引用本文： 倪月艷, 施毅, 蘇欣. 宏基因組高通量測序在肺部感染診療中的應用研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(2): 142-147. doi: 10.7507/1671-6205.202109046 復制
宏基因組高通量測序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）技術從實驗室走到臨床，從最初用于腦脊液和血漿樣本中的病毒檢測到現在廣泛應用于各種宿主樣本中病毒、細菌、真菌及寄生蟲的檢測，特別是在肺部感染性疾病中廣泛應用，協助臨床對于不典型病原體、苛養菌、使用過抗菌藥物導致培養失敗的感染性疾病的精準治療，而且病原體的快速診斷避免了臨床治療不必要的彎路。mNGS在結核、病毒、真菌、非典型病原體感染中是一種非常有效的廣譜病原體篩查方法。本文重點綜述mNGS在肺部感染性疾病中的應用研究。
1 mNGS技術的臨床應用進展
mNGS可同時獨立檢測數千至數十億的DNA片段。mNGS不同于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增靶點測序的方法，而是包括從初級標本中提取總DNA或RNA（通常隨后轉化為DNA）、片段化、文庫制備和深度測序，具有無偏見測序的優點。Illumina測序儀采用橋式擴增技術使得其測序量是市場上所有測序儀中最高的，具有低成本、應用范圍廣等優勢，目前超過一半（62.63%）的臨床mNGS檢測采用Illumina平臺[1]。
近年來，mNGS技術越來越多地應用于臨床，直接從臨床樣本中識別病原體，還有助發現新的致病病原體。2005年第一個高通量測序平臺建立[2]。2008年mNGS第一次用于人類感染性疾病，發現一種新型沙粒病毒[3]。2014年新英格蘭醫學雜志發表了一篇病例報道，1例常規方法始終無法明確診斷的14歲腦膜炎患者，最終利用mNGS證實為鉤端螺旋體感染，指導臨床治療取得成功。這個臨床成功案例具有劃時代的意義，顯示了mNGS在指導臨床精準診治感染性疾病方面所具有的巨大潛力。2019年，Metsky等[4]采用雜交捕獲的設計富集目標序列，一定程度上降低了人源序列的干擾，對于未知感染，捕獲同樣有助于提高病原體組裝率，提高檢測出率和檢出豐度。新型冠狀病毒肺炎疫情爆發之初，常規方法不能明確病原體，只能稱之為“不明原因肺炎”，后來也是采用mNGS方法，在短時間內將病原體確定為是一種新型的冠狀病毒，為精準防控疫情發揮了重要作用。
宏基因組技術還可以預測抗菌藥物耐藥性，鑒定毒力基因，對菌株分型，特別是在檢測不易培育的病原體中具有突出的價值[5-6]。目前，這一技術利用呼吸道樣本、血液、腦脊液、人體組織和糞便等多種臨床樣本來檢測感染病原體，檢測分析時間可控制在24 h以內，最快為6 h[7]。近年來，這一技術在中國臨床實踐中得到較為廣泛的應用，中國學者在這一領域發表的研究成果無論是數量還是質量都有了長足的進步。
2 mNGS在肺部感染性疾病中的應用
據2019年全球疾病負擔顯示，在所有年齡段綜合排名中，肺部感染位列第四位[8]，而在10歲以下兒童中，肺部感染排名第二。肺部感染性疾病發病率高，病原譜廣，耐藥情況較為嚴重。臨床上常規的檢測手段，如涂片鏡檢、培養、抗原/抗體檢測等存在敏感性低、相對費時、覆蓋致病菌種類少等缺點。由于肺部感染病原體的多樣性，傳統檢測手段的局限性，使得臨床上超過2/3的感染性疾病最終仍無法確定病原體，導致臨床不能精準用藥。重癥肺部感染，以及由少見病原體導致的感染尤其需要快速明確病原體。
對于不同患者，選擇合適的呼吸道標本行mNGS檢測可大大提高致病菌的檢出率，通常是支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）>氣道吸引物>痰液>咽拭子。不同的呼吸道分泌物標本中人源/環境污染序列和病原體序列的數量不同，因此選擇不同標本行mNGS檢測對不同病原體的敏感性存在差異，例如血、BALF標本中檢測出曲霉考慮為致病菌的可能性大于痰標本。因此報告解讀時也需關注到檢測標本與檢測出的病原體是否相符的問題。近年來，快速發展的mNGS技術越來越多地應用于肺部感染感染性疾病的診療中，有望實現病毒、非典型病原體、苛養菌、結核、真菌及少見病原體的快速診斷。臨床也不斷有研究報道mNGS在疑難或重癥肺部感染中檢測出病原體，指導臨床由經驗治療轉為精準治療。由此，肺部感染性疾病診療水平得到大幅度提升。
2.1 肺部感染mNGS送檢標本的選擇
2.1.1 BALF mNGS檢測在肺部感染中的應用
BALF是目前用于肺部感染性疾病診斷最理想的檢測標本之一，其受口腔及上呼吸道定植微生物污染少，且人源序列少。BALF標本還可以獲取細胞學、可溶性蛋白、酶類、細胞因子、生物活性介質等多種信息，因此BALF成為診斷肺部疾病的重要手段。正確規范的標本采集對臨床檢測有著至關重要的作用，BALF在采集時需棄去前段可能污染的部分，收集后段10 mL置塑料或玻璃管，及時送檢，若不能及時送檢應保存于–70℃冰箱或液氮。Chen等[9]比較了外周血和BALF標本mNGS檢測對肺部感染的診斷價值，發現BALF mNGS較外周血mNGS更敏感（81.3%比25.0%，P=0.003），而二者的特異性無顯著差異。Xie等[10]比較了同一患者BALF和外周血標本中病原體的序列數，發現BALF樣本顯著高于血樣本。BALF mNGS檢測在肺部感染中的價值也不斷被臨床研究證實[11-13]。
2.1.2 外周血mNGS在肺部感染中的應用
外周血標本不易被污染，檢測結果較易判讀。在一些病情復雜的危重患者中，感染部位往往難以確定，難以獲得合格標本。從外周血樣本中獲取病原體信息是一種可能的方法，對于合并肺部感染的菌血癥或膿毒癥患者而言，其外周血中的病原體核酸片段多，因此mNGS檢測有較好的臨床價值。由于外周血中的人源序列多，幾乎所有的公司檢測血標本都是離心后只檢測血漿，放棄細胞層，導致檢測敏感性下降。有研究對78例ICU患者的血漿行mNGS和傳統細菌培養分析，結果顯示單純培養組的診斷敏感性為12.8%（10/78），mNGS組的診斷敏感性為30.8%（24/78），為制定治療方案提供了更有用的信息[14]。Blauwkamp等[15]研究了348例符合膿毒癥診斷標準的患者，使用mNGS技術檢測外周血中病原體，與初始血培養相比，mNGS敏感性達到93.7%（59/63），與所有微生物檢測結果（包括組織和體液培養、血清學、核酸檢測及血培養）相比，mNGS敏感性為84.9%（112/132）。因此，在臨床考慮存在菌血癥或膿毒癥時，外周血mNGS檢測病原體的敏感性高，臨床價值大。
2.1.3 氣管抽吸物、痰mNGS在肺部感染中的應用
氣管抽吸物、痰液標本臨床獲取比較方便易行，在肺部感染中被廣泛采用。但由于存在潛在的口腔和上呼吸道微生物污染，可靠性不及BALF[16-17]，但也有研究表明，在肺炎患者中，氣管抽吸物采樣對氣道微生物群的評估類似于侵入性的微量BALF[18]。目前關于痰mNGS在肺部感染中價值研究較少，Miao等[19]的大樣本臨床研究分析表明在非結核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染中痰mNGS陽性率明顯低于BALF，而在其他細菌、真菌感染中無顯著性差異，在某些特殊病原菌感染中，BALF檢測優于痰液。
2.1.4 其他標本mNGS在肺部感染中的應用
在某些情況下，咽拭子、肺組織、胸腔積液也作為mNGS檢測的標本，例如高度懷疑病毒感染時常采用咽拭子，通常為上呼吸道感染或肺部感染合并上呼吸道感染。肺組織mNGS檢測可用于真菌、結核等特殊病原體感染。Li等[20]應用mNGS檢測了20例肺部感染患者肺活檢組織中的病原微生物，證實mNGS檢測肺活檢組織較培養法和組織病理法在診斷時間和靈敏度上有明顯優勢，特別是苛養菌、真菌及結核分枝桿菌感染。侵入性取樣活檢是侵襲性真菌感染診斷金標準，在行肺組織病理檢查時，可同時送mNGS，為特殊病原體感染提供快速有價值的診療信息[21]。胸腔積液mNGS檢測臨床報道案例較少，可用于存在胸腔積液特別是膿胸的患者。
對于肺部感染性疾病，根據患者的不同情況，往往選取不同的臨床樣本行mNGS明確病原體，取材的一個重要原則是獲取感染部位的標本，在患者可耐受的情況下通過優選樣本類型（肺組織、BALF>氣管抽吸物>痰液>咽拭子）提高呼吸道病原學檢出率，臨床醫生通常將BALF作為mNGS用于肺部感染性疾病診斷中的最佳標本。當前對于不同標本mNGS檢測在不同肺部感染性疾病中的研究都為小樣本研究，尚需要大樣本臨床研究進一步證明。
2.2 mNGS在不同病原體所致肺部感染中的應用
2.2.1 mNGS在肺分枝桿菌感染診斷中的應用
結核病是全球十大死亡原因之一。盡管已有有效的治療方案，但仍面臨著快速和可靠診斷的問題。由于肺結核的非特異性癥狀和體征常與常見肺部感染重疊，可能會延遲肺結核的診斷，增加肺結核相關死亡。臨床迫切需要快速和無假設的診斷方法，以便在診斷過程的早期階段準確區分肺結核和其他常見肺部感染。目前，利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（GeneXpert MTB/RIF，以下簡稱Xpert）已被世界衛生組織認可為結核疑似患者的初步診斷方法。Shi等[17]對比培養、抗酸染色、Xpert等臨床檢測方法，證實mNGS對BALF樣本結核診斷的敏感性為47.9%，與Xpert（45.8%）和培養（46.8%）相似，但遠高于抗酸染色（29.2%），研究還發現mNGS對于肺結核患者的混合感染（如合并真菌、細菌）較常規檢測手段具有明顯優勢。上海復旦大學的大樣本研究中所分離的257種微生物中，結核分枝桿菌（53/257）是最常見的病原體，mNGS檢測結核分枝桿菌的陽性率顯著高于培養[19]。目前國內多個研究顯示BALF mNGS的敏感性優于傳統培養法和抗酸染色，而與Xpert法相似，這可能與分枝桿菌的細胞壁非常堅硬、難以破壁有關。因此，若懷疑分支桿菌感染時，可采取常規方法以外的破壁方法，即使在檢測報告中序列數較低，也應該考慮致病微生物的可能。mNGS檢測在時效性及合并感染時也明顯優于其他檢測方法，將mNGS與培養或Xpert法相結合在結核病的臨床診斷中具有較好的價值[17, 22]。
近年來，NTM的發病率逐年增高，由于該病的臨床特征與肺結核相似，菌種的培養需要特殊的培養基、特定的培養溫度以及延長培養時間，常導致誤診和漏診，延誤治療，嚴重威脅人類生命和健康。mNGS可以實現NTM菌種的快速鑒定[23]，為NTM肺病提供及時精準的診療指導。但由于NTM廣泛存在于環境中，特別是有水的環境，故mNGS檢測NTM陽性結果的解釋應慎重，需要排除污染的可能。
2.2.2 mNGS在下呼吸道病毒感染中的應用
既往常規病毒診斷是基于PCR技術，可檢測病原體的種類非常有限，容易遺漏臨床不常見的、新的病毒[24]。近年來，不斷的有報道通過mNGS技術發現罕見甚至新發病原體，如人類鼻病毒B91感染肺部[25]、新型冠狀病毒肺炎等。目前為止，已有研究利用宏基用組學研究兒童急性呼吸道病毒感染的全面圖譜，有助于呼吸道疾病的檢測和預防[26]。van Rijn等[27]分析了成人慢阻肺急性加重患者的病毒感染，發現與PCR相比，mNGS診斷的敏感性和特異性分別為96%和98%（23/24和1093/1120），證實了mNGS對呼吸道病毒的半定量檢測具有高靈敏度和特異性，且mNGS較高的陰性預測值有助于排除致病性呼吸道病毒感染，從而協助臨床決策。也有研究報道mNGS對常見呼吸道病毒診斷的敏感性低于PCR[24]，這可能與mNGS檢測的內部程序流程有關。對于高度懷疑病毒性肺炎且病情持續進展的患者，mNGS可為臨床診療進一步提供有利線索。
2.2.3 mNGS在肺部真菌及非典型病原體感染中的應用
目前mNGS在肺部真菌及非典型病原體的研究往往為個案報道或混合感染，臨床常規檢測手段檢測不出多種苛養菌和特殊病原體，而mNGS協助臨床對耶氏肺孢子菌[28-29]、尖端賽多孢子菌[30]、曲霉[31-32]、鸚鵡熱衣原體[33-34]、嗜肺軍團菌[35]感染肺部的診斷，最終通過更改治療方案協助臨床治療。Hong等[21]在9例患者應用mNGS檢測血標本有助于明確不能獲取活檢病理的疑似侵襲性真菌感染患者的診斷。
上海復旦大學附屬中山醫院的關于mNGS應用于感染性疾病的診斷性能的大樣本研究中，呼吸系統感染占感染性疾病73.5%（255/347），研究得出mNGS診斷感染性疾病的敏感性和特異性分別為50.7%和85.7%，優于培養法，尤其是結核分枝桿菌、厭氧菌和真菌，且受先前抗菌藥物暴露的影響較小[19]。要而言之，mNGS在結核、病毒、真菌、非典型病原體感染中是一種非常有效的廣譜病原體篩查方法，病原體的快速明確避免了臨床治療不必要的彎路。
2.3 mNGS的臨床適應證
對于免疫缺陷患者，肺炎是其發病和死亡的主要原因之一，早期發現病原菌予適當的抗菌治療和改善臨床結果至關重要。Pan等[11]報道了mNGS對免疫缺陷社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP）患者微生物學診斷中的應用，研究表明mNGS技術在檢測條件致病菌和混合感染方面具有顯著優勢。在一項mNGS用于免疫低下重癥社區獲得性肺炎（severe community acquired pneumonia，SCAP）的研究中[36]，與免疫正常組相比，免疫低下組更易合并感染，mNGS是檢測免疫缺陷SCAP患者混合感染和個體化抗菌藥物治療的有用技術。有研究對108例接受皮質激素治療的疑似感染患者的樣本同時進行mNGS檢測與常規微生物檢測，基于mNGS檢測結果調整抗菌藥物方案的患者治療成功率（81.8%）顯著高于經驗性使用抗菌藥物的患者（52.6%），且mNGS檢測結果不受免疫抑制程度影響，為免疫抑制患者的抗菌藥物治療提供了有價值的信息[37]。
2020年我國一項多中心329例關于BALF mNGS在成人SCAP的價值研究顯示，mNGS相對于常規檢測的高檢出率有助于SCAP致病菌的早期識別，還可用于分析SCAP的致病菌分布情況[38]。Xie等[39]回顧性研究發現使用mNGS與降低重癥患者病死率獨立相關（16.67%比42.3%）。mNGS是明確重癥肺炎引起急性呼吸窘迫綜合征病因學、提高診斷準確性和預后的有價值的工具[40]。Fang等[41]在BALF mNGS對呼吸機相關肺炎的診斷價值研究中發現，使用BALF檢測mNGS可提高呼吸機相關肺炎患者細菌鑒定的敏感性和特異性, 在檢測病毒和識別混合感染方面顯示出明顯的優勢。以上研究表明，mNGS在重癥肺炎、免疫缺陷患者的肺部感染及呼吸機相關肺炎等肺部感染性疾病中的應用可明顯提高感染性疾病病原體的早期診斷。Qian等[24]研究了100例肺部感染患者呼吸道標本mNGS對肺部感染的診斷價值，提出將mNGS作為傳統方法的補充，有助于提高呼吸道感染病原體的檢出率，當懷疑有混合或罕見病原體感染時，免疫功能低下者和（或）病情嚴重需要緊急治療者，建議及時使用mNGS。
由于開展高通量測序的成本仍較高，尚不宜作為所有感染性疾病的常規檢測手段。國內專家共識中指出，mNGS的臨床適應證包括：臨床規范經驗抗感染治療無效且常規方法不能明確病原體；重癥感染或病情持續進展的感染；免疫受損患者發生的感染；慢性感染，或慢性疾病不除外感染等[42]。關于送檢mNGS的最佳時機，目前還需要進一步研究。
3 mNGS報告解讀
正確的解讀同樣是保證mNGS優勢的關鍵，臨床醫生解讀報告時必須明確序列數、相對豐度與鑒定置信度等重要參數的意義。陽性結果有助于明確感染病原體，陰性結果亦可用于排除感染性疾病。mNGS檢測結果需與臨床表現、傳統檢測及檢查結果相結合作出解讀，根據不同情況可分為以下幾種類型：（1）當mNGS檢測結果與患者臨床表現及相關實驗室結果相符合，可根據結果指導臨床抗感染決策。（2）當患者mNGS檢測結果陽性，且與臨床表現相吻合，但未獲得其他實驗室檢查結果證據支持，可進一步完善或重復傳統病原學檢測，并同時啟動治療。（3）當患者僅獲得mNGS陽性檢測結果，但與臨床表現和（或）其他實驗室檢查結果不相符，此時可行PCR檢測進一步驗證，同時結合患者臨床表現綜合分析，不能僅根據mNGS檢測結果進行病原學診斷。（4）當mNGS檢測結果陰性，而其他實驗室檢查結果為陽性，需結合患者臨床表現及其他輔助檢查綜合分析，若為假陰性，在必要情況下可考慮重復mNGS檢測；若為真陰性，則應停用抗菌藥物。
4 mNGS前景與挑戰
mNGS最大優勢在于快速精準、高通量檢測，為早期目標抗感染治療提供證據支持。另一個關鍵優勢是測序數據可以用于其他分析，例如微生物組特征分析，對特定病原體進行耐藥基因檢測和毒力因子分析[43]，輔助臨床耐藥菌的診斷及艱難梭菌的管理與治療，以及通過RNA測序對人類宿主的轉錄組分析。國內有研究根據肺部感染患者和非肺部感染患者有不同的免疫應答，可能有不同的免疫相關轉錄組，比較了從BALF獲得的宿主轉錄組，以尋找肺部感染患者的預測標志。分析顯示，肺部感染組HLA-DRB1顯著上調，而TRAV32、MIR4270、PSME2和GAPDH顯著下調，研究還分析比較了細菌和病毒肺部感染組、結核和非結核組的轉錄組，不同感染組差異表達基因不同，由此得出mNGS結合宿主轉錄組分析有望成為肺部感染臨床診斷的有力工具[44]。
2020年自然雜志的一篇文章介紹了應用納米孔宏基因組學快速診斷下呼吸道細菌感染的方法，即應用皂苷裂解宿主細胞可有效從臨床呼吸樣本中去除高達99.99%的宿主核酸，結合納米孔測序可在6 h內識別病原體和抗菌藥物耐藥性基因[7]，納米孔技術可以通過可擴展、便攜式和云兼容的管道以及添加引物富集原基因，實現快速的高分辨測序。盡管食品及藥物管理局已經為NGS感染性疾病檢測的臨床驗證提供了一般指南，但關于臨床實施mNGS檢測并沒有明確的建議，也沒有提到具體要求。目前提取平臺選擇、核酸提取方法、污染問題（包括樣品、周圍環境或分子生物學試劑），仍是診斷結果可靠性的巨大挑戰。感染性疾病是否有必要行mNGS檢測以及檢測的時機判定、不同標本類型的選擇尚缺乏高證據等級的臨床研究支持的統一標準，仍需要繼續研究。
隨著mNGS檢測技術的不斷發展，用于評估mNGS的臨床效用和成本效益的大樣本前瞻性臨床試驗數據將越來越多；mNGS的總成本和周轉時間將繼續下降；mNGS的其他優勢，如納入了人類宿主反應和微生物組數據，將不斷在臨床中發揮價值。綜上，mNGS可以實現病原體鑒定與相對定量，耐藥基因與毒力因子分析，宿主轉錄組學與免疫反應分析，從病原、藥物、宿主三個維度推動肺部感染精準醫學的發展，mNGS將成為肺部感染性疾病的有力工具。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。
宏基因組高通量測序（metagenomics next generation sequencing，mNGS）技術從實驗室走到臨床，從最初用于腦脊液和血漿樣本中的病毒檢測到現在廣泛應用于各種宿主樣本中病毒、細菌、真菌及寄生蟲的檢測，特別是在肺部感染性疾病中廣泛應用，協助臨床對于不典型病原體、苛養菌、使用過抗菌藥物導致培養失敗的感染性疾病的精準治療，而且病原體的快速診斷避免了臨床治療不必要的彎路。mNGS在結核、病毒、真菌、非典型病原體感染中是一種非常有效的廣譜病原體篩查方法。本文重點綜述mNGS在肺部感染性疾病中的應用研究。
1 mNGS技術的臨床應用進展
mNGS可同時獨立檢測數千至數十億的DNA片段。mNGS不同于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增靶點測序的方法，而是包括從初級標本中提取總DNA或RNA（通常隨后轉化為DNA）、片段化、文庫制備和深度測序，具有無偏見測序的優點。Illumina測序儀采用橋式擴增技術使得其測序量是市場上所有測序儀中最高的，具有低成本、應用范圍廣等優勢，目前超過一半（62.63%）的臨床mNGS檢測采用Illumina平臺[1]。
近年來，mNGS技術越來越多地應用于臨床，直接從臨床樣本中識別病原體，還有助發現新的致病病原體。2005年第一個高通量測序平臺建立[2]。2008年mNGS第一次用于人類感染性疾病，發現一種新型沙粒病毒[3]。2014年新英格蘭醫學雜志發表了一篇病例報道，1例常規方法始終無法明確診斷的14歲腦膜炎患者，最終利用mNGS證實為鉤端螺旋體感染，指導臨床治療取得成功。這個臨床成功案例具有劃時代的意義，顯示了mNGS在指導臨床精準診治感染性疾病方面所具有的巨大潛力。2019年，Metsky等[4]采用雜交捕獲的設計富集目標序列，一定程度上降低了人源序列的干擾，對于未知感染，捕獲同樣有助于提高病原體組裝率，提高檢測出率和檢出豐度。新型冠狀病毒肺炎疫情爆發之初，常規方法不能明確病原體，只能稱之為“不明原因肺炎”，后來也是采用mNGS方法，在短時間內將病原體確定為是一種新型的冠狀病毒，為精準防控疫情發揮了重要作用。
宏基因組技術還可以預測抗菌藥物耐藥性，鑒定毒力基因，對菌株分型，特別是在檢測不易培育的病原體中具有突出的價值[5-6]。目前，這一技術利用呼吸道樣本、血液、腦脊液、人體組織和糞便等多種臨床樣本來檢測感染病原體，檢測分析時間可控制在24 h以內，最快為6 h[7]。近年來，這一技術在中國臨床實踐中得到較為廣泛的應用，中國學者在這一領域發表的研究成果無論是數量還是質量都有了長足的進步。
2 mNGS在肺部感染性疾病中的應用
據2019年全球疾病負擔顯示，在所有年齡段綜合排名中，肺部感染位列第四位[8]，而在10歲以下兒童中，肺部感染排名第二。肺部感染性疾病發病率高，病原譜廣，耐藥情況較為嚴重。臨床上常規的檢測手段，如涂片鏡檢、培養、抗原/抗體檢測等存在敏感性低、相對費時、覆蓋致病菌種類少等缺點。由于肺部感染病原體的多樣性，傳統檢測手段的局限性，使得臨床上超過2/3的感染性疾病最終仍無法確定病原體，導致臨床不能精準用藥。重癥肺部感染，以及由少見病原體導致的感染尤其需要快速明確病原體。
對于不同患者，選擇合適的呼吸道標本行mNGS檢測可大大提高致病菌的檢出率，通常是支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）>氣道吸引物>痰液>咽拭子。不同的呼吸道分泌物標本中人源/環境污染序列和病原體序列的數量不同，因此選擇不同標本行mNGS檢測對不同病原體的敏感性存在差異，例如血、BALF標本中檢測出曲霉考慮為致病菌的可能性大于痰標本。因此報告解讀時也需關注到檢測標本與檢測出的病原體是否相符的問題。近年來，快速發展的mNGS技術越來越多地應用于肺部感染感染性疾病的診療中，有望實現病毒、非典型病原體、苛養菌、結核、真菌及少見病原體的快速診斷。臨床也不斷有研究報道mNGS在疑難或重癥肺部感染中檢測出病原體，指導臨床由經驗治療轉為精準治療。由此，肺部感染性疾病診療水平得到大幅度提升。
2.1 肺部感染mNGS送檢標本的選擇
2.1.1 BALF mNGS檢測在肺部感染中的應用
BALF是目前用于肺部感染性疾病診斷最理想的檢測標本之一，其受口腔及上呼吸道定植微生物污染少，且人源序列少。BALF標本還可以獲取細胞學、可溶性蛋白、酶類、細胞因子、生物活性介質等多種信息，因此BALF成為診斷肺部疾病的重要手段。正確規范的標本采集對臨床檢測有著至關重要的作用，BALF在采集時需棄去前段可能污染的部分，收集后段10 mL置塑料或玻璃管，及時送檢，若不能及時送檢應保存于–70℃冰箱或液氮。Chen等[9]比較了外周血和BALF標本mNGS檢測對肺部感染的診斷價值，發現BALF mNGS較外周血mNGS更敏感（81.3%比25.0%，P=0.003），而二者的特異性無顯著差異。Xie等[10]比較了同一患者BALF和外周血標本中病原體的序列數，發現BALF樣本顯著高于血樣本。BALF mNGS檢測在肺部感染中的價值也不斷被臨床研究證實[11-13]。
2.1.2 外周血mNGS在肺部感染中的應用
外周血標本不易被污染，檢測結果較易判讀。在一些病情復雜的危重患者中，感染部位往往難以確定，難以獲得合格標本。從外周血樣本中獲取病原體信息是一種可能的方法，對于合并肺部感染的菌血癥或膿毒癥患者而言，其外周血中的病原體核酸片段多，因此mNGS檢測有較好的臨床價值。由于外周血中的人源序列多，幾乎所有的公司檢測血標本都是離心后只檢測血漿，放棄細胞層，導致檢測敏感性下降。有研究對78例ICU患者的血漿行mNGS和傳統細菌培養分析，結果顯示單純培養組的診斷敏感性為12.8%（10/78），mNGS組的診斷敏感性為30.8%（24/78），為制定治療方案提供了更有用的信息[14]。Blauwkamp等[15]研究了348例符合膿毒癥診斷標準的患者，使用mNGS技術檢測外周血中病原體，與初始血培養相比，mNGS敏感性達到93.7%（59/63），與所有微生物檢測結果（包括組織和體液培養、血清學、核酸檢測及血培養）相比，mNGS敏感性為84.9%（112/132）。因此，在臨床考慮存在菌血癥或膿毒癥時，外周血mNGS檢測病原體的敏感性高，臨床價值大。
2.1.3 氣管抽吸物、痰mNGS在肺部感染中的應用
氣管抽吸物、痰液標本臨床獲取比較方便易行，在肺部感染中被廣泛采用。但由于存在潛在的口腔和上呼吸道微生物污染，可靠性不及BALF[16-17]，但也有研究表明，在肺炎患者中，氣管抽吸物采樣對氣道微生物群的評估類似于侵入性的微量BALF[18]。目前關于痰mNGS在肺部感染中價值研究較少，Miao等[19]的大樣本臨床研究分析表明在非結核分枝桿菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM）感染中痰mNGS陽性率明顯低于BALF，而在其他細菌、真菌感染中無顯著性差異，在某些特殊病原菌感染中，BALF檢測優于痰液。
2.1.4 其他標本mNGS在肺部感染中的應用
在某些情況下，咽拭子、肺組織、胸腔積液也作為mNGS檢測的標本，例如高度懷疑病毒感染時常采用咽拭子，通常為上呼吸道感染或肺部感染合并上呼吸道感染。肺組織mNGS檢測可用于真菌、結核等特殊病原體感染。Li等[20]應用mNGS檢測了20例肺部感染患者肺活檢組織中的病原微生物，證實mNGS檢測肺活檢組織較培養法和組織病理法在診斷時間和靈敏度上有明顯優勢，特別是苛養菌、真菌及結核分枝桿菌感染。侵入性取樣活檢是侵襲性真菌感染診斷金標準，在行肺組織病理檢查時，可同時送mNGS，為特殊病原體感染提供快速有價值的診療信息[21]。胸腔積液mNGS檢測臨床報道案例較少，可用于存在胸腔積液特別是膿胸的患者。
對于肺部感染性疾病，根據患者的不同情況，往往選取不同的臨床樣本行mNGS明確病原體，取材的一個重要原則是獲取感染部位的標本，在患者可耐受的情況下通過優選樣本類型（肺組織、BALF>氣管抽吸物>痰液>咽拭子）提高呼吸道病原學檢出率，臨床醫生通常將BALF作為mNGS用于肺部感染性疾病診斷中的最佳標本。當前對于不同標本mNGS檢測在不同肺部感染性疾病中的研究都為小樣本研究，尚需要大樣本臨床研究進一步證明。
2.2 mNGS在不同病原體所致肺部感染中的應用
2.2.1 mNGS在肺分枝桿菌感染診斷中的應用
結核病是全球十大死亡原因之一。盡管已有有效的治療方案，但仍面臨著快速和可靠診斷的問題。由于肺結核的非特異性癥狀和體征常與常見肺部感染重疊，可能會延遲肺結核的診斷，增加肺結核相關死亡。臨床迫切需要快速和無假設的診斷方法，以便在診斷過程的早期階段準確區分肺結核和其他常見肺部感染。目前，利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術（GeneXpert MTB/RIF，以下簡稱Xpert）已被世界衛生組織認可為結核疑似患者的初步診斷方法。Shi等[17]對比培養、抗酸染色、Xpert等臨床檢測方法，證實mNGS對BALF樣本結核診斷的敏感性為47.9%，與Xpert（45.8%）和培養（46.8%）相似，但遠高于抗酸染色（29.2%），研究還發現mNGS對于肺結核患者的混合感染（如合并真菌、細菌）較常規檢測手段具有明顯優勢。上海復旦大學的大樣本研究中所分離的257種微生物中，結核分枝桿菌（53/257）是最常見的病原體，mNGS檢測結核分枝桿菌的陽性率顯著高于培養[19]。目前國內多個研究顯示BALF mNGS的敏感性優于傳統培養法和抗酸染色，而與Xpert法相似，這可能與分枝桿菌的細胞壁非常堅硬、難以破壁有關。因此，若懷疑分支桿菌感染時，可采取常規方法以外的破壁方法，即使在檢測報告中序列數較低，也應該考慮致病微生物的可能。mNGS檢測在時效性及合并感染時也明顯優于其他檢測方法，將mNGS與培養或Xpert法相結合在結核病的臨床診斷中具有較好的價值[17, 22]。
近年來，NTM的發病率逐年增高，由于該病的臨床特征與肺結核相似，菌種的培養需要特殊的培養基、特定的培養溫度以及延長培養時間，常導致誤診和漏診，延誤治療，嚴重威脅人類生命和健康。mNGS可以實現NTM菌種的快速鑒定[23]，為NTM肺病提供及時精準的診療指導。但由于NTM廣泛存在于環境中，特別是有水的環境，故mNGS檢測NTM陽性結果的解釋應慎重，需要排除污染的可能。
2.2.2 mNGS在下呼吸道病毒感染中的應用
既往常規病毒診斷是基于PCR技術，可檢測病原體的種類非常有限，容易遺漏臨床不常見的、新的病毒[24]。近年來，不斷的有報道通過mNGS技術發現罕見甚至新發病原體，如人類鼻病毒B91感染肺部[25]、新型冠狀病毒肺炎等。目前為止，已有研究利用宏基用組學研究兒童急性呼吸道病毒感染的全面圖譜，有助于呼吸道疾病的檢測和預防[26]。van Rijn等[27]分析了成人慢阻肺急性加重患者的病毒感染，發現與PCR相比，mNGS診斷的敏感性和特異性分別為96%和98%（23/24和1093/1120），證實了mNGS對呼吸道病毒的半定量檢測具有高靈敏度和特異性，且mNGS較高的陰性預測值有助于排除致病性呼吸道病毒感染，從而協助臨床決策。也有研究報道mNGS對常見呼吸道病毒診斷的敏感性低于PCR[24]，這可能與mNGS檢測的內部程序流程有關。對于高度懷疑病毒性肺炎且病情持續進展的患者，mNGS可為臨床診療進一步提供有利線索。
2.2.3 mNGS在肺部真菌及非典型病原體感染中的應用
目前mNGS在肺部真菌及非典型病原體的研究往往為個案報道或混合感染，臨床常規檢測手段檢測不出多種苛養菌和特殊病原體，而mNGS協助臨床對耶氏肺孢子菌[28-29]、尖端賽多孢子菌[30]、曲霉[31-32]、鸚鵡熱衣原體[33-34]、嗜肺軍團菌[35]感染肺部的診斷，最終通過更改治療方案協助臨床治療。Hong等[21]在9例患者應用mNGS檢測血標本有助于明確不能獲取活檢病理的疑似侵襲性真菌感染患者的診斷。
上海復旦大學附屬中山醫院的關于mNGS應用于感染性疾病的診斷性能的大樣本研究中，呼吸系統感染占感染性疾病73.5%（255/347），研究得出mNGS診斷感染性疾病的敏感性和特異性分別為50.7%和85.7%，優于培養法，尤其是結核分枝桿菌、厭氧菌和真菌，且受先前抗菌藥物暴露的影響較小[19]。要而言之，mNGS在結核、病毒、真菌、非典型病原體感染中是一種非常有效的廣譜病原體篩查方法，病原體的快速明確避免了臨床治療不必要的彎路。
2.3 mNGS的臨床適應證
對于免疫缺陷患者，肺炎是其發病和死亡的主要原因之一，早期發現病原菌予適當的抗菌治療和改善臨床結果至關重要。Pan等[11]報道了mNGS對免疫缺陷社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia，CAP）患者微生物學診斷中的應用，研究表明mNGS技術在檢測條件致病菌和混合感染方面具有顯著優勢。在一項mNGS用于免疫低下重癥社區獲得性肺炎（severe community acquired pneumonia，SCAP）的研究中[36]，與免疫正常組相比，免疫低下組更易合并感染，mNGS是檢測免疫缺陷SCAP患者混合感染和個體化抗菌藥物治療的有用技術。有研究對108例接受皮質激素治療的疑似感染患者的樣本同時進行mNGS檢測與常規微生物檢測，基于mNGS檢測結果調整抗菌藥物方案的患者治療成功率（81.8%）顯著高于經驗性使用抗菌藥物的患者（52.6%），且mNGS檢測結果不受免疫抑制程度影響，為免疫抑制患者的抗菌藥物治療提供了有價值的信息[37]。
2020年我國一項多中心329例關于BALF mNGS在成人SCAP的價值研究顯示，mNGS相對于常規檢測的高檢出率有助于SCAP致病菌的早期識別，還可用于分析SCAP的致病菌分布情況[38]。Xie等[39]回顧性研究發現使用mNGS與降低重癥患者病死率獨立相關（16.67%比42.3%）。mNGS是明確重癥肺炎引起急性呼吸窘迫綜合征病因學、提高診斷準確性和預后的有價值的工具[40]。Fang等[41]在BALF mNGS對呼吸機相關肺炎的診斷價值研究中發現，使用BALF檢測mNGS可提高呼吸機相關肺炎患者細菌鑒定的敏感性和特異性, 在檢測病毒和識別混合感染方面顯示出明顯的優勢。以上研究表明，mNGS在重癥肺炎、免疫缺陷患者的肺部感染及呼吸機相關肺炎等肺部感染性疾病中的應用可明顯提高感染性疾病病原體的早期診斷。Qian等[24]研究了100例肺部感染患者呼吸道標本mNGS對肺部感染的診斷價值，提出將mNGS作為傳統方法的補充，有助于提高呼吸道感染病原體的檢出率，當懷疑有混合或罕見病原體感染時，免疫功能低下者和（或）病情嚴重需要緊急治療者，建議及時使用mNGS。
由于開展高通量測序的成本仍較高，尚不宜作為所有感染性疾病的常規檢測手段。國內專家共識中指出，mNGS的臨床適應證包括：臨床規范經驗抗感染治療無效且常規方法不能明確病原體；重癥感染或病情持續進展的感染；免疫受損患者發生的感染；慢性感染，或慢性疾病不除外感染等[42]。關于送檢mNGS的最佳時機，目前還需要進一步研究。
3 mNGS報告解讀
正確的解讀同樣是保證mNGS優勢的關鍵，臨床醫生解讀報告時必須明確序列數、相對豐度與鑒定置信度等重要參數的意義。陽性結果有助于明確感染病原體，陰性結果亦可用于排除感染性疾病。mNGS檢測結果需與臨床表現、傳統檢測及檢查結果相結合作出解讀，根據不同情況可分為以下幾種類型：（1）當mNGS檢測結果與患者臨床表現及相關實驗室結果相符合，可根據結果指導臨床抗感染決策。（2）當患者mNGS檢測結果陽性，且與臨床表現相吻合，但未獲得其他實驗室檢查結果證據支持，可進一步完善或重復傳統病原學檢測，并同時啟動治療。（3）當患者僅獲得mNGS陽性檢測結果，但與臨床表現和（或）其他實驗室檢查結果不相符，此時可行PCR檢測進一步驗證，同時結合患者臨床表現綜合分析，不能僅根據mNGS檢測結果進行病原學診斷。（4）當mNGS檢測結果陰性，而其他實驗室檢查結果為陽性，需結合患者臨床表現及其他輔助檢查綜合分析，若為假陰性，在必要情況下可考慮重復mNGS檢測；若為真陰性，則應停用抗菌藥物。
4 mNGS前景與挑戰
mNGS最大優勢在于快速精準、高通量檢測，為早期目標抗感染治療提供證據支持。另一個關鍵優勢是測序數據可以用于其他分析，例如微生物組特征分析，對特定病原體進行耐藥基因檢測和毒力因子分析[43]，輔助臨床耐藥菌的診斷及艱難梭菌的管理與治療，以及通過RNA測序對人類宿主的轉錄組分析。國內有研究根據肺部感染患者和非肺部感染患者有不同的免疫應答，可能有不同的免疫相關轉錄組，比較了從BALF獲得的宿主轉錄組，以尋找肺部感染患者的預測標志。分析顯示，肺部感染組HLA-DRB1顯著上調，而TRAV32、MIR4270、PSME2和GAPDH顯著下調，研究還分析比較了細菌和病毒肺部感染組、結核和非結核組的轉錄組，不同感染組差異表達基因不同，由此得出mNGS結合宿主轉錄組分析有望成為肺部感染臨床診斷的有力工具[44]。
2020年自然雜志的一篇文章介紹了應用納米孔宏基因組學快速診斷下呼吸道細菌感染的方法，即應用皂苷裂解宿主細胞可有效從臨床呼吸樣本中去除高達99.99%的宿主核酸，結合納米孔測序可在6 h內識別病原體和抗菌藥物耐藥性基因[7]，納米孔技術可以通過可擴展、便攜式和云兼容的管道以及添加引物富集原基因，實現快速的高分辨測序。盡管食品及藥物管理局已經為NGS感染性疾病檢測的臨床驗證提供了一般指南，但關于臨床實施mNGS檢測并沒有明確的建議，也沒有提到具體要求。目前提取平臺選擇、核酸提取方法、污染問題（包括樣品、周圍環境或分子生物學試劑），仍是診斷結果可靠性的巨大挑戰。感染性疾病是否有必要行mNGS檢測以及檢測的時機判定、不同標本類型的選擇尚缺乏高證據等級的臨床研究支持的統一標準，仍需要繼續研究。
隨著mNGS檢測技術的不斷發展，用于評估mNGS的臨床效用和成本效益的大樣本前瞻性臨床試驗數據將越來越多；mNGS的總成本和周轉時間將繼續下降；mNGS的其他優勢，如納入了人類宿主反應和微生物組數據，將不斷在臨床中發揮價值。綜上，mNGS可以實現病原體鑒定與相對定量，耐藥基因與毒力因子分析，宿主轉錄組學與免疫反應分析，從病原、藥物、宿主三個維度推動肺部感染精準醫學的發展，mNGS將成為肺部感染性疾病的有力工具。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。