引用本文： 鄭永信, 楊媛媛, 黃勇波, 楊寶欣, 陳康勰, 毛璞, 張海波, 黎毅敏. 機械牽張肺上皮細胞通過促進巨噬細胞極化誘導上皮細胞間質轉分化. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(12): 870-876. doi: 10.7507/1671-6205.202105077 復制
急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是由各種肺內、外致病因素引起，以頑固性低氧血癥為主要特征的臨床綜合征，具有較高的死亡率[1]。機械通氣是目前治療ARDS患者最重要也是最有效的方法之一，可以有效改善患者的低氧血癥，降低死亡率[2]。然而，不適當地機械通氣可使原有的肺損傷加重，導致呼吸機相關性肺損傷（VILI）。此外，機械牽張可引起人肺上皮細胞出現上皮–間質轉分化（EMT），EMT是肺部纖維化的發生的機制之一[3-4]。但是，機械牽張導致EMT的發生機制目前尚未完全明確。既往研究發現巨噬細胞可能參與了機體EMT的發生和發展[5]。Wang等[6]通過大潮氣量機械通氣誘發小鼠出現VILI，發現極化的M2巨噬細胞與呼吸機誘發的EMT密切相關。因此，肺組織纖維化可能與M1和M2巨噬細胞之間的失衡有關。此外，多項研究表明，組織損傷時，極化的巨噬細胞通過釋放血小板生長因子（PDGF）調節肌成纖維細胞增殖，促進細胞外基質合成膠原的產生，參與組織修復，導致纖維化的發生發展[7-8]。因此，本研究擬通過研究機械牽張人肺上皮細胞上清對巨噬細胞極化的影響，探討極化的巨噬細胞在人肺上皮細胞EMT的作用，為ARDS相關性肺纖維化發病機制提供理論支持以及新的治療方向。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑和儀器
人肺上皮細胞BEAS-2B（美國ATCC公司）；人急性單核細胞白血病細胞THP-1（美國ATCC公司）；細胞牽張儀（美國Flexcell公司）；白細胞介素（IL）-6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（BD公司）；IL-8 ELISA試劑盒（BD公司）；液態芯片檢測試劑盒（Bio-rad公司）；佛波酯（PMA，Sigma公司）；流式抗體CD11b-PE、流式抗體CD68-Alexa647、流式同型抗體IgG-PE、流式同型抗體IgG-Alexa647、流式抗體CD197-PE、流式抗體CD206-PE（BD公司）；PDGF ELISA試劑盒（Abcam公司）；兔抗GAPDH單克隆抗體（Epitomics公司）；羊抗N-鈣黏素（N-cadherin）多克隆抗體（SantaCruz公司）；兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（Abcam公司）；鼠抗波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（BD公司）；鼠抗E-鈣黏素（E-cadherin）單克隆抗體（BD公司）；鼠抗細胞角蛋白8（CK-8）單克隆抗體（Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔二抗（EarthOx公司）；HRP-驢抗山羊二抗（Jackson公司）；HRP-山羊抗鼠二抗（Jackson公司）。
1.2 方法
1.2.1 BEAS-2B培養及牽張模型的建立
BEAS-2B細胞培養：BEAS-2B細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2的飽和濕度下培養。用胰酶消化，按3×105個/mL接種于T25培養瓶中。機械牽張模型的建立：參照我們的前期建立機械牽張模型的方法[4]，將對數生長期BEAS-2B細胞接種于BioFlex 6孔板，每孔細胞數約3×105個，待細胞生長至80%～90%融合度，更換為無血清的DMEM/F12基礎培養基，靜置于細胞培養箱培養4 h后，換成機械牽張時所用的含0.1%血清的DMEM/F12培養基，每孔3 mL。將牽張板置于與FX-5000? Tension System連接的CO2細胞培養箱中（參數設置：波形為正弦波，頻率0.33 Hz，20%拉伸，周期24 h或48 h），啟動FlexSoftFX-5000計算機軟件，加載設定的牽張應用程序。
1.2.2 THP-1細胞培養及誘導分化為M0巨噬細胞
THP-1細胞培養：THP-1細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2的飽和濕度下培養，待細胞密度達8×105個/mL時傳代，按（2~4）×105個/mL接種至T25培養瓶中。THP-1細胞誘導分化為M0巨噬細胞：將對數生長期的THP-1細胞，按照每孔細胞數量為8×105個接種于6孔細胞培養板。加入PMA，根據PMA的濃度分為0 nmol/L組、50 nmol/L組、100 nmol/L組、200 nmol/L組、300 nmol/L組和400 nmol/L組，放置CO2培養箱培養48 h。
1.2.3 BEAS-2B細胞牽張上清誘導M0巨噬細胞極化實驗
取出巨噬細胞培養板，標記分組，分為正常培養對照組、牽張上清組和靜止上清組三個組，對應標記的孔分別加入1.5 mL正常培養基、1.5 mL機械牽張BEAS-2B的上清牽張、靜止培養的BEAS-2B上清，用DMEM/F12無血清培養基補每孔的培養體系至3 mL，靜置于CO2細胞培養箱中繼續培養48 h。
1.2.4 M0巨噬細胞與BEAS-2B細胞共培養實驗
將巨噬細胞按0.625×105個/孔，BEAS-2B細胞按3.5×105個/孔，分別將巨噬細胞和BEAS-2B細胞接種至6孔細胞培養板。分為無條件上清組、靜止上清組、牽張上清組、靜止上清+血小板生長因子受體抑制劑（PDGFRi）組、牽張上清+PDGFRi組，分別向對應分組的孔中不加或加入1.5 mL BEAS-2B的靜止/牽張上清，其中PDGFRi的終濃度是5 μmol/L[9]。用DMEM/F12無血清培養基補每孔的培養體系至3 mL，繼續放置CO2細胞培養箱中培養48 h。
1.2.5 ELISA檢測上清液中IL-6、IL-8、PDGF的表達
按試劑盒檢測說明檢測BEAS-2B細胞牽張上清液IL-6、IL-8的表達，檢測極化的巨噬細胞和BEAS-2B細胞共培養體系中PDGF的表達。
1.2.6 Luminex檢測BEAS-2B細胞牽張上清中促M1/M2巨噬細胞極化因子的表達
按試劑盒說明檢測促M1巨噬細胞極化的細胞因子γ干擾素（IFN-γ）、重組人粒細胞–巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達，促M2巨噬細胞極化的細胞因子IL-4、IL-6和IL-10的表達。
1.2.7 流式細胞儀檢測巨噬細胞表達標志物
使用EDTA消化液消化巨噬細胞，離心，去除上清，加入100 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞。取出流式管，分別向流式管里加入對應的抗體5 μL，注意避光操作。用移液器向做好標記的流式管分別加入50 μL巨噬細胞重懸液，并振蕩均勻，避光孵育30 min。30 min后加入1 mL PBS，離心，去掉上清液，加入1 mL PBS重懸，離心，最后加入200 mL PBS，上流式儀檢測。流式細胞儀鑒定M0巨噬細胞表面標志物CD11b和CD68[10]，M1型巨噬細胞標志物CD197[11]，M2型巨噬細胞表面標志物CD206[12]。
1.2.8 蛋白印跡法檢測上皮細胞標志蛋白CK-8、E-cadherin和間質細胞標志蛋白N-cadherin、α-SMA的表達
機械牽張完畢后，按試劑盒操作說明提取核蛋白，蛋白濃度檢測采用二喹啉甲酸（BCA）法，調整各樣本上樣量，每泳道30 μg，經10%十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒流220 mA濕轉轉膜2.5 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應的一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h，1×TBST洗10 min×3，用增強化學發光法檢測，曝光顯影。
1.3 統計學方法
采用SPSS 12.0統計軟件。兩組樣本之間的比較使用t檢驗，多組樣本均數的比較進行單因素方差分析，方差齊用最小顯著差異法（LSD），方差不齊用Tamhane’s T2法，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 機械牽張BEAS-2B細胞產生促M1/M2極化的細胞因子
對BEAS-2B細胞進行20%機械牽張12 h、24 h和48 h后，結果顯示機械牽張24 h BEAS-2B細胞上清中促M1巨噬細胞極化的細胞因子IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的濃度明顯增高，同時促M2巨噬細胞極化的細胞因子IL-4和IL-6水平明顯增高（圖1）。
圖1
機械牽張BEAS-2B細胞12 h、24 h和48 h后上清促M1和促M2極化的細胞因子的濃度
a. 檢測上清中促M1巨噬細胞極化的細胞因子IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的表達；b. 檢測上清中促M2巨噬細胞極化的細胞因子IL-4、IL-6和IL-10的表達。與靜止組比較，*
2.2 機械牽張BEAS-2B細胞上清促進M0巨噬細胞極化
使用0 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L和400 nmol/L PMA分別刺激THP-1細胞48 h后，得到M0巨噬細胞（CD68和CD11b雙陽性）（圖2）。其中，200 nmol/L PMA促進THP-1分化為M0巨噬細胞效果最好，CD68和CD11b雙陽性細胞占44.90%。使用機械牽張BEAS-2B 24 h和48 h的細胞上清分別培養M0巨噬細胞，結果顯示24 h牽張上清能增加M1巨噬細胞標志物CD197的表達（圖3a）；48 h牽張上清能同時明顯增加M1巨噬細胞標志物CD197和M2標志物CD206的表達（圖3b）。
圖2
THP-1細胞誘導成M0巨噬細胞
巨噬細胞表面標志物CD68和CD11b在PMA濃度為0 nmol/L（a）、50 nmol/L（b）、100 nmol/L（c）、200 nmol/L（d）、300 nmol/L（e）和400 nmol/L（f）的表達。其中，200 nmol/L PMA促進THP-1分化為M0巨噬細胞效果最好。
圖3
機械牽張BEAS-2B細胞上清促進M0巨噬細胞極化
a. 24 h牽張和靜止的BEAS-2B細胞上清培養M0巨噬細胞，流式細胞儀檢測M1標志物CD197和M2標志物CD206的表達結果。b. 48 h牽張和靜止的BEAS-2B細胞上清培養M0巨噬細胞，檢測M1標志物CD197和M2標志物CD206的表達結果。c. M1和M2巨噬細胞標志物表達水平統計圖。與靜止組比較，*
2.3 極化的巨噬細胞促進BEAS-2B細胞間質轉分化
將BEAS-2B靜止和牽張48 h的上清分別培養BEAS-2B細胞，結果顯示機械牽張的BEAS-2B細胞的上清不能促進BEAS-2B細胞發生EMT（圖4a、4e），且上清中PDGF濃度差異無統計學意義（圖4b）。這些結果證明機械牽張細胞上清無法單獨促進BEAS-2B細胞發生EMT。建立M0巨噬細胞與BEAS-2B細胞共培養體系后分別使用48 h牽張或靜止上清刺激，發現牽張細胞的上清可以促進上皮標志物CK-8和E-cadherin表達下降，間質標志物α-SMA、N-cadherin和Vimentin表達增高（圖4c、4e），此時上清PDGF濃度水平明顯增高（圖4d），而加入PDGFRi后，上皮標志物CK-8和E-cadherin表達上升，間質標志物α-SMA、N-cadherin和Vimentin表達下降（圖4c、4e）。
圖4
極化的巨噬細胞促進BEAS-2B細胞間質轉分化
a. 使用牽張或靜止細胞上清分別培養BEAS-2B細胞，蛋白印跡法檢測培養細胞的上皮標志物和間質標志物的表達。b. 使用牽張或靜止細胞上清分別培養BEAS-2B細胞，ELISA檢測各組上清PDGF的表達（
3 討論
EMT是指在生理、病理或者環境因素的刺激下，上皮細胞失去細胞極性和細胞間連接，轉分化為具有間質細胞形態和特征的細胞。EMT分為三種類型，其中，Ⅱ型EMT主要參與組織的損傷修復和器官纖維化[13]，是導致ARDS進展為纖維化的重要機制，與ARDS的高死亡率顯著相關[14]。我們團隊前期研究表明機械通氣可以通過誘導EMT促進纖維化的發生[15]，但其分子機制尚未完全闡明。既往研究表明巨噬細胞也與肺組織的損傷修復及纖維增殖相關[16]，PDGF是肺成纖維細胞強大的趨化因子，而巨噬細胞是PDGF的重要來源。因此，本研究通過建立牽張或靜止的BEAS-2B細胞上清刺激M0巨噬細胞和BEAS-2B細胞共培養體系，加入PDGFRi，以觀察PDGF對上皮細胞EMT的影響。
巨噬細胞是組織內一種高度異質化的免疫細胞，當外來病原體入侵機體時，巨噬細胞發揮吞噬清除功能的同時也分泌多種生物活性物質，參與各種特異或非特異免疫反應[16]。然而，Gharib等[17]研究證實極化的M2型巨噬細胞促進肺纖維化的發展，表明巨噬細胞在肺部纖維增殖性病變中起著重要作用。此外，不恰當的機械通氣是迅速激活肺泡巨噬細胞的誘因，而肺泡巨噬細胞的極化在機械通氣相關性肺損傷及EMT中起著重要作用[6]。這與本研究結果相一致，我們的研究發現機械牽張的BEAS-2B細胞上清能促進M0巨噬細胞的極化，機械牽張的BEAS-2B細胞上清中促M1和M2型巨噬細胞的細胞因子IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均顯著升高。因此，通過流式細胞儀對M1標志物CD197和M2標志物CD206進行檢測，發現機械牽張的BEAS-2B細胞上清刺激能促進M0巨噬細胞向M1和M2極化，而極化的巨噬細胞可以下調上皮標志蛋白CK-8、E-cadherin的表達，同時促進間質標志蛋白α-SMA、N-cadherin、Vimentin的表達，誘導EMT的發生。
在對M1/M2巨噬細胞引起纖維化的機制的研究發現，極化的巨噬細胞在細胞增殖、細胞遷移和血管生成等生物學行為中起著非常重要的作用，其中PDGF是調控細胞分裂與正常生長的重要生長因子，而巨噬細胞是PDGF的重要來源。在生理狀態下，PDGF常以α顆粒的形式存在于血小板中，組織受損時，可由激活的巨噬細胞分泌釋放[18]。研究發現PDGF可以促進癌細胞發生EMT[19-20]，是肺成纖維細胞強大的趨化因子，通過抑制PDGF，可以顯著改善博來霉素誘導的肺纖維化[21-22]。此外，Deng等[23]的研究也表明PDGF通過獨特的信號通路介導纖維相關蛋白的表達，從而調節ARDS相關肺纖維化的發生發展。以上研究均表明PDGF在肺纖維化中發揮重要作用。巨噬細胞是PDGF的重要來源，M1/M2型巨噬細胞均可產生PDGF[7, 24]。由此，我們猜測極化的巨噬細胞可能通過分泌PDGF誘發EMT。在本研究中，機械牽張的BEAS-2B細胞上清可以誘導巨噬細胞極化并分泌PDGF，進而促進BEAS-2B細胞發生EMT，加入PDGFRi抑制PDGF的表達，可以部分逆轉EMT的進程。
綜上所述，本研究發現機械牽張BEAS-2B細胞后促M0巨噬細胞向M1/M2巨噬細胞極化的細胞因子分泌增加，誘導巨噬細胞極化，極化的巨噬細胞通過PDGF促進BEAS-2B細胞發生EMT。研究結果進一步加深了對ARDS相關性肺纖維化機制的認識，為ARDS相關性肺纖維化發病機制提供理論支持以及新的治療方向。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是由各種肺內、外致病因素引起，以頑固性低氧血癥為主要特征的臨床綜合征，具有較高的死亡率[1]。機械通氣是目前治療ARDS患者最重要也是最有效的方法之一，可以有效改善患者的低氧血癥，降低死亡率[2]。然而，不適當地機械通氣可使原有的肺損傷加重，導致呼吸機相關性肺損傷（VILI）。此外，機械牽張可引起人肺上皮細胞出現上皮–間質轉分化（EMT），EMT是肺部纖維化的發生的機制之一[3-4]。但是，機械牽張導致EMT的發生機制目前尚未完全明確。既往研究發現巨噬細胞可能參與了機體EMT的發生和發展[5]。Wang等[6]通過大潮氣量機械通氣誘發小鼠出現VILI，發現極化的M2巨噬細胞與呼吸機誘發的EMT密切相關。因此，肺組織纖維化可能與M1和M2巨噬細胞之間的失衡有關。此外，多項研究表明，組織損傷時，極化的巨噬細胞通過釋放血小板生長因子（PDGF）調節肌成纖維細胞增殖，促進細胞外基質合成膠原的產生，參與組織修復，導致纖維化的發生發展[7-8]。因此，本研究擬通過研究機械牽張人肺上皮細胞上清對巨噬細胞極化的影響，探討極化的巨噬細胞在人肺上皮細胞EMT的作用，為ARDS相關性肺纖維化發病機制提供理論支持以及新的治療方向。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 主要試劑和儀器
人肺上皮細胞BEAS-2B（美國ATCC公司）；人急性單核細胞白血病細胞THP-1（美國ATCC公司）；細胞牽張儀（美國Flexcell公司）；白細胞介素（IL）-6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（BD公司）；IL-8 ELISA試劑盒（BD公司）；液態芯片檢測試劑盒（Bio-rad公司）；佛波酯（PMA，Sigma公司）；流式抗體CD11b-PE、流式抗體CD68-Alexa647、流式同型抗體IgG-PE、流式同型抗體IgG-Alexa647、流式抗體CD197-PE、流式抗體CD206-PE（BD公司）；PDGF ELISA試劑盒（Abcam公司）；兔抗GAPDH單克隆抗體（Epitomics公司）；羊抗N-鈣黏素（N-cadherin）多克隆抗體（SantaCruz公司）；兔抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）單克隆抗體（Abcam公司）；鼠抗波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（BD公司）；鼠抗E-鈣黏素（E-cadherin）單克隆抗體（BD公司）；鼠抗細胞角蛋白8（CK-8）單克隆抗體（Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）-山羊抗兔二抗（EarthOx公司）；HRP-驢抗山羊二抗（Jackson公司）；HRP-山羊抗鼠二抗（Jackson公司）。
1.2 方法
1.2.1 BEAS-2B培養及牽張模型的建立
BEAS-2B細胞培養：BEAS-2B細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2的飽和濕度下培養。用胰酶消化，按3×105個/mL接種于T25培養瓶中。機械牽張模型的建立：參照我們的前期建立機械牽張模型的方法[4]，將對數生長期BEAS-2B細胞接種于BioFlex 6孔板，每孔細胞數約3×105個，待細胞生長至80%～90%融合度，更換為無血清的DMEM/F12基礎培養基，靜置于細胞培養箱培養4 h后，換成機械牽張時所用的含0.1%血清的DMEM/F12培養基，每孔3 mL。將牽張板置于與FX-5000? Tension System連接的CO2細胞培養箱中（參數設置：波形為正弦波，頻率0.33 Hz，20%拉伸，周期24 h或48 h），啟動FlexSoftFX-5000計算機軟件，加載設定的牽張應用程序。
1.2.2 THP-1細胞培養及誘導分化為M0巨噬細胞
THP-1細胞培養：THP-1細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養基，37 ℃、5% CO2的飽和濕度下培養，待細胞密度達8×105個/mL時傳代，按（2~4）×105個/mL接種至T25培養瓶中。THP-1細胞誘導分化為M0巨噬細胞：將對數生長期的THP-1細胞，按照每孔細胞數量為8×105個接種于6孔細胞培養板。加入PMA，根據PMA的濃度分為0 nmol/L組、50 nmol/L組、100 nmol/L組、200 nmol/L組、300 nmol/L組和400 nmol/L組，放置CO2培養箱培養48 h。
1.2.3 BEAS-2B細胞牽張上清誘導M0巨噬細胞極化實驗
取出巨噬細胞培養板，標記分組，分為正常培養對照組、牽張上清組和靜止上清組三個組，對應標記的孔分別加入1.5 mL正常培養基、1.5 mL機械牽張BEAS-2B的上清牽張、靜止培養的BEAS-2B上清，用DMEM/F12無血清培養基補每孔的培養體系至3 mL，靜置于CO2細胞培養箱中繼續培養48 h。
1.2.4 M0巨噬細胞與BEAS-2B細胞共培養實驗
將巨噬細胞按0.625×105個/孔，BEAS-2B細胞按3.5×105個/孔，分別將巨噬細胞和BEAS-2B細胞接種至6孔細胞培養板。分為無條件上清組、靜止上清組、牽張上清組、靜止上清+血小板生長因子受體抑制劑（PDGFRi）組、牽張上清+PDGFRi組，分別向對應分組的孔中不加或加入1.5 mL BEAS-2B的靜止/牽張上清，其中PDGFRi的終濃度是5 μmol/L[9]。用DMEM/F12無血清培養基補每孔的培養體系至3 mL，繼續放置CO2細胞培養箱中培養48 h。
1.2.5 ELISA檢測上清液中IL-6、IL-8、PDGF的表達
按試劑盒檢測說明檢測BEAS-2B細胞牽張上清液IL-6、IL-8的表達，檢測極化的巨噬細胞和BEAS-2B細胞共培養體系中PDGF的表達。
1.2.6 Luminex檢測BEAS-2B細胞牽張上清中促M1/M2巨噬細胞極化因子的表達
按試劑盒說明檢測促M1巨噬細胞極化的細胞因子γ干擾素（IFN-γ）、重組人粒細胞–巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達，促M2巨噬細胞極化的細胞因子IL-4、IL-6和IL-10的表達。
1.2.7 流式細胞儀檢測巨噬細胞表達標志物
使用EDTA消化液消化巨噬細胞，離心，去除上清，加入100 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細胞。取出流式管，分別向流式管里加入對應的抗體5 μL，注意避光操作。用移液器向做好標記的流式管分別加入50 μL巨噬細胞重懸液，并振蕩均勻，避光孵育30 min。30 min后加入1 mL PBS，離心，去掉上清液，加入1 mL PBS重懸，離心，最后加入200 mL PBS，上流式儀檢測。流式細胞儀鑒定M0巨噬細胞表面標志物CD11b和CD68[10]，M1型巨噬細胞標志物CD197[11]，M2型巨噬細胞表面標志物CD206[12]。
1.2.8 蛋白印跡法檢測上皮細胞標志蛋白CK-8、E-cadherin和間質細胞標志蛋白N-cadherin、α-SMA的表達
機械牽張完畢后，按試劑盒操作說明提取核蛋白，蛋白濃度檢測采用二喹啉甲酸（BCA）法，調整各樣本上樣量，每泳道30 μg，經10%十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒流220 mA濕轉轉膜2.5 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入相應的一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育1 h，1×TBST洗10 min×3，用增強化學發光法檢測，曝光顯影。
1.3 統計學方法
采用SPSS 12.0統計軟件。兩組樣本之間的比較使用t檢驗，多組樣本均數的比較進行單因素方差分析，方差齊用最小顯著差異法（LSD），方差不齊用Tamhane’s T2法，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 機械牽張BEAS-2B細胞產生促M1/M2極化的細胞因子
對BEAS-2B細胞進行20%機械牽張12 h、24 h和48 h后，結果顯示機械牽張24 h BEAS-2B細胞上清中促M1巨噬細胞極化的細胞因子IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的濃度明顯增高，同時促M2巨噬細胞極化的細胞因子IL-4和IL-6水平明顯增高（圖1）。
圖1
機械牽張BEAS-2B細胞12 h、24 h和48 h后上清促M1和促M2極化的細胞因子的濃度
a. 檢測上清中促M1巨噬細胞極化的細胞因子IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的表達；b. 檢測上清中促M2巨噬細胞極化的細胞因子IL-4、IL-6和IL-10的表達。與靜止組比較，*
2.2 機械牽張BEAS-2B細胞上清促進M0巨噬細胞極化
使用0 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、300 nmol/L和400 nmol/L PMA分別刺激THP-1細胞48 h后，得到M0巨噬細胞（CD68和CD11b雙陽性）（圖2）。其中，200 nmol/L PMA促進THP-1分化為M0巨噬細胞效果最好，CD68和CD11b雙陽性細胞占44.90%。使用機械牽張BEAS-2B 24 h和48 h的細胞上清分別培養M0巨噬細胞，結果顯示24 h牽張上清能增加M1巨噬細胞標志物CD197的表達（圖3a）；48 h牽張上清能同時明顯增加M1巨噬細胞標志物CD197和M2標志物CD206的表達（圖3b）。
圖2
THP-1細胞誘導成M0巨噬細胞
巨噬細胞表面標志物CD68和CD11b在PMA濃度為0 nmol/L（a）、50 nmol/L（b）、100 nmol/L（c）、200 nmol/L（d）、300 nmol/L（e）和400 nmol/L（f）的表達。其中，200 nmol/L PMA促進THP-1分化為M0巨噬細胞效果最好。
圖3
機械牽張BEAS-2B細胞上清促進M0巨噬細胞極化
a. 24 h牽張和靜止的BEAS-2B細胞上清培養M0巨噬細胞，流式細胞儀檢測M1標志物CD197和M2標志物CD206的表達結果。b. 48 h牽張和靜止的BEAS-2B細胞上清培養M0巨噬細胞，檢測M1標志物CD197和M2標志物CD206的表達結果。c. M1和M2巨噬細胞標志物表達水平統計圖。與靜止組比較，*
2.3 極化的巨噬細胞促進BEAS-2B細胞間質轉分化
將BEAS-2B靜止和牽張48 h的上清分別培養BEAS-2B細胞，結果顯示機械牽張的BEAS-2B細胞的上清不能促進BEAS-2B細胞發生EMT（圖4a、4e），且上清中PDGF濃度差異無統計學意義（圖4b）。這些結果證明機械牽張細胞上清無法單獨促進BEAS-2B細胞發生EMT。建立M0巨噬細胞與BEAS-2B細胞共培養體系后分別使用48 h牽張或靜止上清刺激，發現牽張細胞的上清可以促進上皮標志物CK-8和E-cadherin表達下降，間質標志物α-SMA、N-cadherin和Vimentin表達增高（圖4c、4e），此時上清PDGF濃度水平明顯增高（圖4d），而加入PDGFRi后，上皮標志物CK-8和E-cadherin表達上升，間質標志物α-SMA、N-cadherin和Vimentin表達下降（圖4c、4e）。
圖4
極化的巨噬細胞促進BEAS-2B細胞間質轉分化
a. 使用牽張或靜止細胞上清分別培養BEAS-2B細胞，蛋白印跡法檢測培養細胞的上皮標志物和間質標志物的表達。b. 使用牽張或靜止細胞上清分別培養BEAS-2B細胞，ELISA檢測各組上清PDGF的表達（
3 討論
EMT是指在生理、病理或者環境因素的刺激下，上皮細胞失去細胞極性和細胞間連接，轉分化為具有間質細胞形態和特征的細胞。EMT分為三種類型，其中，Ⅱ型EMT主要參與組織的損傷修復和器官纖維化[13]，是導致ARDS進展為纖維化的重要機制，與ARDS的高死亡率顯著相關[14]。我們團隊前期研究表明機械通氣可以通過誘導EMT促進纖維化的發生[15]，但其分子機制尚未完全闡明。既往研究表明巨噬細胞也與肺組織的損傷修復及纖維增殖相關[16]，PDGF是肺成纖維細胞強大的趨化因子，而巨噬細胞是PDGF的重要來源。因此，本研究通過建立牽張或靜止的BEAS-2B細胞上清刺激M0巨噬細胞和BEAS-2B細胞共培養體系，加入PDGFRi，以觀察PDGF對上皮細胞EMT的影響。
巨噬細胞是組織內一種高度異質化的免疫細胞，當外來病原體入侵機體時，巨噬細胞發揮吞噬清除功能的同時也分泌多種生物活性物質，參與各種特異或非特異免疫反應[16]。然而，Gharib等[17]研究證實極化的M2型巨噬細胞促進肺纖維化的發展，表明巨噬細胞在肺部纖維增殖性病變中起著重要作用。此外，不恰當的機械通氣是迅速激活肺泡巨噬細胞的誘因，而肺泡巨噬細胞的極化在機械通氣相關性肺損傷及EMT中起著重要作用[6]。這與本研究結果相一致，我們的研究發現機械牽張的BEAS-2B細胞上清能促進M0巨噬細胞的極化，機械牽張的BEAS-2B細胞上清中促M1和M2型巨噬細胞的細胞因子IFN-γ、GM-CSF、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均顯著升高。因此，通過流式細胞儀對M1標志物CD197和M2標志物CD206進行檢測，發現機械牽張的BEAS-2B細胞上清刺激能促進M0巨噬細胞向M1和M2極化，而極化的巨噬細胞可以下調上皮標志蛋白CK-8、E-cadherin的表達，同時促進間質標志蛋白α-SMA、N-cadherin、Vimentin的表達，誘導EMT的發生。
在對M1/M2巨噬細胞引起纖維化的機制的研究發現，極化的巨噬細胞在細胞增殖、細胞遷移和血管生成等生物學行為中起著非常重要的作用，其中PDGF是調控細胞分裂與正常生長的重要生長因子，而巨噬細胞是PDGF的重要來源。在生理狀態下，PDGF常以α顆粒的形式存在于血小板中，組織受損時，可由激活的巨噬細胞分泌釋放[18]。研究發現PDGF可以促進癌細胞發生EMT[19-20]，是肺成纖維細胞強大的趨化因子，通過抑制PDGF，可以顯著改善博來霉素誘導的肺纖維化[21-22]。此外，Deng等[23]的研究也表明PDGF通過獨特的信號通路介導纖維相關蛋白的表達，從而調節ARDS相關肺纖維化的發生發展。以上研究均表明PDGF在肺纖維化中發揮重要作用。巨噬細胞是PDGF的重要來源，M1/M2型巨噬細胞均可產生PDGF[7, 24]。由此，我們猜測極化的巨噬細胞可能通過分泌PDGF誘發EMT。在本研究中，機械牽張的BEAS-2B細胞上清可以誘導巨噬細胞極化并分泌PDGF，進而促進BEAS-2B細胞發生EMT，加入PDGFRi抑制PDGF的表達，可以部分逆轉EMT的進程。
綜上所述，本研究發現機械牽張BEAS-2B細胞后促M0巨噬細胞向M1/M2巨噬細胞極化的細胞因子分泌增加，誘導巨噬細胞極化，極化的巨噬細胞通過PDGF促進BEAS-2B細胞發生EMT。研究結果進一步加深了對ARDS相關性肺纖維化機制的認識，為ARDS相關性肺纖維化發病機制提供理論支持以及新的治療方向。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
