病原體及結核分支桿菌及非結核分支桿菌等特殊類型[16]。對于肺部感染患者，mNGS的病原檢測陽性檢出率顯著優于常規病原菌診斷方法（115/140，82.14%比50/140，35.71%，P<0.05)[17]。最近我國發起的一項全國多中心前瞻性臨床研究也進一步證實，mNGS對于重癥社區獲得性肺炎病原檢出率為90.3%，而傳統微生物檢測技術的病原檢出率僅有39.5%[18]。此外，mNGS對于肺部厭氧菌相關感染也有很好的診斷效率[19]，顯著彌補了傳統微生物檢測對于肺部厭氧菌感染診療的不足。研究顯示，肺部厭氧菌感染的標本中mNGS病原檢出率為71.43%（10/14），遠高于培養7.14%（1/14）（P<0.01）[20]。此外，mNGS檢測還進一步明確了以前認識非常不足的肺部感染病原微生物，比如微小微單胞菌肺部感染[21]。對于非典型病原體感染，例如鸚鵡熱衣原體，近兩年，這種以前少見的重癥肺炎致病病原體因mNGS技術的廣泛應用，發現的越來越多，臨床醫生對此類病原體的認識也越來越深入[22-24]。一項回顧性研究證實mNGS診斷肺結核的敏感性為59%（59/100），顯著高于涂片法（15%，15/100）和培養法（26%，26/100），差異均有統計學意義（均P<0.001），但與Xpert法（52%，52/100）比較差異無統計學意義（P=0.090）[25]；國內多項相關研究也得出了類似的相似結論，但是mNGS在明確結核合并其他感染時具有獨特優勢[26-27]。需要明確的是，在排除污染情況下，即使測到一條結核序列也要考慮其是致病菌可能性[11]。目前階段，對于肺結核診斷，可以通過mNGS聯合Xpert及傳統結核診斷方法提高診斷的敏感性。而需要強調的是測序深度對低豐度物種鑒定、對測序數據可信度均有影響[28]，且測序深度影響mNGS的敏感性[10, 12, 29]，或許提高測序深度能進一步調高mNGS對于肺結核的診斷敏感性，這需要進一步的研究證實。
1.2 mNGS在呼吸系統真菌感染中的臨床實踐
真菌是呼吸系統重要的感染病原之一[15-16]。最近的臨床實踐研究證實mNGS對于隱球菌、肺孢子菌、曲霉以及根霉等都有很好的診斷效率，可以提高重癥肺炎真菌病原學診斷的敏感性，可作為傳統真菌微生檢測手段的有效補充方法[30-32]，同時能夠明確少見真菌感染，如波氏假阿利什霉[33]。尤其是對于免疫力低下患者常繼發的肺孢子菌肺炎，mNGS不但敏感性高、特異性好，還可以檢出合并的其他病毒或細菌混合感染，并且發現肺泡灌洗液和血液樣本中mNGS檢測肺孢子菌結果高度一致[18, 31]。需要注意的是對于在核酸提取過程中破壁困難的真菌，主要包括曲霉、毛霉、隱球菌屬與雙相真菌等，即使在檢測報告中序列數較低，也要考慮其為致病微生物[12]。
1.3 mNGS在呼吸系統病毒感染中的臨床實踐
病毒作為呼吸系統感染的主要病原微生物之一[15-16]，近年來越發受到臨床重視，尤其是近年來新型冠狀病毒肺炎疫情的出現[34-35]。由于呼吸道樣本中病毒的核酸提取難度相對較簡單[12]，因此只要有合適的引物，理論上講mNGS對于呼吸系統病毒感染的診斷敏感性不優于相應的病毒PCR檢測[36]，而且如果是RNA病毒引起的相關感染，必須行mNGS RNA測序才能明確診斷，mNGS DNA檢測是不能識別RNA病毒相關感染的[12, 32]。mNGS對于呼吸系統病毒感染的優勢主要在于新發未知病毒感染（如SARS-CoV-2[34]）及少見病毒感染診斷，例如最近報道的運用mNGS技術快速明確單純皰疹病毒性肺炎案例[37]，另外一項研究也證實了mNGS技術在重癥腺病毒７型肺炎快速精準診斷中的重要作用[38]。
1.4 mNGS在呼吸系統混合病原體感染中的臨床實踐
最近中國疾病預防控制中心基于傳統微生物檢測技術的一項來自我國106個城市、277家哨點醫院和92個參考實驗室，歷時11年的呼吸道傳染病監測數據明確了我國呼吸道感染的主要病原譜特征，其中混合感染不容忽視[39]。最近一項基于mNGS技術的研究也提示在納入的329例重癥社區獲得性肺炎患者中使用mNGS技術聯合常規微生物檢測方法進行病原體檢測，117例患者（35.9%）僅有1種潛在病原體，60例患者（18.2%）有2種潛在病原體，73例患者（22.2%）有3種潛在病原體，54例患者（16.41%）至少有4種潛在病原體[18]。因此，臨床醫生應進一步提高對呼吸系統混合病原體感染的診療認識。一項納入159例社區獲得性肺炎患者的隊列研究提示mNGS相對傳統檢測能夠明確更多的混合病原體感染[40]。尤其是對免疫抑制患者相關的呼吸系統感染，存在更多的混合病原體感染，mNGS技術體現出了其檢測范圍廣的獨特優勢[18, 21, 41]。因此，在mNGS技術時代，如何根據mNGS檢測報告，結合傳統微生物檢測結果及患者臨床信息準確識別并精準確定真正的“責任”病原菌是實現呼吸道混合病原菌感染的關鍵[7, 11-12]。
2 mNGS技術在呼吸感染性疾病診療實踐中的關鍵點
2.1 缺乏統一規范的mNGS技術及報告解讀標準
mNGS技術目前已經是一項成熟的技術，國內也有數十家從事相關技術臨床應用的公司及機構，不同機構mNGS技術具體實施細節也不盡相同，臨床醫生對于報告的臨床解讀也缺乏統一規范標準，存在基于個人臨床微生物經驗性認知的“經驗性”解讀狀況。為進一步規范mNGS技術在臨床上的規范應用，我國相關部門開展了全國多中心的mNGS試劑質量評價聯合研究與mNGS室間質量評價研究[42-43]，結果不容樂觀。現階段制約mNGS臨床規范應用的主要瓶頸，逐漸由技術本身的局限和挑戰轉變為相關試劑耗材及生物信息學分析的質量控制與評價方法以及質量標準等的缺失[44]。此外，不同室間對標準品檢測結果存在差異，且假陽性和假陰性問題突出[42]。對于報告結果解讀，尤其是呼吸道感染相關檢測報告，缺乏臨床醫生及微生物相關專家的深度參與。相關研究也進一步提出并建議開展基于“本醫院”的本地化mNGS應用模式，以規避并解決影響mNGS技術臨床規范應用的相關因素[42, 45]。
2.2 mNGS技術在感染性疾病臨床實踐中的關鍵點
2.2.1 抗生素提前應用對mNGS檢測結果的影響比傳統微生物檢測小
相關研究顯示在96例mNGS檢測前2周接受抗生素治療的患者中，血標本的mNGS病原檢出率47.9%；血培養則只有19.6%[46]。主要原因是因為mNGS技術檢測的是微生物的核酸物質，因此只要有微生物的核酸物質存在，理論上講就能夠被檢測出來。
2.2.2 對于免疫力低下患者，糖皮質激素使用量不影響mNGS病原檢出率
關于糖皮質激素等對mNGS病原檢出率的影響，一項研究納入了108例接受糖皮質激素治療的免疫抑制疑似感染的患者，結果提示，累計使用糖皮質激素量大的免疫抑制患者中，mNGS病原檢出率不受糖皮質激素藥量影響[47]。
2.2.3 mNGS技術指導臨床更改抗生素治療方案并改善呼吸系統感染患者預后
既往一項回顧研究發現，依據mNGS檢測結果，感染性疾病患者初始經驗性抗生素治療未覆蓋可能致病菌的概率高達58.6%[48]。而在近年來的呼吸感染診療臨床實踐中，多數臨床醫生已經開始根據mNGS檢測報告調整初始的經驗性抗生素使用[18]，且根據mNGS檢測結果進行相關臨床用藥調整，能夠顯著提高呼吸系統感染患者的預后[49-51]。
2.2.4 血液mNGS檢測可替代難以獲得肺泡灌洗液樣本的重癥呼吸感染
一項納入20例重癥肺炎患者的研究顯示，同時送檢血液和肺泡灌洗液行mNGS檢測，肺泡灌洗液中的病原菌與血液樣本中的病原菌高度一致[52]。但是相關研究病例數少，還需要大樣本量的隊列研究進一步驗證相關結論。
2.2.5 實驗室環境、耗材、實驗操作及參考數據庫可能影響mNGS檢測結果
已有研究使用腦脊液樣本探討mNGS技術20 M數據量對不同的病原微生物檢出下限：巨細胞病毒（14拷貝數/mL），肺炎克雷伯菌（8 CFU/mL），人類免疫缺陷病毒（313拷貝數/mL），無乳鏈球菌（10 CFU/mL），黑曲霉菌（220 CFU/mL），新型隱球菌（0.2 CFU/mL），弓形蟲（81個/mL）[44, 53]。可見，mNGS對于樣本中的微生物檢測靈敏度之高，但這也帶來了另一個問題—“污染”，主要包括實驗耗材、環境（包括空氣環境）、實驗技術人員皮膚、實驗操作、甚至同批次強陽性樣本中微生物導致的污染[54]。因此，當mNGS檢測結果陽性，而和臨床傳統檢測結果及臨床疑似感染病原菌不符，尤其是肺泡灌洗液樣本，除了要考慮上呼吸道微生物污染，也要考慮上述實驗環境及實驗操作相關微生物污染的可能性。此外，各個機構所自有的mNGS微生物注釋參考數據庫不同，主要分為全基因組核酸序列數據庫、編碼蛋白的核酸序列數據庫和含有物種特征基因序列數據庫，基于全基因組核酸序列數據庫可能對比到的測序序列數最高，其他兩類數據庫對比到的測序序列數相對較少，但是特異性卻更高。因此，單純基于mNGS測序序列數設置閾值，再判斷所發現微生物是否具有致病性是不合時宜的[55]。綜上，對于mNGS技術臨床規范應用，需要臨床醫生和檢測機構實驗操作人員深入的實時溝通，這也凸顯了以“醫院”為主體，mNGS本地化檢測的優勢[42]。
2.2.6 測序數據量、破壁及去宿主DNA實驗操作顯著影響mNGS檢測結果
測序深度對低豐度物種鑒定和測序數據可信度均有影響[28]，且測序深度影響mNGS的敏感性[10, 12, 29]，為避免假陰性，一般20 M數據量是較好的測序深度選擇[43]，而如果疑似致病菌量少，可選擇提高測序深度以提高陽性率。
細菌、真菌、病毒和寄生蟲的特性不同，增加破壁（例如使用玻璃珠研磨樣本）有利于提高難破壁細菌和真菌的核酸提取效率，但是可能損失病毒核酸[56]。因此，臨床醫生需要根據臨床疑似致病菌結合是否行破壁操作，綜合判斷mNGS報告的臨床符合率[11-12]。
目前去除宿主DNA的方法主要包括去污劑處理（皂苷）、低滲溶液破壞宿主細胞及抗甲基化DNA磁珠等[11]，目前所有的去宿主DNA操作均可能導致樣本中微生物數的絕對損失，尤其是對樣本中病毒、革蘭陰性菌及可能致病的少量微生物影響較大，導致假陰性結果[43]。因此，目前技術條件下，為確保mNGS檢測結果陽性率，提高測序數據量相對來說優于去宿主DNA操作[11-12, 14]。
2.2.7 依據呼吸道樣本mNGS檢測結果中的抗生素耐藥基因指導臨床抗生素使用任重道遠
相關專家共識目前不建議使用mNGS技術檢測呼吸道樣本中微生物的耐藥性[12]。目前mNGS檢測細菌、真菌耐藥性基因存在較高的假陽性和假陰性，基因型和表型可能不一致，尤其對于呼吸道樣本，微生物種類多樣，而且目前大部分的mNGS都是以二代測序的短片度測序為主，組裝后明確的耐藥基因不能確定來自具體的哪個菌種，耐藥基因的解釋存在較大難度[12, 43, 45]。
2.2.8 mNGS技術的規范化應用需要檢測人員和臨床醫生形成討論集體
mNGS技術是不同于傳統微生物檢測技術，涉及適宜患者選擇、規范樣本采集、復雜實驗室操作、生物信息學分析及報告規范解讀，需要檢測人員與臨床醫生形成實時討論集體，實現mNGS技術的規范化臨床應用[45, 57]。
3 mNGS三代測序平臺應用是實現呼吸系統感染性疾病快速診療的主要未來方向
mNGS技術三代測序平臺納米孔測序近年來飛速發展，牛津納米孔技術（Oxford Nanopore Technologies，ONT）測序的準確性已經從最早的64%增加至如今的95%，目前的測序長度也可以達到50 kb，隨著已有的及新的微生物參考基因組序列完善，更高的測序準確性（>99%）、更長的測序長度，以及測序所需的DNA和RNA樣品量進一步降低[58]，納米孔測序技術將實現呼吸系統感染性疾病8小時以內的床旁快速診斷[59]。目前納米孔測序技術在耐藥基因的檢測應用上還主要集中在單菌檢測上[60-61]，未來隨著技術的進步，對于呼吸道復雜微生物樣本，基于長片段的納米孔測序技術將來自不同細菌基因組的抗生素耐藥基因彼此分開，以進行后續分析及臨床應用。
mNGS技術目前已引領呼吸系統感染性疾病邁向精準醫學時代，但是其臨床應用還存在眾多不足，迫切需要各個機構推動基于“本醫院”的本地化mNGS技術臨床應用模式，從而解決mNGS技術臨床規范應用難題，真正讓mNGS這個“明天的技術”解決今天呼吸系統感染的快速、精準、規范診療難題。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。