引用本文： 朱星卓, 李益行, 趙恒, 劉博豪, 侯理仁, 張廣健. 呼氣分析技術在識別呼吸系統感染病原體中的研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(4): 292-296. doi: 10.7507/1671-6205.202201004 復制
呼吸系統感染在全球所有年齡組都有較高的發病率和病死率，據統計每年全球死于下呼吸道感染的人數超過 280 萬，是造成 5 歲以下兒童和 65 歲以上成人死亡的主要原因，帶來了巨大的醫療負擔[1]。臨床對于呼吸系統感染的治療通常根據患者的臨床表現和常規實驗室檢查結果作出診斷，針對呼吸系統危重癥通常在留取呼吸道分泌物標本后先行經驗性抗菌藥物治療，待病原學結果回報后再進行調整。但病原學診斷往往需要結合微生物培養、病理學檢查、分子生物學測序等方法，耗時較長且成本較高。早期、快速、精準、無創的檢查方法更有利于確定病原體，從而針對性地選擇抗菌藥物，控制耐藥同時避免因等待檢查結果而延誤治療時機。隨著代謝組學的發展，呼氣分析技術在臨床研究中的內容逐漸豐富。本文總結了近年來呼氣分析技術在呼吸系統感染領域的相關研究，表明呼氣分析技術有望成為一種快速、便捷、無創的病原學診斷方式。
1 呼吸系統感染病原體檢測方式
1.1 常規檢測方式
1.1.1 病原體分離培養
病原體的分離培養需利用痰液、血液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液等樣本進行，是目前臨床中確定病原體的“金標準”，也是目前臨床中常規的檢測方法。目前培養所需時間平均為 48 h 左右，若進行藥物敏感性檢測則會延遲 24～48 h[2]。不同種病原體報告陽性時間也不同，最快陽性檢出病原菌為大腸埃希菌，平均時間為 4.1 h。腸桿菌科細菌、革蘭陽性球菌、非發酵菌與念珠菌的陽性報警時間中位數分別為 11.8、20.6、19.7 和 33.1 h，檢測時間的差異可能造成延時或漏檢[3]。此外還存在部分病原體在醫院條件下難以培養、操作中樣本污染等問題，不能滿足臨床中快速、無創鑒別病原體的需要。
1.1.2 血清學檢測
血清學檢測方法能夠實現對特異性抗原、抗體的快速檢測，在肺炎支原體、肺炎衣原體、呼吸道合胞病毒等多種病原體檢測中具有診斷意義。然而，抗體檢測在感染早期可能沒有顯著變化，如肺炎支原體在初次感染后 1 周才出現特異性抗體 IgM 的升高，可能導致假陰性的結果，造成臨床診斷的滯后。血清學檢測的抗原檢測結果準確率較低[4]，僅適用于快速進行篩查。
1.1.3 宏基因組高通量測序技術
隨著分子生物學的不斷發展，宏基因組高通量測序技術（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）逐漸應用于臨床中，它能夠全面地提取樣本中的核酸進行測序，在排除人源性序列后同樣本庫數據進行對比，從而獲得病原體相關數據。除了能比對已知的病原體，mNGS 還能夠發現新的病原體，Ren等[5]利用基因測序技術對重癥肺炎患者進行檢測，發現了SARS-CoV-2。mNGS 技術能夠有效地檢測出罕見、混合感染的病原體，為臨床診療提供依據。然而該技術目前因測序成本高、核酸污染、專業性強等不足，限制了其在臨床中的應用[6]。
1.1.4 多重聚合酶鏈反應
多重聚合酶鏈反應（multiplex polymerase chain reaction，mPCR）是在常規聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）基礎上發展的一種 PCR 擴增技術，利用多對特異性引物在同一體系中進行擴增從而提高檢測效率，適合檢測培養周期長和體外難以培養的病原體。Subramony 等[7]發現在住院患者中進行mPCR檢測能夠有效減少抗生素、胸部X線和隔離措施的使用，節約了大量的醫療資源。但 PCR 檢測對樣本要求較高，極少量的外源性 DNA 污染就可能導致假陽性的結果，引物和目的基因序列選擇不當也可能降低其敏感性和特異性[8]。
1.1.5 環介導等溫擴增技術
環介導等溫核酸擴增技術（loop‐mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型等溫基因擴增方法[9]，具有快速、高效、簡便等優點，在病原體快速檢測領域具有較高價值。近年來相關研究不斷深入，將微流控技術與 LAMP 相結合運用于呼吸系統病原學診斷中[10]，進一步提高了檢測性能，降低了對儀器設備的依賴，具有很高的臨床應用價值。受限于 LAMP 技術本身的缺陷，核酸快速提取、引物設計和樣本污染仍是目前限制其臨床應用的主要因素。
1.2 呼氣檢測方式
1.2.1 氣相色譜-質譜聯用
氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）技術能夠實現對人體呼出氣中揮發性有機物定性、定量的測定，具有高敏感性和特異性，是目前進行分離、檢測、識別特定揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs）的首選方法，也是進行呼出氣分析最主要的方法之一，早期的相關研究均基于 GC-MS 技術開展[11-12]。Schnabel 等[13]利用氣相色譜高通量飛行時間質譜儀（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-tof-MS）技術對 100 例臨床懷疑有呼吸機相關性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）患者（32 例經支氣管肺泡灌洗確診為 VAP）的呼出氣進行分析，發現利用 12 種 VOCs 能夠有效區分確診患者和健康人群，準確率為（74.2±13.8）%。但 GC-tof-MS 技術對儀器設備要求較高，同時需要由專業人員進行操作，在臨床中具有一定的局限性。
1.2.2 激光光譜分析
隨著激光技術的不斷發展，激光光譜技術被用于呼出氣分析，相較質譜分析而言，具有高敏感性、高特異性、可實時在線分析等優點。王鑫等[14]基于可調諧激光吸收光譜技術實現對人體呼出 CO2 氣體無創、高效的檢測。Ciloglu 等[15]利用表面增強拉曼光譜結合深度學習實現對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的快速識別。然而，光譜儀器的成本較高且需要專業人員進行操作，限制了其在臨床診斷中的應用。
1.2.3 電子鼻
電子鼻是基于氣體傳感器構建的傳感器陣列，不同于以往呼氣檢測方法檢測出特定的 VOCs，電子鼻則將呼氣樣本當作一個整體進行分析。不同的傳感器能夠實現對特定氣體分子的特異性識別，從而形成特定的呼氣圖譜，構建出數據庫。此后可以將分析的樣本利用模式識別算法等與數據庫中呼氣圖譜進行比對，從而進行判斷。van de Goor 等[16]利用便攜式電子鼻結合人工神經網絡進行分析，能夠有效區別肺癌患者和健康人群，具有良好的敏感性和特異性。
2 呼氣分析技術用于識別病原體
2.1 病毒
病毒的復制繁殖完全依賴于被感染的細胞，可能不同于細菌、真菌自身代謝產生特異性揮發性有機物，主要結合機器學習等算法構建病毒的特異性指紋譜。Purcaro 等[17]對呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒進行體外培養，隨后利用全二維氣相色譜/飛行時間質譜對頂空氣體進行分析，將所有數據隨機分為訓練集和驗證集，結合隨機森林、線性支持向量機、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等機器學習算法用于識別最具有區分性的 VOCs 并進行預測分類，在區別甲型流感病毒感染和未感染樣本中，三種機器學習算法性能相當，受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）為 0.78～0.82；在判別呼吸道合胞病毒感染和未感染樣本中除了偏最小二乘判別分析 AUC 為 0.61 外，其余兩種算法AUC均在 0.80～0.84。Borras 等[18]利用液相色譜與四極飛行時間質譜聯用技術對呼出氣冷凝液進行分析，發現甲型流感病毒疫苗接種前后的呼出氣冷凝液中 VOCs 具有一定的差異性，靶向性分析發現 13-羥基-十八碳二烯酸能夠區分疫苗接種前后 VOCs 差異（P<0.05），但結合 PLS-DA 區分疫苗接種前、接種后 1 天、接種后 2 天、接種后 3 天時效果不佳，AUC<0.6，敏感性、特異性在 50% 左右；非靶向性分析分組效果更為顯著，AUC>0.9，敏感性、特異性均在 80% 以上。同時能夠有效區分呼吸道病毒檢測陰性和陽性患者，對特異性病毒感染有著良好的區分。
SARS-CoV-2主要的傳播方式為呼吸道傳播與密切接觸傳播，早期快速、準確的檢測技術更有利于及時發現傳染源。國內外相關學者已經開展了系列研究，證實了呼氣檢測技術在 SARS-CoV-2 檢測中具有潛力。我國要茂盛教授團隊已經將樣本采集、氣象色譜離子遷移譜檢測、機器學習模型整合，開發出了 SARS-CoV-2 的特異性“指紋圖譜”，能夠快速準確實現對 SARS-CoV-2 的檢測[19]。表1 總結了近年來的相關研究成果，表明呼氣分析技術在SARS-CoV-2 檢測中具有良好的性能，有望成為 SARS-CoV-2 的輔助診斷方法之一[20-26]。
表1
呼氣分析技術檢測 SARS-CoV-2 感染相關研究
2.2 細菌
細菌是引起呼吸系統感染最主要的病原體，尤其是重癥加強治療病房長期機械通氣的患者發生 VAP 的概率大大增加，早期、準確的檢測方式能夠指導臨床決策，減少廣譜抗菌藥物的使用，從而一定程度降低病死率和耐藥率。因此，呼氣分析技術不應只關注是否存在感染，也應該關注對不同病原菌的鑒別。銅綠假單胞菌是常見的引起呼吸系統感染的細菌，Kos 等[27]分析了 51 例囊性纖維化患者的呼出氣樣本（包括 25 例兒童呼出氣樣本），隨后建立 Logistics 回歸模型并通過留一法交叉驗證進行測試。結果顯示在成人樣本中沒有單獨 VOC 與銅綠假單胞菌感染存在顯著聯系，但在兒童呼出氣樣本中 2-丁酮（比值比 0.05，95% 可信區間 0.00～0.66）、乙酸乙酯（比值比 0.27，95% 可信區間 0.05～0.79）、2,4-二甲基庚烷（比值比 0.5，95% 可信區間 0.21～0.97）與其感染呈負相關。利用 5 種 VOCs 建立的多元回歸模型在成人取得較好性能，交叉驗證時準確率為 78.3%，能夠有效判別是否存在銅綠假單胞菌感染。Filipiak 等[28]利用 GC-MS 檢測肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的頂空氣，分別發現了 34、28 種VOCs，其中乙酸、乙醛、甲基丙烯酸甲酯、2,3-丁二酮、甲硫醇濃度大大提高，可能用于細菌感染的監測。大部分低分子量的碳氫化合物僅在肺炎鏈球菌培養物頂空氣中檢出，揮發性含硫化合物僅在流感嗜血桿菌頂空氣中檢出，可能成為鑒別的標志性 VOCs。Savelev 等[29]對銅綠假單胞菌感染患者痰液樣品頂空氣進行分析，發現 2-壬酮作為標志物可以達到 72% 敏感性和 88% 特異性，利用 17 種 VOCs 組合則能將敏感性提升至 91%，特異性提升至 88%。
Purcaro 等[30]體外培養囊性纖維化患者支氣管上皮細胞感染的銅綠假單胞菌，發現細胞培養與培養基培養的 VOCs 成分存在差異，表明 VOCs 成分的變化可能是細菌與細胞相互作用導致的。Karami 等[31]利用 GC-MS 技術對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌的頂空氣進行分析，發現部分 VOCs 在不同細菌培養頂空氣中均可檢出但存在濃度差異，不同的培養基也會導致檢出 VOCs 的差異。因此，在利用 VOCs 作為無創診斷指標前應當建立、評估一個更為完整的模式。隨著代謝組學的深入發展，利用呼氣分析技術診斷細菌感染的相關研究不斷深入，呼氣分析不再局限于選擇一種或幾種 VOCs 作為特異標志物進行靶向分析，逐步轉向利用建立病原體的“呼氣圖譜”，形成一定的 VOCs 組合，結合隨機森林等算法進行模式識別開展非靶向分析。
Boots 等[32]利用 GC-MS 對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌培養液的頂空氣進行分析，結合方差分析–主成分分析（analysis of variance-principal component analysis，ANOVA-PCA）發現利用 25 種 VOCs 可以對其進行一定的區分。van Oort 等[33]構建了大鼠感染肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌的模型，利用熱解吸–氣相色譜–質譜法（thermal desorption-gas chromatography-mass-spectrometry，TD-GC-MS）和選擇離子流動管質譜（selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）技術進行呼氣分析，結合稀疏偏最小二乘判別分析和留一法交叉驗證，最終分析數據顯示在區分感染與未感染大鼠時正確分組率能達到 94.6%；區分肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌感染大鼠時正確分組率為 99.9%。Zhu 等[34]在構建小鼠模型進行呼氣分析的同時培養了銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌進行頂空氣分析，發現體外培養的兩種細菌呼氣圖譜存在顯著差異。但對感染了相應菌株的小鼠呼出氣進行分析時發現其與體外培養圖譜只存在 25%～34% 的相同，說明相應菌株在機體內的代謝途徑發生了變化，不能單純依賴體外頂空氣分析獲得細菌的呼氣圖譜。
Nizio 等[35]開展相關研究，利用 GC×GC-TOF-MS 技術分析患者的呼出氣，發現雖然不能準確識別 6 種細菌，但的確存在特定的 VOCs 模式，提出后續的研究應當進一步擴大 VOCs 數據集以達到準確的識別和區分。Joensen 等[36]利用電子鼻結合主成分分析和判別分析，發現囊性纖維化患者感染銅綠假單胞菌和未感染銅綠假單胞菌的呼出氣之間存在顯著差異（P=0.044），AUC 達到 0.69（95% 可信區間 0.52～0.86），敏感性 71.4%，特異性 63.3%。John 等[37]利用 SIFT-MS 分析 31 例 PCR 陽性艱難梭菌患者及匹配的 PCR 陰性對照者的呼氣、血液、糞便樣本，發現的確存在特定的 VOCs 模式，利用 VOCs 模式區分兩組具有良好的準確度，AUC 分別為 0.93、0.91、0.86。鮑曼不動桿菌也是造成呼吸機相關性肺炎的常見細菌，Gao 等[38]分析了鮑曼不動桿菌定植組、感染組及陰性對照組人群的呼出氣樣本，結合 PCA 和 PLS-DA 發現利用 8 種 VOCs 組合能夠有效區分是否存在鮑曼不動桿菌（AUC=0.89），也能有效區分定植組和感染組（AUC=0.88）。歐洲已經開展了一項多中心研究以評價 VOCs 在 VAP 診斷中的性能[39]。
臨床中耐藥菌株的檢測較為困難，需要結合分子生物學、細菌培養等方法，可能會耽誤早期治療時機，Bean 等[40]建造小鼠肺炎模型，利用 SESI-MS 對小鼠肺感染模型呼出氣進行分析，發現在細菌接種后的24 h內，通過呼氣分析結果能準確識別耐甲氧西林和對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌，且在分析前不用進行預處理。Boots 等[32]也對兩種菌株頂空氣進行分析，發現其 VOCs 譜十分相似，但結合 ANOVA-PCA 進行分析，能夠達到 81% 準確率，一定程度上能夠將耐藥菌株區分出來。
2.3 真菌
Chambers 等[41]對曲霉培養液頂空氣進行分析，發現 2-戊基呋喃可能作為其生物標志物，但需要開展進一步的研究。de Heer 等[42]利用電子鼻對化療導致中性粒細胞減少癥患者的呼出氣檢測以判別是否有曲霉感染，準確率達到 90.9%，敏感性 100%，特異性 83.3%。隨后該研究團隊又采用相同的方法對囊性纖維化患者是否有煙曲霉定植進行檢測，準確率為 89%，敏感性 79%，特異性 94%。相關研究初步驗證了利用電子鼻技術能夠判斷是否有真菌感染。然而 Gerritsen 等[43]利用 GC-MS 技術進一步分析體內、體外的氣體樣本，發現體外檢出的 VOCs 在體內檢測不出。有關真菌的呼氣診斷還需要進一步開展相關實驗驗證，追溯 VOCs 代謝來源。
3 總結與展望
總體上看，呼氣分析技術仍有很大的潛力成為一種無創診斷呼吸系統感染的辦法。但目前呼氣分析技術在識別呼吸系統感染病原體領域還尚不成熟，對于許多的 VOCs 代謝過程還尚不清楚。主要受限于以下方面：（1）人體的代謝活動復雜，不同于體外單一菌群的培養，人體內菌群相互作用復雜，都可以表現在呼出氣中 VOCs，難以對致病菌作出判別。（2）相關的呼出氣分析裝置較為復雜，需要專業人員進行分析，便攜式的檢測設備尚不成熟。（3）部分研究樣本量較小，無法證明選取的 VOCs 能夠代表一類細菌的共性。后續的相關研究可能有以下趨勢：（1）從單一的VOC檢測轉向多種 VOCs 識別配對，不拘泥于單一 VOCs 的影響，逐漸形成組學概念。（2）更多的依賴人工智能技術的發展，結合多種機器學習算法對呼出氣組進行分析。（3）開展多中心驗證性研究，規范統一的采集、分析流程，進一步驗證呼氣分析的效能。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。
呼吸系統感染在全球所有年齡組都有較高的發病率和病死率，據統計每年全球死于下呼吸道感染的人數超過 280 萬，是造成 5 歲以下兒童和 65 歲以上成人死亡的主要原因，帶來了巨大的醫療負擔[1]。臨床對于呼吸系統感染的治療通常根據患者的臨床表現和常規實驗室檢查結果作出診斷，針對呼吸系統危重癥通常在留取呼吸道分泌物標本后先行經驗性抗菌藥物治療，待病原學結果回報后再進行調整。但病原學診斷往往需要結合微生物培養、病理學檢查、分子生物學測序等方法，耗時較長且成本較高。早期、快速、精準、無創的檢查方法更有利于確定病原體，從而針對性地選擇抗菌藥物，控制耐藥同時避免因等待檢查結果而延誤治療時機。隨著代謝組學的發展，呼氣分析技術在臨床研究中的內容逐漸豐富。本文總結了近年來呼氣分析技術在呼吸系統感染領域的相關研究，表明呼氣分析技術有望成為一種快速、便捷、無創的病原學診斷方式。
1 呼吸系統感染病原體檢測方式
1.1 常規檢測方式
1.1.1 病原體分離培養
病原體的分離培養需利用痰液、血液、胸腔積液、支氣管肺泡灌洗液等樣本進行，是目前臨床中確定病原體的“金標準”，也是目前臨床中常規的檢測方法。目前培養所需時間平均為 48 h 左右，若進行藥物敏感性檢測則會延遲 24～48 h[2]。不同種病原體報告陽性時間也不同，最快陽性檢出病原菌為大腸埃希菌，平均時間為 4.1 h。腸桿菌科細菌、革蘭陽性球菌、非發酵菌與念珠菌的陽性報警時間中位數分別為 11.8、20.6、19.7 和 33.1 h，檢測時間的差異可能造成延時或漏檢[3]。此外還存在部分病原體在醫院條件下難以培養、操作中樣本污染等問題，不能滿足臨床中快速、無創鑒別病原體的需要。
1.1.2 血清學檢測
血清學檢測方法能夠實現對特異性抗原、抗體的快速檢測，在肺炎支原體、肺炎衣原體、呼吸道合胞病毒等多種病原體檢測中具有診斷意義。然而，抗體檢測在感染早期可能沒有顯著變化，如肺炎支原體在初次感染后 1 周才出現特異性抗體 IgM 的升高，可能導致假陰性的結果，造成臨床診斷的滯后。血清學檢測的抗原檢測結果準確率較低[4]，僅適用于快速進行篩查。
1.1.3 宏基因組高通量測序技術
隨著分子生物學的不斷發展，宏基因組高通量測序技術（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）逐漸應用于臨床中，它能夠全面地提取樣本中的核酸進行測序，在排除人源性序列后同樣本庫數據進行對比，從而獲得病原體相關數據。除了能比對已知的病原體，mNGS 還能夠發現新的病原體，Ren等[5]利用基因測序技術對重癥肺炎患者進行檢測，發現了SARS-CoV-2。mNGS 技術能夠有效地檢測出罕見、混合感染的病原體，為臨床診療提供依據。然而該技術目前因測序成本高、核酸污染、專業性強等不足，限制了其在臨床中的應用[6]。
1.1.4 多重聚合酶鏈反應
多重聚合酶鏈反應（multiplex polymerase chain reaction，mPCR）是在常規聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）基礎上發展的一種 PCR 擴增技術，利用多對特異性引物在同一體系中進行擴增從而提高檢測效率，適合檢測培養周期長和體外難以培養的病原體。Subramony 等[7]發現在住院患者中進行mPCR檢測能夠有效減少抗生素、胸部X線和隔離措施的使用，節約了大量的醫療資源。但 PCR 檢測對樣本要求較高，極少量的外源性 DNA 污染就可能導致假陽性的結果，引物和目的基因序列選擇不當也可能降低其敏感性和特異性[8]。
1.1.5 環介導等溫擴增技術
環介導等溫核酸擴增技術（loop‐mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型等溫基因擴增方法[9]，具有快速、高效、簡便等優點，在病原體快速檢測領域具有較高價值。近年來相關研究不斷深入，將微流控技術與 LAMP 相結合運用于呼吸系統病原學診斷中[10]，進一步提高了檢測性能，降低了對儀器設備的依賴，具有很高的臨床應用價值。受限于 LAMP 技術本身的缺陷，核酸快速提取、引物設計和樣本污染仍是目前限制其臨床應用的主要因素。
1.2 呼氣檢測方式
1.2.1 氣相色譜-質譜聯用
氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）技術能夠實現對人體呼出氣中揮發性有機物定性、定量的測定，具有高敏感性和特異性，是目前進行分離、檢測、識別特定揮發性有機物（volatile organic compounds，VOCs）的首選方法，也是進行呼出氣分析最主要的方法之一，早期的相關研究均基于 GC-MS 技術開展[11-12]。Schnabel 等[13]利用氣相色譜高通量飛行時間質譜儀（gas chromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-tof-MS）技術對 100 例臨床懷疑有呼吸機相關性肺炎（ventilator-associated pneumonia，VAP）患者（32 例經支氣管肺泡灌洗確診為 VAP）的呼出氣進行分析，發現利用 12 種 VOCs 能夠有效區分確診患者和健康人群，準確率為（74.2±13.8）%。但 GC-tof-MS 技術對儀器設備要求較高，同時需要由專業人員進行操作，在臨床中具有一定的局限性。
1.2.2 激光光譜分析
隨著激光技術的不斷發展，激光光譜技術被用于呼出氣分析，相較質譜分析而言，具有高敏感性、高特異性、可實時在線分析等優點。王鑫等[14]基于可調諧激光吸收光譜技術實現對人體呼出 CO2 氣體無創、高效的檢測。Ciloglu 等[15]利用表面增強拉曼光譜結合深度學習實現對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的快速識別。然而，光譜儀器的成本較高且需要專業人員進行操作，限制了其在臨床診斷中的應用。
1.2.3 電子鼻
電子鼻是基于氣體傳感器構建的傳感器陣列，不同于以往呼氣檢測方法檢測出特定的 VOCs，電子鼻則將呼氣樣本當作一個整體進行分析。不同的傳感器能夠實現對特定氣體分子的特異性識別，從而形成特定的呼氣圖譜，構建出數據庫。此后可以將分析的樣本利用模式識別算法等與數據庫中呼氣圖譜進行比對，從而進行判斷。van de Goor 等[16]利用便攜式電子鼻結合人工神經網絡進行分析，能夠有效區別肺癌患者和健康人群，具有良好的敏感性和特異性。
2 呼氣分析技術用于識別病原體
2.1 病毒
病毒的復制繁殖完全依賴于被感染的細胞，可能不同于細菌、真菌自身代謝產生特異性揮發性有機物，主要結合機器學習等算法構建病毒的特異性指紋譜。Purcaro 等[17]對呼吸道合胞病毒和甲型流感病毒進行體外培養，隨后利用全二維氣相色譜/飛行時間質譜對頂空氣體進行分析，將所有數據隨機分為訓練集和驗證集，結合隨機森林、線性支持向量機、偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）等機器學習算法用于識別最具有區分性的 VOCs 并進行預測分類，在區別甲型流感病毒感染和未感染樣本中，三種機器學習算法性能相當，受試者操作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線下面積（area under the ROC curve，AUC）為 0.78～0.82；在判別呼吸道合胞病毒感染和未感染樣本中除了偏最小二乘判別分析 AUC 為 0.61 外，其余兩種算法AUC均在 0.80～0.84。Borras 等[18]利用液相色譜與四極飛行時間質譜聯用技術對呼出氣冷凝液進行分析，發現甲型流感病毒疫苗接種前后的呼出氣冷凝液中 VOCs 具有一定的差異性，靶向性分析發現 13-羥基-十八碳二烯酸能夠區分疫苗接種前后 VOCs 差異（P<0.05），但結合 PLS-DA 區分疫苗接種前、接種后 1 天、接種后 2 天、接種后 3 天時效果不佳，AUC<0.6，敏感性、特異性在 50% 左右；非靶向性分析分組效果更為顯著，AUC>0.9，敏感性、特異性均在 80% 以上。同時能夠有效區分呼吸道病毒檢測陰性和陽性患者，對特異性病毒感染有著良好的區分。
SARS-CoV-2主要的傳播方式為呼吸道傳播與密切接觸傳播，早期快速、準確的檢測技術更有利于及時發現傳染源。國內外相關學者已經開展了系列研究，證實了呼氣檢測技術在 SARS-CoV-2 檢測中具有潛力。我國要茂盛教授團隊已經將樣本采集、氣象色譜離子遷移譜檢測、機器學習模型整合，開發出了 SARS-CoV-2 的特異性“指紋圖譜”，能夠快速準確實現對 SARS-CoV-2 的檢測[19]。表1 總結了近年來的相關研究成果，表明呼氣分析技術在SARS-CoV-2 檢測中具有良好的性能，有望成為 SARS-CoV-2 的輔助診斷方法之一[20-26]。
表1
呼氣分析技術檢測 SARS-CoV-2 感染相關研究
2.2 細菌
細菌是引起呼吸系統感染最主要的病原體，尤其是重癥加強治療病房長期機械通氣的患者發生 VAP 的概率大大增加，早期、準確的檢測方式能夠指導臨床決策，減少廣譜抗菌藥物的使用，從而一定程度降低病死率和耐藥率。因此，呼氣分析技術不應只關注是否存在感染，也應該關注對不同病原菌的鑒別。銅綠假單胞菌是常見的引起呼吸系統感染的細菌，Kos 等[27]分析了 51 例囊性纖維化患者的呼出氣樣本（包括 25 例兒童呼出氣樣本），隨后建立 Logistics 回歸模型并通過留一法交叉驗證進行測試。結果顯示在成人樣本中沒有單獨 VOC 與銅綠假單胞菌感染存在顯著聯系，但在兒童呼出氣樣本中 2-丁酮（比值比 0.05，95% 可信區間 0.00～0.66）、乙酸乙酯（比值比 0.27，95% 可信區間 0.05～0.79）、2,4-二甲基庚烷（比值比 0.5，95% 可信區間 0.21～0.97）與其感染呈負相關。利用 5 種 VOCs 建立的多元回歸模型在成人取得較好性能，交叉驗證時準確率為 78.3%，能夠有效判別是否存在銅綠假單胞菌感染。Filipiak 等[28]利用 GC-MS 檢測肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的頂空氣，分別發現了 34、28 種VOCs，其中乙酸、乙醛、甲基丙烯酸甲酯、2,3-丁二酮、甲硫醇濃度大大提高，可能用于細菌感染的監測。大部分低分子量的碳氫化合物僅在肺炎鏈球菌培養物頂空氣中檢出，揮發性含硫化合物僅在流感嗜血桿菌頂空氣中檢出，可能成為鑒別的標志性 VOCs。Savelev 等[29]對銅綠假單胞菌感染患者痰液樣品頂空氣進行分析，發現 2-壬酮作為標志物可以達到 72% 敏感性和 88% 特異性，利用 17 種 VOCs 組合則能將敏感性提升至 91%，特異性提升至 88%。
Purcaro 等[30]體外培養囊性纖維化患者支氣管上皮細胞感染的銅綠假單胞菌，發現細胞培養與培養基培養的 VOCs 成分存在差異，表明 VOCs 成分的變化可能是細菌與細胞相互作用導致的。Karami 等[31]利用 GC-MS 技術對銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌的頂空氣進行分析，發現部分 VOCs 在不同細菌培養頂空氣中均可檢出但存在濃度差異，不同的培養基也會導致檢出 VOCs 的差異。因此，在利用 VOCs 作為無創診斷指標前應當建立、評估一個更為完整的模式。隨著代謝組學的深入發展，利用呼氣分析技術診斷細菌感染的相關研究不斷深入，呼氣分析不再局限于選擇一種或幾種 VOCs 作為特異標志物進行靶向分析，逐步轉向利用建立病原體的“呼氣圖譜”，形成一定的 VOCs 組合，結合隨機森林等算法進行模式識別開展非靶向分析。
Boots 等[32]利用 GC-MS 對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌培養液的頂空氣進行分析，結合方差分析–主成分分析（analysis of variance-principal component analysis，ANOVA-PCA）發現利用 25 種 VOCs 可以對其進行一定的區分。van Oort 等[33]構建了大鼠感染肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌的模型，利用熱解吸–氣相色譜–質譜法（thermal desorption-gas chromatography-mass-spectrometry，TD-GC-MS）和選擇離子流動管質譜（selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS）技術進行呼氣分析，結合稀疏偏最小二乘判別分析和留一法交叉驗證，最終分析數據顯示在區分感染與未感染大鼠時正確分組率能達到 94.6%；區分肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌感染大鼠時正確分組率為 99.9%。Zhu 等[34]在構建小鼠模型進行呼氣分析的同時培養了銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌進行頂空氣分析，發現體外培養的兩種細菌呼氣圖譜存在顯著差異。但對感染了相應菌株的小鼠呼出氣進行分析時發現其與體外培養圖譜只存在 25%～34% 的相同，說明相應菌株在機體內的代謝途徑發生了變化，不能單純依賴體外頂空氣分析獲得細菌的呼氣圖譜。
Nizio 等[35]開展相關研究，利用 GC×GC-TOF-MS 技術分析患者的呼出氣，發現雖然不能準確識別 6 種細菌，但的確存在特定的 VOCs 模式，提出后續的研究應當進一步擴大 VOCs 數據集以達到準確的識別和區分。Joensen 等[36]利用電子鼻結合主成分分析和判別分析，發現囊性纖維化患者感染銅綠假單胞菌和未感染銅綠假單胞菌的呼出氣之間存在顯著差異（P=0.044），AUC 達到 0.69（95% 可信區間 0.52～0.86），敏感性 71.4%，特異性 63.3%。John 等[37]利用 SIFT-MS 分析 31 例 PCR 陽性艱難梭菌患者及匹配的 PCR 陰性對照者的呼氣、血液、糞便樣本，發現的確存在特定的 VOCs 模式，利用 VOCs 模式區分兩組具有良好的準確度，AUC 分別為 0.93、0.91、0.86。鮑曼不動桿菌也是造成呼吸機相關性肺炎的常見細菌，Gao 等[38]分析了鮑曼不動桿菌定植組、感染組及陰性對照組人群的呼出氣樣本，結合 PCA 和 PLS-DA 發現利用 8 種 VOCs 組合能夠有效區分是否存在鮑曼不動桿菌（AUC=0.89），也能有效區分定植組和感染組（AUC=0.88）。歐洲已經開展了一項多中心研究以評價 VOCs 在 VAP 診斷中的性能[39]。
臨床中耐藥菌株的檢測較為困難，需要結合分子生物學、細菌培養等方法，可能會耽誤早期治療時機，Bean 等[40]建造小鼠肺炎模型，利用 SESI-MS 對小鼠肺感染模型呼出氣進行分析，發現在細菌接種后的24 h內，通過呼氣分析結果能準確識別耐甲氧西林和對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌，且在分析前不用進行預處理。Boots 等[32]也對兩種菌株頂空氣進行分析，發現其 VOCs 譜十分相似，但結合 ANOVA-PCA 進行分析，能夠達到 81% 準確率，一定程度上能夠將耐藥菌株區分出來。
2.3 真菌
Chambers 等[41]對曲霉培養液頂空氣進行分析，發現 2-戊基呋喃可能作為其生物標志物，但需要開展進一步的研究。de Heer 等[42]利用電子鼻對化療導致中性粒細胞減少癥患者的呼出氣檢測以判別是否有曲霉感染，準確率達到 90.9%，敏感性 100%，特異性 83.3%。隨后該研究團隊又采用相同的方法對囊性纖維化患者是否有煙曲霉定植進行檢測，準確率為 89%，敏感性 79%，特異性 94%。相關研究初步驗證了利用電子鼻技術能夠判斷是否有真菌感染。然而 Gerritsen 等[43]利用 GC-MS 技術進一步分析體內、體外的氣體樣本，發現體外檢出的 VOCs 在體內檢測不出。有關真菌的呼氣診斷還需要進一步開展相關實驗驗證，追溯 VOCs 代謝來源。
3 總結與展望
總體上看，呼氣分析技術仍有很大的潛力成為一種無創診斷呼吸系統感染的辦法。但目前呼氣分析技術在識別呼吸系統感染病原體領域還尚不成熟，對于許多的 VOCs 代謝過程還尚不清楚。主要受限于以下方面：（1）人體的代謝活動復雜，不同于體外單一菌群的培養，人體內菌群相互作用復雜，都可以表現在呼出氣中 VOCs，難以對致病菌作出判別。（2）相關的呼出氣分析裝置較為復雜，需要專業人員進行分析，便攜式的檢測設備尚不成熟。（3）部分研究樣本量較小，無法證明選取的 VOCs 能夠代表一類細菌的共性。后續的相關研究可能有以下趨勢：（1）從單一的VOC檢測轉向多種 VOCs 識別配對，不拘泥于單一 VOCs 的影響，逐漸形成組學概念。（2）更多的依賴人工智能技術的發展，結合多種機器學習算法對呼出氣組進行分析。（3）開展多中心驗證性研究，規范統一的采集、分析流程，進一步驗證呼氣分析的效能。
利益沖突：本文不涉及任何利益沖突。
