引用本文： 童霞, 張華, 彭玲, 張鑫, 張蘭蘭. 單細胞薈萃分析 SARS-CoV-2 感染后 T 淋巴細胞在各個器官中的功能差異. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(5): 330-339. doi: 10.7507/1671-6205.202201042 復制
新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19，簡稱新冠肺炎）患者血液中的 T 淋巴細胞的數量低于健康對照組，與無癥狀者相比，有癥狀的新冠肺炎患者淋巴細胞減少更為突出，與無肺炎表現的患者相比，有癥狀患者的淋巴細胞減少也更為突出[1-7]。與中度患者相比，重癥新冠肺炎患者 CD4+ T 和 CD8+ T 淋巴細胞數均進一步下降[8-13]。值得注意的是，較低的淋巴細胞計數被發現是嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染導致的死亡的臨床預測因素[9, 14]。在新冠肺炎老年患者中，血液中高數量的淋巴細胞預示更好的預后[15-17]。輸注攜帶高水平中和性抗體滴度的恢復期血漿后，新冠肺炎患者臨床癥狀明顯改善，前瞻性入組的嚴重新冠肺炎患者的淋巴細胞數量顯著增加[18]。研究表明，血管緊張素轉換酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是介導 SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 入胞的高親和力受體，而免疫細胞中始終沒有 ACE2 的表達[19-21]，這表明直接的病毒感染可能不是導致 T 淋巴細胞減少的原因，這值得進一步研究。此外，雖然這兩種冠狀病毒都有零星的病毒進入淋巴細胞的現象，但病毒似乎不能在這種細胞類型中復制，因此這種中止性感染的生物學意義并不確定[2, 22]。
對于新冠肺炎患者，是否每個器官中的 T 淋巴細胞具有相對特異的功能，目前仍然未知。在此，我們應用生物信息學方法，利用公共數據庫高通量基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）及單細胞技術的分析方法，分析了 SARS-CoV-2 感染患者各器官的 T 淋巴細胞在體內的功能差異。現將結果報告如下。
1 資料與方法
1.1 數據收集
單細胞轉錄組測序（single cell RNA sequencing，scRNA）/單細胞核轉錄組測序（single nucleus RNA sequencing，snRNA）測序數據來自 GEO（
1.2 單細胞測序數據分析流程
1.2.1 scRNA/snRNA 數據處理
使用函數 Read10X 將 CellRanger（10X Genomics）輸出文件讀入 Seurat。使用 Seurat 包（v4.0）分析 scRNA/snRNA 測序數據[27]，具體分析流程見網頁（
1.2.2 細胞簇注釋及數據可視化
使用已知細胞標記基因進行細胞類型注釋[31]，分為四個主要細胞群：EPCAM+（上皮細胞）、CLDN5+（內皮細胞）、PTPRC+（免疫細胞）和COL1A2+（間質細胞）。使用 Subset()提取出免疫細胞，然后使用文獻經典的 T 淋巴細胞標記基因（CD3E）標記 T 淋巴細胞，提取出 T 淋巴細胞。然后將來自 7 個器官的 T 淋巴細胞的細胞群體合并在一起，生成 1 個合并后的 Seurat 對象。使用 Seurat 函數 FindNeighbors 和 FindClusters 進行細胞聚類，UMAP 降維后生成最終的 Seurat 對象。UMAP 圖、小提琴圖、條形圖、熱圖及點狀圖由 Seurat 中的 R 包 ggplot2、pheatmap 構建。所有熱圖均基于聚類平均基因表達以考慮細胞間轉錄組隨機性，并且數據自動縮放以進行可視化。
1.2.3 尋找差異表達基因及 SARS-CoV-2 入侵基因選擇
使用FindMarkers函數尋找肺與其他不同器官T淋巴細胞類群的標記基因。FindAllMarkers 函數會自動尋找每個類群和其他每個類群之間的標記基因。根據文獻報道選擇 SARS-CoV-2 入侵基因[32]，檢索式為"ACE2", "BSG", "NRP1", "HSPA5", "AXL", "KREMEN1", "ASGL1", "HSPG2", "SLC35A1", "CLEC4D", "CD4", "SR-B1", "FURIN", "PCSK1", "PRSS1", "ST14", "CTSB", "CTSL", "TMPRSS2"，一方面提取上述入侵基因陽性的 T 淋巴細胞，比較不同器官 T 淋巴細胞中入侵基因陽性的細胞比例，一方面直接比較上述入侵基因在不同器官T淋巴細胞中 RNA 表達量。由于呼吸系統是 SARS-CoV-2 入侵的主要器官，肺的 T 淋巴細胞是感染病毒的首要 T 淋巴細胞[33]，設定肺的 T 淋巴細胞為參照物，比較常見干擾素基因 FOS、BST2、IFI27[34]的表達。
1.2.4 富集分析
使用基因本體論（gene ontology，GO）對差異表達基因進行富集分析（
1.3 統計學方法
所有計算或分析均使用 Prism 8 軟件包（GraphPad）或 R 語言進行。采用雙側 t 檢驗比較組間差異，所有數據均表示為平均值±標準誤差。P<0.05 為差異有統計學意義。使用 Wilcoxon 秩和統計檢驗對每個集群的差異表達基因進行分析。
2 結果
2.1 新冠肺炎患者多器官 T 淋巴細胞地圖構建
從所選的 GEO 數據庫中，獲取了新冠肺炎患者 16 個肝臟、19 個心臟、2 個脾臟、6 個大腦、58 個肺、21 個腎臟、5 個胰腺組織的 scRNA/snRNA 數據，同時利用 PTPRC、CD3E 標記基因并提取出 T 淋巴細胞，構建 T 淋巴細胞地圖，生成聚類分析 UMAP 圖，分為 13 個群（圖1a）。分析各器官的 T 淋巴細胞的高表達基因，總共發現 2517 個高變基因，包括胰腺 674 個、脾臟 15 個、肺 362 個、腎臟 468 個、心臟 288 個、腦 193 個、肝臟 517 個，其中最高的是胰腺（圖1b）。分析各器官的前 50 位高表達基因，可以看出胰腺和肺的共有基因較多（圖1c）。各器官中排列前 10 的高變基因分別為：腦，GFAP、LINGO1、MT?ND1、MT?ND2、SLC26A3、RASGEF1B、LINC00486、DHFR、MTRNR2L8、AC105402.3；肺，RPL41、CCL4、CCL4L2、RPS12、RPL34、RPLP1、RPS15A、RPL10、RPL39、RPS27；脾臟，INO80D、LINGO1、SLC26A3、RASGEF1B、DHFR、MTRNR2L8、IGHA1、FP671120.1、FP236383.1、MIB1；肝臟，PIP4K2A、CNOT6L、AC016831.7、KCNQ5、TOX、AUTS2、PLCB1、NCAM1、HDAC9、ADAMTS17；腎臟，MKL1、HSPH1、PLCG2、FP236383.1、FP671120.1、ABHD3、AC016831.7、KIAA1551、LINC00486、FNDC3B；胰腺，PRSS2、SST、REG1A、INS、CELA3A、CLPS、PRSS1、REG1B、GCG、TTR；心臟：MED13、TNRC6B、CMIP、RAPGEF1、TBC1D22A、BIRC6、AKAP13、MBD5、INPP5D、PPP6R3（圖1d）。
圖1
新冠肺炎患者不同器官的 T 淋巴細胞地圖、聚類分析及差異表達基因分析圖
a. 示意圖顯示了整個研究的分析工作流程。b. 新冠肺炎不同器官的 T 淋巴細胞差異表達基因個數。c. 每個器官 T 淋巴細胞的前 50 個標記基因表達的熱圖。紅色高表達；藍色低表達。d. 小提琴圖顯示了各器官中 T 淋巴細胞前 10 名高表達的基因以及這些基因在其余器官中的表達。
2.2 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴細胞異質性
在各個器官的 T 淋巴細胞中入侵基因 AXL、ASGL1、SR-B1、PRSS1、CTSB、TMPRSS2 陽性細胞比例為 0，入侵基因 ASGL1、SR-B1 RNA 未檢測到。不同器官的 T 淋巴細胞中其他入侵基因表達存在明顯的異質性，作為主要的入侵基因，ACE2 表達較低，表達最高者為腎臟（圖2a），肺和胰腺的表達量高于其他器官（圖2b）。對各個器官的 T 淋巴細胞功能 GO 富集分析顯示，不同器官 T 淋巴細胞亞群富集到的信號通路不同：肺主要涉及蛋白合成（圖2c），腎臟主要涉及表觀遺傳（圖2d），腦的 T 淋巴細胞主要富集細胞周期（圖2e），肝臟主要涉及到免疫反應（圖2f），胰腺與肺相似，主要跟蛋白合成相關（圖2g），心臟主要富集免疫應答（圖2h），脾臟的T淋巴細胞主要跟凋亡相關（圖2i）。
圖2
各個器官的 T 淋巴細胞中入侵基因以及高表達基因的富集分析
a. 不同器官 T 淋巴細胞 SARS-CoV-2 入侵基因陽性的細胞數比例。b. 點狀圖顯示入侵基因在各器官 T 淋巴細胞群的表達情況，肺和胰腺的表達量高于其他器官。c～i. GO 富集分析對每個器官差異基因進行富集分析，顯示不同器官 T 淋巴細胞亞群富集到的信號通路不同。紅框內顯示各臟器明顯富集的信號通路。其中肺明顯富集到了蛋白合成相關的信號通路（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis），腎臟明顯富集到了表觀遺傳相關的信號通路（histone modification），腦主要富集細胞周期（regulation of cell cycle G1/S phase transition，cell cycle G1/S phase transition），肝臟主要涉及到免疫反應（histone modification），胰腺主要跟蛋白合成相關（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis，ribosome assembly），心臟主要富集免疫應答（immune response-regulating signaling pathway，immune response-regulating cell surface receptor signaling pathway），而脾臟主要跟凋亡相關（negative regulation of execution phase of apoptosis）
2.3 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴細胞相關性
對各個器官 T 淋巴細胞相關性的分析顯示，心肝腎的相關性大（圖3a），利用維恩圖驗證各個器官的富集信號通路的相關性，篩選出了細胞間交互的基因（圖3b）。通過 GO 富集分析，心臟與肝臟交互的基因主要集中在免疫應答，肝臟與腎臟交互的基因主要集中在表觀遺傳；肝臟與腦交互的基因主要激活 wnt 信號通路；心臟、腦、肝臟與腎臟交互的基因主要集中在肽的修飾；心臟、肝臟與腎臟交互的基因主要集中在細胞周期；腦、腎臟與肝臟交互的基因主要集中在能量代謝；肺與胰腺交互的基因主要集中在蛋白質合成；腦與腎臟交互的基因主要集中在 cAMP 合成（圖3c）。
圖3
新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴細胞相關性
a. 熱圖顯示每個器官 T 淋巴細胞亞群中基因表達的相關性分析，提示心肝腎的相關性大（色階：紅色，相關性最高； 藍色，相關性最低）。b. 維恩圖顯示在不同器官 T 淋巴細胞上調的基因。圖表下方的黑色連接點表示相交的組織簇，縱軸代表交互的基因數目，橫軸每個器官的基因數目。c. GO 富集分析對不同器官共同表達的差異基因進行富集分析（色階：紅色，
2.4 肺是感染新冠肺炎后應答干擾素的獨特器官
與肺比較，其余器官的 T 淋巴細胞的干擾素信號通路降低，說明肺是一個在感染新冠肺炎后應答干擾素的獨特器官（圖4a～f）。常見干擾素基因中 FOS 在肺組織明顯高表達，BST2在胰腺組織明顯高表達（圖4g）。
圖4
與干擾素相關的基因在肺與其他器官中 T 淋巴細胞的表達差異
a～f. 分析新冠肺炎患者其他器官組織與肺組織 T 淋巴細胞亞群中的差異基因，火山圖顯示心臟、肝臟、腦、脾臟、胰腺、腎臟組織與肺組織相比上調及下調基因（紅色是上調顯著的基因，綠色是下調顯著的基因）。GSEA 對差異基因進行富集分析，顯示相對于其他器官組織，肺組織 T 淋巴細胞群明顯富集到干擾素相關信號通路（NES：富集通路得分的統計量，為正，表示通路基因集富集在排序序列前方；為負，表示某一功能基因集富集在排序序列后方。Norminal
2.5 代謝基因在不同器官間 T 淋巴細胞異質性
再次設定肺的 T 淋巴細胞為對照，腦的脂肪酸合成信號通路下降（圖5a）；肝臟的脂肪酸合成和氨基酸的轉運下調（圖5b）；心臟的脂肪酸合成增加與脂肪酸的結合下調（圖5c）；腎臟的脂肪酸轉運降低與糖的轉運增強（圖5d）；胰腺的氨基酸合成增加與脂肪酶下降（圖5e）；脾臟的碳水化合物以及脂肪下調（圖5f）。
圖5
代謝基因在肺與其他器官中 T 淋巴細胞的表達差異
a. 肺組織與腦組織 T 淋巴細胞差異基因富集到脂肪酸代謝；b. 肺組織與肝組織 T 淋巴細胞差異基因富集到脂肪酸、氨基酸代謝；c. 心臟組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，心臟組織明顯富集到脂質代謝過程，肺組織富集到了脂肪酸代謝過程；d. 腎臟組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，腎臟組織明顯富集到了脂肪酸代謝，肺組織富集到了糖代謝；e. 胰腺組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，胰腺組織明顯富集到了氨基酸及糖代謝過程，肺組織富集到了脂代謝；f. 脾臟組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，肺組織富集到了碳水化合物及脂質代謝。
3 討論
本研究應用生物信息學方法，利用單細胞薈萃方法，通過挖掘公開發表在 GEO 數據庫的基因數據集，提取常見的各個器官的T淋巴細胞，在單細胞層面揭示了各個器官 T 淋巴細胞的功能異質性。同時發現干擾素信號通路在肺的 T 淋巴細胞高表達，且對脂肪酸的結合起主要調控作用。
既往研究發現 SARS-CoV-2 感染患者普遍存在體液免疫反應，并且抗 SARS-CoV-2 IgG 滴度的多少與循環病毒特異性 CD4+ 和CD8+ T 淋巴細胞的廣度密切相關[12, 36-37]。一項研究報告了一組具有干細胞樣記憶表型的多功能 SARS-CoV-2 特異性 T 淋巴細胞群，具有這些 T 淋巴細胞群的個體為無癥狀和輕度新冠肺炎者[38]；這表明在沒有抗體的情況下，強大而廣泛的 T 淋巴細胞反應可能足以提供針對 SARS-CoV-2 的免疫保護[10, 12, 39-43]。因此，在新冠肺炎進展的臨床過程中，T 淋巴細胞與抗體反應之間的有效合作可能代表了候選疫苗設計的關鍵[12-13, 36, 42, 44-47]。
在嚴重的新冠肺炎病例中，包括免疫細胞病變在內的免疫失衡，其分子機制尚未得到解釋[48]。有文獻分析了 SARS-CoV-2 宿主細胞進入受體 ACE2 和進入相關蛋白酶（TMPRSS2、CTSL和FURIN）在免疫系統中的轉錄組和蛋白組表達數據，發現免疫細胞中沒有檢測到ACE2，但觀察到TMPRSS2、CTSL和FURIN有不同的轉錄組和蛋白質組表達[49]。SARS-CoV-2 宿主細胞進入受體ACE2在免疫系統成分或血系細胞中無法檢測到表達，表明它在新冠肺炎中并不能介導免疫細胞病變[50]。我們的分析結果也表明，多個器官的 T 淋巴細胞中 ACE2 的表達非常低，但是肺與胰腺的其他入侵基因表達量相對較高（圖2）。
文獻提示 Ⅰ 型干擾素、絲裂原激活蛋白激酶和鐵蛋白酶途徑在疾病活動時被激活，在患者病情改善后逐漸恢復[34]。新冠肺炎患者的干擾素信號在淋巴細胞中升高，但在單核細胞中減弱[51]。再次提示 T 淋巴細胞在發病過程中的重要作用。對新冠肺炎患者的 CD4+ T 淋巴細胞的分析顯示，住院治療與細胞毒性濾泡輔助細胞和細胞毒性 T 輔助細胞的增加有關，而調節性 T 淋巴細胞則減少[10]。我們的分析結果表明，相對于其他器官，干擾素信號通路在肺部的 T 淋巴細胞中的表達增高（圖4）。這有可能是肺作為響應 SARS-CoV-2 的主要器官，刺激應答干擾素而致。其他器官因為遠離肺部，其 T 淋巴細胞的活化并不明顯。
T 淋巴細胞在初始激活、增殖、或處于幼稚狀態或靜止、記憶狀態時，有不同的能量和合成代謝需求。因此，生物能量是 T 淋巴細胞在健康和疾病中做出充分免疫反應的關鍵[52]。文獻報道，T 淋巴細胞、單核細胞和粒細胞表現出線粒體質量增加，但只有 T 淋巴細胞積累了細胞內活性氧，代謝靜止，并表現出線粒體結構的破壞，而在恢復過程中，T 淋巴細胞的活性氧下降到與未感染的對照組一致[52]。在轉錄方面，來自危重新冠肺炎患者的 T 淋巴細胞顯示出對活性氧反應基因、以及與線粒體功能和 basigin 網絡相關的基因的誘導[53]。提示 T 淋巴細胞代謝在疾病中的重要作用。該文獻還報道，在沒有癥狀或癥狀輕微的新冠肺炎患者中檢測到 T 淋巴細胞脂肪酸攝取量明顯增加[53]。我們利用肺 T 淋巴細胞作為參照，比較其他器官與肺在代謝途徑方面的差異，結果也提示肺部對脂肪酸的結合表達高。
綜上所述，本研究結果表明 T 淋巴細胞在新冠肺炎患者各個器官中的特殊異質性。研究提示了肺的 T 淋巴細胞獨特的干擾素活化以及脂肪酸結合的特征，并導致新冠肺炎患者的代謝功能紊亂，下一步應該利用循環血液的 T 淋巴細胞的亞群進一步鑒定血液中干擾素活化的 T 淋巴細胞是否主要來源于肺部，還應解決其他專門針對 T 淋巴細胞代謝的藥物是否能改善新冠肺炎重癥患者的預后。本研究加強了在新冠肺炎中代謝的證據。由于代謝對免疫嚴重失調的T淋巴細胞具有特異性，它可能作為新冠肺炎治療的靶標。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19，簡稱新冠肺炎）患者血液中的 T 淋巴細胞的數量低于健康對照組，與無癥狀者相比，有癥狀的新冠肺炎患者淋巴細胞減少更為突出，與無肺炎表現的患者相比，有癥狀患者的淋巴細胞減少也更為突出[1-7]。與中度患者相比，重癥新冠肺炎患者 CD4+ T 和 CD8+ T 淋巴細胞數均進一步下降[8-13]。值得注意的是，較低的淋巴細胞計數被發現是嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒 2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染導致的死亡的臨床預測因素[9, 14]。在新冠肺炎老年患者中，血液中高數量的淋巴細胞預示更好的預后[15-17]。輸注攜帶高水平中和性抗體滴度的恢復期血漿后，新冠肺炎患者臨床癥狀明顯改善，前瞻性入組的嚴重新冠肺炎患者的淋巴細胞數量顯著增加[18]。研究表明，血管緊張素轉換酶 2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）是介導 SARS-CoV-1 和 SARS-CoV-2 入胞的高親和力受體，而免疫細胞中始終沒有 ACE2 的表達[19-21]，這表明直接的病毒感染可能不是導致 T 淋巴細胞減少的原因，這值得進一步研究。此外，雖然這兩種冠狀病毒都有零星的病毒進入淋巴細胞的現象，但病毒似乎不能在這種細胞類型中復制，因此這種中止性感染的生物學意義并不確定[2, 22]。
對于新冠肺炎患者，是否每個器官中的 T 淋巴細胞具有相對特異的功能，目前仍然未知。在此，我們應用生物信息學方法，利用公共數據庫高通量基因表達數據庫（gene expression omnibus，GEO）及單細胞技術的分析方法，分析了 SARS-CoV-2 感染患者各器官的 T 淋巴細胞在體內的功能差異。現將結果報告如下。
1 資料與方法
1.1 數據收集
單細胞轉錄組測序（single cell RNA sequencing，scRNA）/單細胞核轉錄組測序（single nucleus RNA sequencing，snRNA）測序數據來自 GEO（
1.2 單細胞測序數據分析流程
1.2.1 scRNA/snRNA 數據處理
使用函數 Read10X 將 CellRanger（10X Genomics）輸出文件讀入 Seurat。使用 Seurat 包（v4.0）分析 scRNA/snRNA 測序數據[27]，具體分析流程見網頁（
1.2.2 細胞簇注釋及數據可視化
使用已知細胞標記基因進行細胞類型注釋[31]，分為四個主要細胞群：EPCAM+（上皮細胞）、CLDN5+（內皮細胞）、PTPRC+（免疫細胞）和COL1A2+（間質細胞）。使用 Subset()提取出免疫細胞，然后使用文獻經典的 T 淋巴細胞標記基因（CD3E）標記 T 淋巴細胞，提取出 T 淋巴細胞。然后將來自 7 個器官的 T 淋巴細胞的細胞群體合并在一起，生成 1 個合并后的 Seurat 對象。使用 Seurat 函數 FindNeighbors 和 FindClusters 進行細胞聚類，UMAP 降維后生成最終的 Seurat 對象。UMAP 圖、小提琴圖、條形圖、熱圖及點狀圖由 Seurat 中的 R 包 ggplot2、pheatmap 構建。所有熱圖均基于聚類平均基因表達以考慮細胞間轉錄組隨機性，并且數據自動縮放以進行可視化。
1.2.3 尋找差異表達基因及 SARS-CoV-2 入侵基因選擇
使用FindMarkers函數尋找肺與其他不同器官T淋巴細胞類群的標記基因。FindAllMarkers 函數會自動尋找每個類群和其他每個類群之間的標記基因。根據文獻報道選擇 SARS-CoV-2 入侵基因[32]，檢索式為"ACE2", "BSG", "NRP1", "HSPA5", "AXL", "KREMEN1", "ASGL1", "HSPG2", "SLC35A1", "CLEC4D", "CD4", "SR-B1", "FURIN", "PCSK1", "PRSS1", "ST14", "CTSB", "CTSL", "TMPRSS2"，一方面提取上述入侵基因陽性的 T 淋巴細胞，比較不同器官 T 淋巴細胞中入侵基因陽性的細胞比例，一方面直接比較上述入侵基因在不同器官T淋巴細胞中 RNA 表達量。由于呼吸系統是 SARS-CoV-2 入侵的主要器官，肺的 T 淋巴細胞是感染病毒的首要 T 淋巴細胞[33]，設定肺的 T 淋巴細胞為參照物，比較常見干擾素基因 FOS、BST2、IFI27[34]的表達。
1.2.4 富集分析
使用基因本體論（gene ontology，GO）對差異表達基因進行富集分析（
1.3 統計學方法
所有計算或分析均使用 Prism 8 軟件包（GraphPad）或 R 語言進行。采用雙側 t 檢驗比較組間差異，所有數據均表示為平均值±標準誤差。P<0.05 為差異有統計學意義。使用 Wilcoxon 秩和統計檢驗對每個集群的差異表達基因進行分析。
2 結果
2.1 新冠肺炎患者多器官 T 淋巴細胞地圖構建
從所選的 GEO 數據庫中，獲取了新冠肺炎患者 16 個肝臟、19 個心臟、2 個脾臟、6 個大腦、58 個肺、21 個腎臟、5 個胰腺組織的 scRNA/snRNA 數據，同時利用 PTPRC、CD3E 標記基因并提取出 T 淋巴細胞，構建 T 淋巴細胞地圖，生成聚類分析 UMAP 圖，分為 13 個群（圖1a）。分析各器官的 T 淋巴細胞的高表達基因，總共發現 2517 個高變基因，包括胰腺 674 個、脾臟 15 個、肺 362 個、腎臟 468 個、心臟 288 個、腦 193 個、肝臟 517 個，其中最高的是胰腺（圖1b）。分析各器官的前 50 位高表達基因，可以看出胰腺和肺的共有基因較多（圖1c）。各器官中排列前 10 的高變基因分別為：腦，GFAP、LINGO1、MT?ND1、MT?ND2、SLC26A3、RASGEF1B、LINC00486、DHFR、MTRNR2L8、AC105402.3；肺，RPL41、CCL4、CCL4L2、RPS12、RPL34、RPLP1、RPS15A、RPL10、RPL39、RPS27；脾臟，INO80D、LINGO1、SLC26A3、RASGEF1B、DHFR、MTRNR2L8、IGHA1、FP671120.1、FP236383.1、MIB1；肝臟，PIP4K2A、CNOT6L、AC016831.7、KCNQ5、TOX、AUTS2、PLCB1、NCAM1、HDAC9、ADAMTS17；腎臟，MKL1、HSPH1、PLCG2、FP236383.1、FP671120.1、ABHD3、AC016831.7、KIAA1551、LINC00486、FNDC3B；胰腺，PRSS2、SST、REG1A、INS、CELA3A、CLPS、PRSS1、REG1B、GCG、TTR；心臟：MED13、TNRC6B、CMIP、RAPGEF1、TBC1D22A、BIRC6、AKAP13、MBD5、INPP5D、PPP6R3（圖1d）。
圖1
新冠肺炎患者不同器官的 T 淋巴細胞地圖、聚類分析及差異表達基因分析圖
a. 示意圖顯示了整個研究的分析工作流程。b. 新冠肺炎不同器官的 T 淋巴細胞差異表達基因個數。c. 每個器官 T 淋巴細胞的前 50 個標記基因表達的熱圖。紅色高表達；藍色低表達。d. 小提琴圖顯示了各器官中 T 淋巴細胞前 10 名高表達的基因以及這些基因在其余器官中的表達。
2.2 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴細胞異質性
在各個器官的 T 淋巴細胞中入侵基因 AXL、ASGL1、SR-B1、PRSS1、CTSB、TMPRSS2 陽性細胞比例為 0，入侵基因 ASGL1、SR-B1 RNA 未檢測到。不同器官的 T 淋巴細胞中其他入侵基因表達存在明顯的異質性，作為主要的入侵基因，ACE2 表達較低，表達最高者為腎臟（圖2a），肺和胰腺的表達量高于其他器官（圖2b）。對各個器官的 T 淋巴細胞功能 GO 富集分析顯示，不同器官 T 淋巴細胞亞群富集到的信號通路不同：肺主要涉及蛋白合成（圖2c），腎臟主要涉及表觀遺傳（圖2d），腦的 T 淋巴細胞主要富集細胞周期（圖2e），肝臟主要涉及到免疫反應（圖2f），胰腺與肺相似，主要跟蛋白合成相關（圖2g），心臟主要富集免疫應答（圖2h），脾臟的T淋巴細胞主要跟凋亡相關（圖2i）。
圖2
各個器官的 T 淋巴細胞中入侵基因以及高表達基因的富集分析
a. 不同器官 T 淋巴細胞 SARS-CoV-2 入侵基因陽性的細胞數比例。b. 點狀圖顯示入侵基因在各器官 T 淋巴細胞群的表達情況，肺和胰腺的表達量高于其他器官。c～i. GO 富集分析對每個器官差異基因進行富集分析，顯示不同器官 T 淋巴細胞亞群富集到的信號通路不同。紅框內顯示各臟器明顯富集的信號通路。其中肺明顯富集到了蛋白合成相關的信號通路（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis），腎臟明顯富集到了表觀遺傳相關的信號通路（histone modification），腦主要富集細胞周期（regulation of cell cycle G1/S phase transition，cell cycle G1/S phase transition），肝臟主要涉及到免疫反應（histone modification），胰腺主要跟蛋白合成相關（cytoplasmic translation，ribonucleoprotein complex biogenesis，ribosome assembly），心臟主要富集免疫應答（immune response-regulating signaling pathway，immune response-regulating cell surface receptor signaling pathway），而脾臟主要跟凋亡相關（negative regulation of execution phase of apoptosis）
2.3 新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴細胞相關性
對各個器官 T 淋巴細胞相關性的分析顯示，心肝腎的相關性大（圖3a），利用維恩圖驗證各個器官的富集信號通路的相關性，篩選出了細胞間交互的基因（圖3b）。通過 GO 富集分析，心臟與肝臟交互的基因主要集中在免疫應答，肝臟與腎臟交互的基因主要集中在表觀遺傳；肝臟與腦交互的基因主要激活 wnt 信號通路；心臟、腦、肝臟與腎臟交互的基因主要集中在肽的修飾；心臟、肝臟與腎臟交互的基因主要集中在細胞周期；腦、腎臟與肝臟交互的基因主要集中在能量代謝；肺與胰腺交互的基因主要集中在蛋白質合成；腦與腎臟交互的基因主要集中在 cAMP 合成（圖3c）。
圖3
新冠肺炎患者不同器官 T 淋巴細胞相關性
a. 熱圖顯示每個器官 T 淋巴細胞亞群中基因表達的相關性分析，提示心肝腎的相關性大（色階：紅色，相關性最高； 藍色，相關性最低）。b. 維恩圖顯示在不同器官 T 淋巴細胞上調的基因。圖表下方的黑色連接點表示相交的組織簇，縱軸代表交互的基因數目，橫軸每個器官的基因數目。c. GO 富集分析對不同器官共同表達的差異基因進行富集分析（色階：紅色，
2.4 肺是感染新冠肺炎后應答干擾素的獨特器官
與肺比較，其余器官的 T 淋巴細胞的干擾素信號通路降低，說明肺是一個在感染新冠肺炎后應答干擾素的獨特器官（圖4a～f）。常見干擾素基因中 FOS 在肺組織明顯高表達，BST2在胰腺組織明顯高表達（圖4g）。
圖4
與干擾素相關的基因在肺與其他器官中 T 淋巴細胞的表達差異
a～f. 分析新冠肺炎患者其他器官組織與肺組織 T 淋巴細胞亞群中的差異基因，火山圖顯示心臟、肝臟、腦、脾臟、胰腺、腎臟組織與肺組織相比上調及下調基因（紅色是上調顯著的基因，綠色是下調顯著的基因）。GSEA 對差異基因進行富集分析，顯示相對于其他器官組織，肺組織 T 淋巴細胞群明顯富集到干擾素相關信號通路（NES：富集通路得分的統計量，為正，表示通路基因集富集在排序序列前方；為負，表示某一功能基因集富集在排序序列后方。Norminal
2.5 代謝基因在不同器官間 T 淋巴細胞異質性
再次設定肺的 T 淋巴細胞為對照，腦的脂肪酸合成信號通路下降（圖5a）；肝臟的脂肪酸合成和氨基酸的轉運下調（圖5b）；心臟的脂肪酸合成增加與脂肪酸的結合下調（圖5c）；腎臟的脂肪酸轉運降低與糖的轉運增強（圖5d）；胰腺的氨基酸合成增加與脂肪酶下降（圖5e）；脾臟的碳水化合物以及脂肪下調（圖5f）。
圖5
代謝基因在肺與其他器官中 T 淋巴細胞的表達差異
a. 肺組織與腦組織 T 淋巴細胞差異基因富集到脂肪酸代謝；b. 肺組織與肝組織 T 淋巴細胞差異基因富集到脂肪酸、氨基酸代謝；c. 心臟組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，心臟組織明顯富集到脂質代謝過程，肺組織富集到了脂肪酸代謝過程；d. 腎臟組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，腎臟組織明顯富集到了脂肪酸代謝，肺組織富集到了糖代謝；e. 胰腺組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，胰腺組織明顯富集到了氨基酸及糖代謝過程，肺組織富集到了脂代謝；f. 脾臟組織與肺組織 T 淋巴細胞差異基因中，肺組織富集到了碳水化合物及脂質代謝。
3 討論
本研究應用生物信息學方法，利用單細胞薈萃方法，通過挖掘公開發表在 GEO 數據庫的基因數據集，提取常見的各個器官的T淋巴細胞，在單細胞層面揭示了各個器官 T 淋巴細胞的功能異質性。同時發現干擾素信號通路在肺的 T 淋巴細胞高表達，且對脂肪酸的結合起主要調控作用。
既往研究發現 SARS-CoV-2 感染患者普遍存在體液免疫反應，并且抗 SARS-CoV-2 IgG 滴度的多少與循環病毒特異性 CD4+ 和CD8+ T 淋巴細胞的廣度密切相關[12, 36-37]。一項研究報告了一組具有干細胞樣記憶表型的多功能 SARS-CoV-2 特異性 T 淋巴細胞群，具有這些 T 淋巴細胞群的個體為無癥狀和輕度新冠肺炎者[38]；這表明在沒有抗體的情況下，強大而廣泛的 T 淋巴細胞反應可能足以提供針對 SARS-CoV-2 的免疫保護[10, 12, 39-43]。因此，在新冠肺炎進展的臨床過程中，T 淋巴細胞與抗體反應之間的有效合作可能代表了候選疫苗設計的關鍵[12-13, 36, 42, 44-47]。
在嚴重的新冠肺炎病例中，包括免疫細胞病變在內的免疫失衡，其分子機制尚未得到解釋[48]。有文獻分析了 SARS-CoV-2 宿主細胞進入受體 ACE2 和進入相關蛋白酶（TMPRSS2、CTSL和FURIN）在免疫系統中的轉錄組和蛋白組表達數據，發現免疫細胞中沒有檢測到ACE2，但觀察到TMPRSS2、CTSL和FURIN有不同的轉錄組和蛋白質組表達[49]。SARS-CoV-2 宿主細胞進入受體ACE2在免疫系統成分或血系細胞中無法檢測到表達，表明它在新冠肺炎中并不能介導免疫細胞病變[50]。我們的分析結果也表明，多個器官的 T 淋巴細胞中 ACE2 的表達非常低，但是肺與胰腺的其他入侵基因表達量相對較高（圖2）。
文獻提示 Ⅰ 型干擾素、絲裂原激活蛋白激酶和鐵蛋白酶途徑在疾病活動時被激活，在患者病情改善后逐漸恢復[34]。新冠肺炎患者的干擾素信號在淋巴細胞中升高，但在單核細胞中減弱[51]。再次提示 T 淋巴細胞在發病過程中的重要作用。對新冠肺炎患者的 CD4+ T 淋巴細胞的分析顯示，住院治療與細胞毒性濾泡輔助細胞和細胞毒性 T 輔助細胞的增加有關，而調節性 T 淋巴細胞則減少[10]。我們的分析結果表明，相對于其他器官，干擾素信號通路在肺部的 T 淋巴細胞中的表達增高（圖4）。這有可能是肺作為響應 SARS-CoV-2 的主要器官，刺激應答干擾素而致。其他器官因為遠離肺部，其 T 淋巴細胞的活化并不明顯。
T 淋巴細胞在初始激活、增殖、或處于幼稚狀態或靜止、記憶狀態時，有不同的能量和合成代謝需求。因此，生物能量是 T 淋巴細胞在健康和疾病中做出充分免疫反應的關鍵[52]。文獻報道，T 淋巴細胞、單核細胞和粒細胞表現出線粒體質量增加，但只有 T 淋巴細胞積累了細胞內活性氧，代謝靜止，并表現出線粒體結構的破壞，而在恢復過程中，T 淋巴細胞的活性氧下降到與未感染的對照組一致[52]。在轉錄方面，來自危重新冠肺炎患者的 T 淋巴細胞顯示出對活性氧反應基因、以及與線粒體功能和 basigin 網絡相關的基因的誘導[53]。提示 T 淋巴細胞代謝在疾病中的重要作用。該文獻還報道，在沒有癥狀或癥狀輕微的新冠肺炎患者中檢測到 T 淋巴細胞脂肪酸攝取量明顯增加[53]。我們利用肺 T 淋巴細胞作為參照，比較其他器官與肺在代謝途徑方面的差異，結果也提示肺部對脂肪酸的結合表達高。
綜上所述，本研究結果表明 T 淋巴細胞在新冠肺炎患者各個器官中的特殊異質性。研究提示了肺的 T 淋巴細胞獨特的干擾素活化以及脂肪酸結合的特征，并導致新冠肺炎患者的代謝功能紊亂，下一步應該利用循環血液的 T 淋巴細胞的亞群進一步鑒定血液中干擾素活化的 T 淋巴細胞是否主要來源于肺部，還應解決其他專門針對 T 淋巴細胞代謝的藥物是否能改善新冠肺炎重癥患者的預后。本研究加強了在新冠肺炎中代謝的證據。由于代謝對免疫嚴重失調的T淋巴細胞具有特異性，它可能作為新冠肺炎治療的靶標。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
