基于誘導型一氧化氮合酶過表達及敲除小鼠研究阿托伐他汀改善慢性阻塞性肺疾病氣道功能的作用及機制_《中國呼吸與危重監護雜志》

作者：

任慧敏 ¹ ,  韓樹池 ¹ , 楊淼 ¹ , 王慧 ¹ , 劉宏強 ²

1. 河北北方學院附屬第一醫院急診科（河北張家口 075000）;
2. 河北北方學院附屬第一醫院超聲醫學科（河北張家口 075000）;

關鍵詞：

慢性阻塞性肺疾病阿托伐他汀誘導型一氧化氮合酶氣道功能炎癥反應

DOI：

10.7507/1671-6205.202202016

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目的研究阿托伐他汀通過抑制誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達改善慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）小鼠氣道功能的作用及機制。方法野生型（wild type，WT）小鼠隨機分為WT對照組、WT+慢阻肺組、WT+慢阻肺+阿托伐他汀組、陰性對照（negative control，NC）慢病毒組、NC慢病毒+慢阻肺組、NC慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組、iNOS慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組；肺組織特異性iNOS敲除（knock out，KO）小鼠隨機分為KO對照組、KO+慢阻肺組。采用香煙煙霧被動吸入的方法建立慢阻肺模型，給予阿托伐他汀（10 mg·kg^–1·d^–1）灌胃，NC慢病毒或iNOS慢病毒尾靜脈注射。檢測肺功能指標吸氣峰流速（peak inspiratory flow，PIF）和呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF），支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）中性粒細胞（neutrophils，N）、嗜酸性粒細胞（eosinophils，E）、淋巴細胞（lymphocyte，L）數目及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）含量，肺組織病理改變及iNOS、內皮型一氧化氮合酶（endothelium nitric oxide synthase，eNOS）、神經元型一氧化氮合酶（neural nitric oxide synthase，nNOS）的相對表達水平。結果與WT對照組比較，WT+慢阻肺組小鼠PIF、PEF降低，肺組織出現典型的慢阻肺病理改變，BALF中N、E、L數目及TNF-α、IL-1β含量、肺組織中iNOS、eNOS、nNOS的表達水平均增加（均P<0.05）；阿托伐他汀干預后，WT+慢阻肺+阿托伐他汀組小鼠PIF、PEF增加，肺組織慢阻肺的病理改變減輕，BALF中N、E、L數目及TNF-α、IL-1β含量、肺組織中iNOS的表達水平均降低（均P<0.05）；特異性敲除肺組織iNOS后，KO+慢阻肺組小鼠PIF、PEF降低，肺組織慢阻肺的病理改變減輕，BALF中N、E、L數目及TNF-α、IL-1β含量均降低（均P<0.05）；尾靜脈注射慢病毒過表達iNOS后，iNOS慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組小鼠PIF、PEF降低，肺組織慢阻肺的病理改變加重，BALF中N、E、L數目及TNF-α、IL-1β含量均增加（均P<0.05）。結論阿托伐他汀改善慢阻肺小鼠氣道功能及炎癥反應的作用與抑制iNOS的表達有關。

引用本文： 任慧敏, 韓樹池, 楊淼, 王慧, 劉宏強. 基于誘導型一氧化氮合酶過表達及敲除小鼠研究阿托伐他汀改善慢性阻塞性肺疾病氣道功能的作用及機制. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(5): 340-346. doi: 10.7507/1671-6205.202202016 復制

慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）以不完全可逆氣流受限、氣道炎癥反應激活為特征，早期治療、預防急性加重對改善預后、降低病死率具有重要意義^[1-2]。阿托伐他汀是臨床廣泛使用的降脂藥物，近些年其抗炎、改善氣道功能的作用受到關注。一項Meta研究發現阿托伐他汀對穩定期慢阻肺患者的氣道功能具有改善作用^[3]，動物實驗也證實阿托伐他汀對慢阻肺大鼠肺組織炎癥反應及肺血管重塑具有改善作用^[4-5]，但阿托伐他汀對慢阻肺動物氣道功能的改善作用缺乏直接證據，相關的分子機制也未完全闡明。有研究在博來霉素誘導肺纖維大鼠中證實阿托伐他汀改善氣道功能的作用與抑制誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達有關^[6]。iNOS屬于一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）家族，香煙煙霧吸入、缺氧等病理刺激可誘導iNOS的表達，高表達的iNOS具有激活氣道炎癥反應、引起或加重氣流受限的作用。Eapen等^[7]以iNOS作為M1型巨噬細胞標志物，在慢阻肺患者的氣道組織中檢測到iNOS陽性細胞數明顯增加，王慧等^[8]在慢阻肺患者膈肌中檢測到iNOS的表達水平明顯增加。基于此提出本研究的科學假說：iNOS表達增加與慢阻肺的發病有關，阿托伐他汀通過抑制iNOS表達改善慢阻肺的氣道功能。為了驗證這一假說，本研究對野生型（wild type，WT）小鼠和肺組織特異性iNOS敲除（knockout，KO）小鼠進行實驗，分析阿托伐他汀改善慢阻肺小鼠氣道功能的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

WT C57BL/6J小鼠來自上海西普爾–必凱實驗動物公司［許可證號：SCXK（滬）2018-0006］；肺特異性iNOS KO小鼠（遺傳背景C57BL/6J）來自上海南方模式生物科技公司。動物實驗中心使用許可證：SYXK（冀）2019-004。

1.1.2 試劑與儀器

玉溪香煙（紅塔煙草基團），焦油量10 mg、煙氣煙堿量0.9 mg、一氧化碳量10 mg、長度84 mm；阿托伐他汀鈣片（輝瑞制藥），陰性對照（negative control，NC）慢病毒、iNOS慢病毒（上海漢恒生物公司，病毒滴度2×10⁸ TU/mL），蘇木精–伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒（上海歌凡生物公司），瑞氏染色液（南京森貝伽生物公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的酶聯免疫吸附檢測試劑盒（上海酶聯公司），組織裂解液、蛋白定量檢測試劑盒（BCA法）（上海碧云天公司），iNOS、內皮型一氧化氮合酶（endothelium nitric oxide synthase，eNOS）、神經型一氧化氮合酶（neural nitric oxide synthase，nNOS）一抗（Abcam公司）。小動物肺功能儀（上海塔望智能科技公司），顯微鏡（Nikon公司），凝膠電泳及成像系統（上海天能公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及干預

動物分組及干預的實驗分為三部分。第一部分研究阿托伐他汀對慢阻肺的治療價值及對iNOS表達的影響。WT小鼠隨機分為WT對照組、WT+慢阻肺組、WT+慢阻肺+阿托伐他汀組，每組各8只。WT+慢阻肺組、WT+慢阻肺+阿托伐他汀組進行慢阻肺造模，方法如下：將小鼠放入40 cm×25 cm×20 cm的薰煙箱，每日上午2次、下午2次，每次持續45 min、1支香煙，上午2次及下午2次的間隔為10 min，每周一至周五進行煙霧吸入，連續進行12周。阿托伐他汀干預方法如下：造模第7周起，每天煙霧吸入前1 h給予阿托伐他汀灌胃，劑量參照 Zhu 等^[6]的研究選擇10 mg/kg、1次/d，連續6周。第二部分研究iNOS在慢阻肺發病中的作用。iNOS KO小鼠隨機分為KO對照組、KO+慢阻肺組，每組各8只。iNOS KO小鼠慢阻肺的造模方法與WT小鼠相同。第三部分研究iNOS在阿托伐他汀治療慢阻肺中的作用，WT小鼠隨機分為NC慢病毒組、NC慢病毒+慢阻肺組、NC慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組、iNOS慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組，每組各8只。造模方法及阿托伐他汀干預方法均同前，同時于造模第7周時給予慢病毒注射液50 μL尾靜脈注射。

1.2.2 氣道功能的檢測

末次給藥后24 h，采用小動物肺功能儀檢測吸氣峰流速（peak inspiratory flow，PIF）和呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）、第0.3秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in 0.3 second，FEV_0.3）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC），計算FEV_0.3/FVC。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液中炎癥細胞及炎癥因子的檢測

完成肺功能檢測后做頸部切開暴露氣管和主支氣管，結扎右主支氣管、5號針頭插入氣管并結扎固定，注入磷酸鹽緩沖液關系左側支氣管肺泡，每次0.6 mL、共3次。收集3次灌洗得到的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），2000 r/min離心10 min，收集沉淀并用0.1 mL磷酸鹽緩沖液重懸，采用瑞氏染色液染色后在顯微鏡下對中性粒細胞（neutrophils，N）、嗜酸性粒細胞（eosinophils，E）、淋巴細胞（lymphocyte，L）進行計數；收集上清并采用酶聯免疫吸附法檢測TNF-α、IL-1β的含量。

1.2.4 肺組織病理改變的檢測

完成BALF取材后處死小鼠，解剖肺組織適量，4%多聚甲醛固定后石蠟包埋并制作病理切片，采用HE染色試劑盒進行染色，在顯微鏡下觀察肺組織病理改變。

1.2.5 肺組織中iNOS、eNOS、nNOS相對表達水平的檢測

另取適量肺組織，液氮冷凍后加入組織裂解液進行勻漿，提取組織蛋白后采用BCA法測定蛋白濃度，根據測定結果取含有20 μg蛋白的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，而后電轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，1∶1000稀釋的一抗或1∶5000稀釋的β-actin一抗4 ℃孵育PVDF膜過夜。次日，1∶5000稀釋的HRP二抗室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像系統中對iNOS、eNOS、nNOS及β-actin的條帶進行顯影，根據條帶灰度值、以β-actin為內參計算iNOS、eNOS、nNOS的蛋白相對表達水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件錄入數據，實驗數據均為計量資料，經正態性檢驗及方差齊性檢驗，方差齊且符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，多組間的比較采用單因素方差分析，有統計學差異的資料進一步采用LSD-t法進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 WT小鼠和iNOS KO小鼠氣道功能及肺組織病理改變以及阿托伐他汀干預的影響

與WT對照組比較，WT+慢阻肺組小鼠的PIF、PEF水平均明顯降低（均P<0.05）；與WT+慢阻肺組比較，WT+慢阻肺+阿托伐他汀組小鼠的PIF、PEF水平均明顯增加（均P<0.05）；與WT對照組比較，KO對照組小鼠的PIF、PEF水平無明顯差異（均P>0.05）；與WT+慢阻肺組比較，KO+慢阻肺組小鼠的PIF、PEF水平均明顯增加（均P<0.05）。結果見表1。WT對照組小鼠肺組織內支氣管及肺泡結構規則，未見明顯炎癥細胞浸潤；WT+慢阻肺組小鼠肺組織內支氣管管腔及肺泡腔擴大；WT+慢阻肺+阿托伐他汀組小鼠肺組織的病理改變較WT+慢阻肺組減輕。結果見圖1。WT+慢阻肺組小鼠PIF、PEF的降低及肺組織的病理改變符合慢阻肺特征，表明慢阻肺造模成功。KO對照組小鼠肺組織內支氣管及肺泡結構規則，未見明顯炎癥細胞浸潤；KO+慢阻肺組小鼠肺組織的病理改變較WT+慢阻肺組減輕。

表1 WT小鼠和iNOS KO小鼠氣道功能的比較［n=8，（

）］

表選項

下載CSV

組別	PIF （L/min）	PEF （L/min）	FEV_0.3/ FVC（%）
WT 對照組	9.84±0.52	8.09±0.61	89.83±5.12
WT+慢阻肺組	6.33±0.49^*	4.55±0.39^*	66.91±5.77^*
WT+慢阻肺+ 阿托伐他汀組	8.51±0.67^#	6.67±0.57^#	81.03±4.24^#
KO 對照組	9.85±0.59	8.12±0.76	90.18±6.03
KO+慢阻肺組	8.81±0.51^#	7.09±0.78^#	81.31±7.63^#
與 WT 對照組比較，^*P<0.05；與 WT+慢阻肺組比較，^#P<0.05。

圖1 WT小鼠和iNOS KO小鼠肺組織病理改變的比較（HE染色×100）

a. WT對照組：肺組織內支氣管及肺泡結構規則，未見明顯炎癥細胞浸潤；b. WT+慢阻肺組：肺組織內支氣管管腔及肺泡腔擴大；c. WT+慢阻肺+阿托伐他汀組：肺組織的病理改變減輕；d. KO對照組：肺組織內支氣管及肺泡結構規則，未見明顯炎癥細胞浸潤；e. KO+慢阻肺組：肺組織的病理改變減輕。

圖選項

組別	炎癥細胞（×10⁶/L）			炎癥因子（ng/mL）
組別	N	E	L	TNF-α	IL-1β
WT 對照組	0.076±0.013	0.012±0.002	0.078±0.011	6.45±0.91	4.51±0.75
WT+慢阻肺組	0.281±0.041^*	0.118±0.015^*	0.209±0.028^*	15.09±2.33^*	11.36±1.83^*
WT+慢阻肺+阿托伐他汀組	0.124±0.019^#	0.073±0.012^#	0.094±0.013^#	9.94±1.32^#	7.59±1.04^#
KO 對照組	0.078±0.014	0.009±0.001	0.081±0.013	6.39±0.98	4.42±0.74
KO+慢阻肺組	0.109±0.013^#	0.055±0.008^#	0.107±0.014^#	9.17±1.25^#	7.31±1.19^#
與 WT 對照組比較，^*P<0.05；與 WT +慢阻肺組比較，^#P<0.05

組別	iNOS	eNOS	nNOS
WT 對照組	1.00±0.14	1.00±0.15	1.00±0.12
WT+慢阻肺組	2.29±0.35^*	1.84±0.25^*	1.73±0.19^*
WT+慢阻肺+ 阿托伐他汀組	1.22±0.21^#	1.81±0.29	1.68±0.22
與 WT 對照組比較，^*P<0.05；與 WT+慢阻肺組比較，^#P<0.05

組別	PIF（L/min）	PEF（L/min）	FEV_0.3/FVC（%）
NC 慢病毒組	9.91±0.61	8.13±0.64	89.45±5.09
NC 慢病毒+ 慢阻肺組	6.27±0.43^*	4.49±0.45^*	66.35±5.66^*
NC 慢病毒+慢阻肺+ 阿托伐他汀組	8.39±0.59^#	6.83±0.52^#	80.35±5.12^#
iNOS 慢病毒+慢阻肺+ 阿托伐他汀組	6.04±0.59^&	4.27±0.51^&	72.12±4.99^&
與 NC 慢病毒組比較，^*P<0.05；與 NC 慢病毒+慢阻肺組比較，^#P<0.05；與 NC 慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組比較，^&P<0.05。

組別	炎癥細胞(×10⁶/L)			炎癥因子(ng/mL)
組別	N	E	L	TNF-α	IL-1β
NC 慢病毒組	0.079±0.009	0.013±0.002	0.077±0.011	6.42±0.99	4.51±0.84
NC 慢病毒+慢阻肺組	0.269±0.032^*	0.130±0.017^*	0.204±0.029^*	14.09±2.34^*	11.09±1.77^*
NC 慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組	0.119±0.014^#	0.069±0.009^#	0.104±0.016^#	9.79±1.41^#	7.71±1.19^#
iNOS 慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組	0.284±0.039^&	0.138±0.020^&	0.210±0.034^&	14.94±2.46^&	11.57±2.03^&
與 NC 慢病毒組比較，^*P<0.05；與 NC 慢病毒+慢阻肺組比較，^#P<0.05；與 NC 慢病毒+慢阻肺+阿托伐他汀組比較，^&P<0.05。

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《中國呼吸與危重監護雜志》

基于誘導型一氧化氮合酶過表達及敲除小鼠研究阿托伐他汀改善慢性阻塞性肺疾病氣道功能的作用及機制

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