miR-27a調控PI3K/AKT通路介導的自噬途徑減輕脂多糖誘導的人肺腺癌細胞A549凋亡_《中國呼吸與危重監護雜志》

作者：

朱錦琪 ¹ , 陳劍波 ¹ , 楊紅忠 ¹ ,  高欣 ²

1. 南華大學附屬長沙中心醫院呼吸與危重癥醫學科（湖南長沙 410004）;
2. 南華大學附屬長沙中心醫院肺科（湖南長沙 410004）;

關鍵詞：

微RNA-27a 磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路脂多糖人肺腺癌細胞A549 凋亡

DOI：

10.7507/1671-6205.202109011

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探究微RNA-27a（microRNA-27a，miR-27a）調控磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的人肺腺癌細胞株A549凋亡的影響，并初步探討其機制。方法 Starbase分析miR-27a與磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit delta，PIK3CD）存在互補的結合位點，并以雙熒光素酶驗證。將A549細胞分為正常組、LPS組、LPS+miR-27a模擬物陰性對照組、LPS+miR-27a模擬物組、LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組。LPS+miR-27a模擬物陰性對照組、LPS+miR-27a模擬物組、LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組分別轉染miR-27a模擬物陰性對照、LPS+miR-27a模擬物、LPS+miR-27a模擬物，培養細胞6 h，更換為完全培養液培養細胞24 h，然后除正常組外，其余各組細胞添加10 mg/L LPS刺激24 h，且LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組加入PI3K激活劑740 Y-P，正常組細胞完全培養液正常培養相同時間。實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測細胞中miR-27a表達水平；細胞計數試劑盒8檢測細胞增殖情況；Hoechst33342染色與流式細胞術檢測細胞凋亡情況；透射電鏡觀察A549細胞自噬；蛋白免疫印跡檢測細胞中PIK3CD、磷酸化AKT（phosphorylated-AKT，p-AKT）、B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）、微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 II，LC3Ⅱ）蛋白表達。結果 miR-27a與PIK3CD存在結合位點，并經雙熒光素酶驗證。與正常組相比，LPS組、LPS+miR-27a模擬物陰性對照組A549細胞中miR-27a表達水平、增殖率、Bcl-2蛋白表達水平降低（P<0.05），凋亡率、細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平升高（P<0.05）；分別與LPS組、LPS+miR-27a模擬物陰性對照組相比，LPS+miR-27a模擬物組A549細胞中miR-27a表達水平、增殖率、細胞中Bcl-2蛋白表達水平升高（P<0.05），凋亡率、細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平降低（P<0.05）；與LPS+miR-27a模擬物組相比，LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組細胞中miR-27a表達水平、增殖率降低（P<0.05），凋亡率、細胞中PIK3CD、p-AKT、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平升高（P<0.05）。正常組細胞數量較多，細胞間排列緊密，可見核大小均一，細胞器結構正常；LPS組和LPS+miR-27a模擬物陰性對照組可見細胞變圓，細胞核固縮，形成團塊現象，顯現多個大小不一的圓形自噬泡；LPS+miR-27a模擬物組核固縮細胞數降低，LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組核固縮細胞數較LPS+miR-27a模擬物組升高，均可見少量圓形自噬泡，但數目不一。結論高表達miR-27a可以抑制PI3K/AKT通路，從而減輕LPS誘導的人肺腺癌細胞A549凋亡，而這一途徑可能與自噬減少相關。

引用本文： 朱錦琪, 陳劍波, 楊紅忠, 高欣. miR-27a調控PI3K/AKT通路介導的自噬途徑減輕脂多糖誘導的人肺腺癌細胞A549凋亡. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(2): 118-125. doi: 10.7507/1671-6205.202109011 復制

急性肺損傷屬危重癥患者的肺部損傷，低氧、肺水腫、中性粒細胞在肺內積累導致肺實質性細胞死亡，肺實質性死亡是急性肺損傷的基礎^[1]。因此了解肺實質性死亡的發生機制可為治療急性肺損傷提供有效支持。而細胞凋亡是一種細胞自殺過程，最終導致整個細胞死亡，細胞被分解和消化，這一過程中微RNA（miRNA）發揮重要作用^[2]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的肺泡上皮細胞中微RNA-27a（miR-27a）表達下調，miR-27a模擬物（mimic）可減少細胞凋亡，并下調B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax）、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved caspase-3）的表達，從而達到治療疾病的目的^[3]。細胞凋亡與細胞自噬關系密切，自噬是把雙刃劍，既可以抑制細胞凋亡，又可以轉化為凋亡，因此，了解自噬與凋亡之間的關系，可為更好的治療疾病提供參考。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）通路參與細胞增殖、凋亡、侵襲、遷移等過程，亦是經典的自噬、炎癥信號通路^[4-5]，在LPS誘導的急性肺損傷小鼠模型中PI3K/AKT通路處于激活狀態，且與炎癥、自噬、凋亡等關系密切^[6]。人肺腺癌細胞A549細胞因其具有體外無限分裂、肺泡上皮細胞表征特點，被首選應用為體外肺損傷模型構建^[7]。推測miR-27a可能通過PI3K/AKT通路影響LPS誘導的A549細胞凋亡。因此，本研究通過LPS誘導A549細胞建立急性肺損傷體外細胞模型，探討miR-27a對細胞凋亡以及自噬的影響，為臨床上治療疾病提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

人肺腺癌細胞A549購自中國科學院細胞庫，貨號SCSP-503。

1.1.2 主要試劑與儀器

LPS（貨號L8880）、PI3K激活劑740Y-P（貨號M00988）購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine^TM2000試劑盒（貨號C11058-3）、miR-27a模擬物（貨號C10327-1）、miR-27a模擬物陰性對照（貨號C10327-4）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基δ（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit delta，PIK3CD）野生型（PIK3CD WT。貨號C1195）、PIK3CD突變型（PIK3CD MUT。貨號C1198）購自廣州銳博生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（貨號11402ES60/80）、cDNA第一條鏈合成試劑盒（貨號50193S）、熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（2×SYBR qPCR Mix。貨號17216ES07）、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（annexin V - fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒（貨號239ES65）、細胞計數試劑盒8（cell counting kit 8，CCK-8。貨號ES16674）購自上海翊圣生物科技有限公司；兔抗鼠PIK3CD（貨號ab8805）、磷酸化AKT （phosphorylated-AKT，p-AKT。貨號ab182733）、Bax（貨號ab32124）、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2。貨號ab32042）、cleaved caspase-3（貨號ab63817）、微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3 II，LC3Ⅱ。貨號ab15742）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH。貨號ab10012）一抗、兔抗鼠二抗（貨號ab10183）購自英國abcam公司。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）儀（型號7500）購自美國ABI公司；酶標儀（型號Multiskan Sky）購自美國賽默飛世爾公司；流式細胞儀（型號Rhapsody TM）購自美國BD公司；化學發光檢測系統（型號GelDoc EZ）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 雙熒光素酶鑒定miR-27a與PIK3 CD的靶向位點

Starbase分析miR-27a與PIK3CD存在互補的結合位點；將miR-27a與PIK3CD結合位點及突變位點的序列克隆重組至pGL3-basic熒光素酶報告載體上構建PIK3CD WT及PIK3CD MUT熒光素酶報告載體，分別與miR-27a模擬物或miR-27a模擬物陰性對照共轉染至A549細胞中，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測各組熒光素酶相對活性^[8]。

1.2.2 分組及細胞處理

DMEM培養液中添加10%胎牛血清制成完全培養液，A549細胞添加完全培養液，在37 ℃、5% CO₂培養箱中培養，每天觀察細胞狀態，隔天換液。實驗分為正常組、LPS組、LPS+miR-27a模擬物陰性對照組、LPS+miR-27a模擬物組、LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組。取對數期細胞，LPS+miR-27a模擬物陰性對照組、LPS+miR-27a模擬物組、LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組參考Lipofectamine^TM2000試劑盒說明書操作分別將miR-27a模擬物陰性對照、miR-27a模擬物、miR-27a模擬物轉染至A549細胞，原培養液培養細胞6 h，更換為完全培養液培養細胞24 h，然后除正常組外，其余各組細胞添加10 mg/L LPS刺激24 h^[9]，且LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組加入50 μg/mL PI3K激活劑740Y-P，正常組細胞用完全培養液正常培養相同時間^[10]。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中miR-27a表達水平

6孔板培養處理細胞并收集，Trizol法提取總RNA，cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，RT-qPCR檢測細胞中miR-27a表達水平。所用引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。引物序列：miR-27a正向：5’-GCAGGGCTTAGCTGCTTG-3’，miR-27a反向：5’-GTGCAGGGCCGAGGT-3’；U6正向：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6反向：5’-AACGCTTTCACGAATTTGCGT-3’。cDNA稀釋成50 ng/μL上樣。20 μL反應體系：1 μL cDNA、10 μL 2×SYBR qPCR Mix、正/反向引物（均為10 μmol/L）各0.5 μL，8 μL ddH₂O；反應條件：94℃、60 s；95℃、30 s，60℃、40 s，40個循環；72℃ 10 min。2^-ΔΔCt法計算miR-27a相對表達水平。

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖情況

處理好的細胞以1×10⁴個/孔接種至6孔板中，每孔加100 μL完全培養液，待貼壁后培養24 h，每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃ 5% CO₂培養箱內孵育2 h，酶標儀在450 nm處測定吸光度，細胞增殖率=（實驗組吸光度/正常組吸光度）×100%。

1.2.5 Hoechst33342染色與流式細胞術檢測細胞凋亡情況

6孔板培養處理細胞并收集，甲醛（4%）固定細胞，磷酸鹽緩沖液洗滌并晾干后，加入Hoechst33342染色液，10 min后磷酸鹽緩沖液洗滌，熒光顯微鏡下觀察細胞形態；另取一定數量細胞，磷酸緩沖液清洗細胞3次后，加入195 μL Annexin V-FITC結合液、5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，然后加入10 μL PI染色液輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，隨后置于冰浴中，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 透射電鏡觀察A549細胞自噬

6孔板培養處理細胞并收集，胰酶消化，離心棄上清，戊二醛固定、乙醇丙醇脫水，浸透、包埋、聚合，制備超薄切片（60 nm），醋酸鈾與枸櫞酸鉛染色，電鏡觀察。

1.2.7 蛋白印跡法檢測細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平

6孔板培養處理細胞并收集，每孔板中添加100 μL蛋白裂解液，冰上裂解10 min，收集混合液至離心管中，12000 r/min 4 ℃離心20 min，收集上清即為細胞總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度，每個樣品20 μg蛋白置凝膠電泳分離蛋白、蛋白轉移至硝酸纖維素膜上、5%脫脂奶粉室溫封閉硝酸纖維素膜2 h，加入PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ、GAPDH一抗（均是1∶1000稀釋）4 ℃孵育過夜，加入二抗（1∶3000稀釋）室溫孵育2 h，顯色液顯色、化學發光系統檢測蛋白表達情況。目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件。計量數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。P<0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-27a與PIK3CD靶向關系驗證

Starbase分析miR-27a與PIK3CD存在互補的結合位點，見圖1。與miR-27a模擬物陰性對照+PIK3CD WT比較，miR-27a模擬物+PIK3CD WT熒光素酶相對活性下降（1.02±0.09比0.43±0.02，t=15.675，P<0.05）；miR-27a模擬物陰性對照+PIK3CD MUT與miR-27a模擬物+PIK3CD MUT熒光素酶相對活性差異無統計學意義（0.98±0.07比0.99±0.08，t=0.230，P>0.05）。

圖1 miR-27a與PIK3 CD的靶位點驗證

圖選項

組別	PIK3CD （/GAPDH）	p-AKT （/GAPDH）	Bax （/GAPDH）	Bcl-2 （/GAPDH）	cleaved caspase-3 （/GAPDH）	LC3Ⅱ （/GAPDH）
正常組	0.12±0.03	0.11±0.03	0.34±0.11	0.99±0.24	0.16±0.04	0.10±0.02
LPS組	0.27±0.09^a	0.24±0.07^a	1.09±0.26^a	0.18±0.05^a	0.88±0.21^a	0.92±0.22^a
LPS+miR-27a模擬物陰性對照組	0.29±0.10^a	0.26±0.08^a	1.12±0.27^a	0.17±0.05^a	0.90±0.22^a	0.91±0.21^a
LPS+miR-27a模擬物組	0.14±0.04^bc	0.13±0.04^bc	0.58±0.18^abc	0.71±0.20^abc	0.40±0.15^abc	0.31±0.11^abc
LPS+miR-27a模擬物+PI3K激活劑組	0.41±0.13^ad	0.42±0.14^ad	0.81±0.23^a	0.69±0.19^abc	0.71±0.19^ad	0.59±0.17^abcd
與正常組比較，^aP<0.05；與LPS組比較，^bP<0.05；與LPS+miR-27a模擬物陰性對照組比較，^cP<0.05；與LPS+miR-27a模擬物組比較，^dP<0.05。

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《中國呼吸與危重監護雜志》

miR-27a調控PI3K/AKT通路介導的自噬途徑減輕脂多糖誘導的人肺腺癌細胞A549凋亡

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

1.1.2 主要試劑與儀器

1.2 方法

1.2.1 雙熒光素酶鑒定miR-27a與PIK3 CD的靶向位點

1.2.2 分組及細胞處理

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中miR-27a表達水平

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖情況

1.2.5 Hoechst33342染色與流式細胞術檢測細胞凋亡情況

1.2.6 透射電鏡觀察A549細胞自噬

1.2.7 蛋白印跡法檢測細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miR-27a與PIK3CD靶向關系驗證

2.2 各組A549細胞中miR-27a表達水平

2.3 各組A549細胞增殖情況

2.4 各組A549細胞凋亡情況

2.5 各組A549細胞自噬情況

2.6 各組A549細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平

3 討論

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

1.1.2 主要試劑與儀器

1.2 方法

1.2.1 雙熒光素酶鑒定miR-27a與PIK3 CD的靶向位點

1.2.2 分組及細胞處理

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中miR-27a表達水平

1.2.4 CCK-8檢測細胞增殖情況

1.2.5 Hoechst33342染色與流式細胞術檢測細胞凋亡情況

1.2.6 透射電鏡觀察A549細胞自噬

1.2.7 蛋白印跡法檢測細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miR-27a與PIK3CD靶向關系驗證

2.2 各組A549細胞中miR-27a表達水平

2.3 各組A549細胞增殖情況

2.4 各組A549細胞凋亡情況

2.5 各組A549細胞自噬情況

2.6 各組A549細胞中PIK3CD、p-AKT、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、LC3Ⅱ蛋白表達水平

3 討論

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