引用本文： 陶玉, 王堅苗. 基于環介導恒溫擴增技術的呼吸重癥監護病房患者下呼吸道標本的細菌檢測分析. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(1): 25-30. doi: 10.7507/1671-6205.202105062 復制
下呼吸道感染是呼吸重癥監護病房（respiratory intensive care unit，RICU）中的常見疾病，與高病死率相關。根據文獻報道，我國2016年肺炎標化死亡率為11.3/10萬[1]。因此，對肺部感染的診治是臨床工作的重點。RICU患者下呼吸道感染的起始治療多為經驗性治療，因為通常無法在患者就診時立即獲取患者感染的病原學依據。但經驗性治療有時不能完全覆蓋病原體，而且常規經驗性使用廣譜抗生素可能加劇重癥監護室細菌的耐藥[2]。因此，準確、及時地檢測下呼吸道感染的病原體可以指導臨床精確的抗感染治療，縮短患者住院時間，減少廣譜抗生素的使用，進而減少耐藥菌產生[3]。傳統的病原體培養經濟，標本容易收集，但敏感性及特異性均較低，無法檢測非培養病原體，而且某些病原培養十分耗時或無法培養[4]。臨床工作中亟需新的檢測方法指導精準治療。
環介導恒溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是由Notomi等[5]于2000年首次報道的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，近年來越來越多的應用于下呼吸道病原體的檢測。該方法擴增效率可達1×109～1×1010個拷貝數量級，反應僅需1 h，擴增反應結果肉眼可辨。LAMP具有簡便、快捷、準確、廉價、易檢測等特點。基于此，LAMP技術可能有助于快速檢測呼吸道病原體，指導抗生素合理用藥。目前尚未見到關于LAMP方法檢測RICU患者呼吸道標本與患者預后關系的報道。因此，本研究通過回顧性分析應用LAMP技術檢測出的RICU患者的致病菌，結合患者的臨床特點及預后，分析LAMP技術對RICU抗感染治療的作用以及患者預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2018年10月至2020年12月RICU應用LAMP技術檢測下呼吸道感染的患者，研究期間同一患者重復住院只納入第1次住院情況，不重復納入。呼吸道標本應為合格呼吸道深部痰液、氣道吸取物或支氣管鏡肺泡灌洗液。排除標準：（1）因非醫療因素導致住院時間超過100 d的患者；（2）診斷不明的患者。
1.2 方法
1.2.1 研究設計
基于LAMP技術的RICU患者下呼吸道標本的細菌檢測的回顧性研究。
1.2.2 研究方法
調查入組患者的臨床資料：（1）一般資料，包括住院號、性別、年齡、住院天數、吸煙狀況，是否有糖尿病、高血壓、冠心病、腦卒中等基礎疾病；（2）臨床指標，包括淋巴細胞數、血清白蛋白水平、超敏C反應蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、是否插管、是否應用限制級抗生素，限制級抗生素包括碳青霉烯類、替加環素、多粘菌素、糖肽類或利奈唑胺；（3）下呼吸道標本培養結果，包括是否培養出細菌，是否培養出多重耐藥菌，同一患者住院期間多次細菌培養中1次檢測結果陽性即列為結果陽性；（4）基于LAMP技術檢測的下呼吸道標本的結果，LAMP技術檢測的病原體共13種，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、結核分枝桿菌復合群、肺炎支原體、肺炎衣原體同一患者住院期間多次檢測中1次檢測結果陽性即列為結果陽性，MRSA檢測患者的mecA耐藥基因，若mecA基因檢測陽性并且金黃色葡萄球菌檢測陽性則視為MRSA檢測陽性；（5）臨床結局，根據病程記錄將患者結局分為死亡、非死亡兩類。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件。將年齡、住院天數按中位數分為兩類，PCT、hs-CRP分為正常值范圍以下或正常值范圍以上，淋巴細胞數分為正常下限以下及正常范圍及以上，有血液系統疾病排除，血清白蛋白分為正常或正常范圍以下。分類變量使用頻數和百分比表示，不同臨床結局組的變量比較采用χ2檢驗（有理論數T<5或n<40，則用Fisher檢驗）。與患者死亡有合理關聯的協變量（P<0.05）進入模型，對有關暴露因素進行單因素分析和多因素條件Logistic回歸分析，計算比值比及其95%可信區間。檢驗水準α＝0.05。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
本研究共納入符合標準的RICU患者117例，患者基本情況如表1所示。其中男90例（76.92%），女27例（23.08%）。年齡18～89歲，中位年齡為64歲，入住RICU的患者以老年人居多。中位住院天數為24 d（范圍2～93 d）。有吸煙史的有56例，無吸煙史61例。
表1
RICU下呼吸道感染患者死亡相關危險因素的單因素分析
2.2 臨床指標
在RICU，有慢性基礎疾病的患者比例為88.03%，合并有冠心病、糖尿病、腦卒中、高血壓慢性基礎疾病的比例分別為22.22%、24.79%、21.37%、43.59%（n=117）。在治療方面，使用過機械通氣輔助呼吸的患者比例為57.26%，使用限制級抗生素的比例高達87.18%（表1）。
2.3 下呼吸道標本檢測結果
在115例進行了下呼吸道標本培養的患者中，培養出細菌的患者數為45例（39.13%），培養出兩種或以上細菌的比例僅10例（8.70%）。其中，培養陽性的患者中多重耐藥菌、MRSA細菌比例分別占95.56%、6.67%（n=45）。培養陽性的細菌前4位分別為鮑曼不動桿菌（29例）、銅綠假單胞菌（12例）、肺炎克雷伯菌（11例）、金黃色葡萄球菌（3例），分別占總樣本的25.22%、10.43%、9.57%、2.61%。而117例患者中，用LAMP技術檢測陽性的病例數為85例（72.65%），而檢出2種或2種以上細菌的病例數為43例（36.75%），均明顯高于傳統培養方法。其中檢出最多的細菌前4位分別為鮑曼不動桿菌（47例）、肺炎克雷伯菌（40例）、銅綠假單胞菌（29例）、嗜麥芽窄食單胞菌（21例），分別占總人數的40.17%、34.19%、24.79%、17.95%（表2）。對傳統培養方法檢測出的細菌進行耐藥性分析，其中鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌全部為多重耐藥菌，鮑曼不動桿菌全部對碳青霉烯耐藥。
表2
LAMP技術檢測病原體結果與病原體培養結果比較
2.4 臨床結局
患者出院時的臨床結局分為死亡與非死亡，其中14例死亡（11.97%），103例患者未死亡（88.03%）。未死亡患者中，好轉或痊愈75例（72.82%，n=103），無好轉或惡化28例（27.18%，n=103）。其中年齡≥64歲的患者病死率為14.52%（9/62），<64歲患者病死率9.09%（5/55）。
2.5 死亡相關危險因素分析
單因素分析中，機械通氣（χ2=5.260，P=0.022）、患者用LAMP技術檢測病原菌2項或以上陽性（χ2=8.227，P=0.004）與患者的臨床結局有關（表1）。
將單因素方差分析具有統計學差異的機械通氣及LAMP技術檢出至少2種病原菌代入Logistic回歸進行多因素分析，結果患者病原菌核酸檢測至少檢出2種細菌有統計學意義，機械通氣無統計學意義。RICU患者LAMP方法至少檢出2種細菌的患者死亡風險是未檢出2種細菌患者死亡風險的4.789倍（P=0.027），95%可信區間為1.198～19.144（表3）。
表3
RICU下呼吸道感染患者死亡風險相關的多因素Logistic回歸分析
3 討論
隨著近年來耐藥菌逐漸增多、人口老齡化及免疫受損人群數量的增加，使得感染性疾病患者日益增多。雖然不斷有新的抗生素問世，肺炎的死亡率仍無明顯下降趨勢。據報道，2016年我國肺炎各年齡段標化死亡率分別為0.3/10萬（<35歲），5.5/10萬（35～65歲），以及241.8/10萬（≥65歲），高齡患者死亡率明顯升高[1]。肺炎死亡率無明顯下降的原因可能為感染的病原體難以明確。傳統的病原體培養、涂片方法因其局限性，可能導致病原學診斷延誤或無法確診，臨床有時難以實現精準治療，從而影響患者的療效和預后[6-7]。
根據全國細菌耐藥監測網監測的數據顯示，RICU中分離到的細菌前4位分別為鮑曼不動桿菌（25.8%）、銅綠假單胞菌（13.1%）、肺炎克雷伯菌（12.2%）、金黃色葡萄球菌（9.2%）。呼吸道痰標本或肺泡灌洗液標本檢測到的細菌前4位為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及肺炎鏈球菌[8]。在RICU中，培養出MRSA、耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌、耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌、產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌、產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌的檢出率分別為76.5%、20.1%、90.6%、64.2%、47.2%和43.0%[8]。本研究通過痰或肺泡灌洗液培養檢測到的細菌與報道基本一致。本研究中培養到的鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌均為多重耐藥菌，其中鮑曼不動桿菌對碳青霉烯均提示耐藥。可見重癥監護室中細菌耐藥嚴重，常規經驗性治療選用碳青霉烯類藥物存在治療失敗可能，必須充分完善病原學檢查以早期精準治療，以避免廣譜抗生素濫用。
本研究經過分析LAMP在下呼吸道標本中細菌檢測的應用，發現LAMP檢測陽性的患者數遠高于傳統培養，同時檢測出至少2種細菌患者比例更是明顯高于細菌培養至少2項細菌陽性的患者。LAMP技術反應全程可在恒定溫度（60～65 ℃）條件下實現靶核酸的高效擴增。采用4條引物（2條外引物，2條內引物）特異性的識別靶序列上6個區域，包括靶基因3’端的F3c、F2c和Fic區以及5’端的B1、B2和B3區，依靠具有高鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65 ℃左右進行核酸的指數級擴增，靶序列的擴增產物在不到1 h便可累積到1×109拷貝[5]。同時，LAMP反應具有雙鏈DNA生成、單鏈環結構生成、焦磷酸離子生成、反應體系pH值降低及Mg2+濃度減少等多個反應特點，因此，其產物檢測除瓊脂糖凝膠電泳檢測外可兼容熒光檢測、化學發光檢測、濁度檢測、比色檢測及電化學檢測，選擇與設計靈活，是該技術應用廣泛的又一優勢[9]。利用LAMP技術來檢測易引發呼吸系統感染的常見病原體，所需設備步驟簡便；因在恒溫條件下擴增，對于中小醫院只需水浴鍋即可；結果可通過肉眼判斷；從痰液或肺泡灌洗液樣本中提取核酸到獲取最終結果，全過程僅需數小時，在時效性上明顯優于傳統痰培養檢測方法[10]。本研究總結了利用LAMP技術對RICU患者進行呼吸道病原體檢測的結果，發現LAMP檢測陽性率明顯高于傳統細菌培養方法。患者中用LAMP技術檢出至少2種細菌的比例為36.75%，而培養僅8.70%。相較于傳統病原體培養方法，LAMP技術可以更快捷、準確地檢出患者呼吸道感染的病原體。特別是多重細菌感染的患者，病原體培養方法往往只能培養出優勢菌群，LAMP則可以更全面地檢出致病菌群，指導患者精準的抗菌治療，避免廣譜抗生素的過度使用，進而減少耐藥菌的產生[4, 11-13]。
傳統培養方法檢測肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等陽性率極低，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌均為苛養菌，營養要求高，一般加送檢到接種時間不能超過30 min。而在臨床工作中，從患者留取標本至接種多超過30 min，因此苛養菌的培養陽性率不高[14]。嗜肺軍團菌屬于胞內寄生菌，傳統培養法操作繁瑣，培養鑒定周期長[15]。而LAMP檢測靈敏度高，肺炎鏈球菌、嗜肺軍團菌均有檢出，可以彌補傳統培養方法的不足。
本研究發現RICU中LAMP技術檢測出的細菌譜與傳統培養方法有所不同。LAMP技術檢出病原體陽性率最高的4種為鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌。鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌為近年報道的RICU最常見的下呼吸道感染致病菌，與病原體培養結果接近。嗜麥芽窄食單胞菌是通過LAMP方法檢測出的與傳統培養方法差異較大的細菌。關于嗜麥芽窄食單胞菌的流行病學研究顯示嗜麥芽窄食單胞菌在近年檢出明顯增加，其中重癥監護室，包括心血管、血液、手術、外傷等科室的重癥監護室占比達47.49%[16-17]。使用頭孢菌素+酶抑制劑、碳青霉烯類和糖肽類是嗜麥芽窄食單胞菌醫院感染的獨立危險因素[18]。本RICU中嗜麥芽窄食單胞菌檢出多可能與抗生素的使用、部分患者為術后合并肺部感染有關。通過單因素分析，我們發現機械通氣、病原菌核酸檢測出2種細菌與患者的臨床結局有關。通過多因素Logistic回歸，進一步證實通過LAMP技術檢出兩種病原體，是提示患者死亡風險增高的重要因素。
當然，LAMP技術檢測除了快速、敏感、特異的優點，也有其不足之處，如假陽性率高，污染風險高，難于區分致病菌與定植菌，只能用于診斷常見和某些特殊病原體。本研究中，死亡患者數目較少，結論仍需進一步大樣本量的研究進一步驗證。
宏基因組高通量測序是近年來發展迅速的微生物檢測方式，其優勢是可無偏性覆蓋幾乎所有病原微生物，包括病毒、細菌、真菌等，甚至可以發現新病原，但目前存在的問題是檢測呼吸道標本的前處理、測序方法和生物信息分析技術無統一。與LAMP相比，宏基因組高通量測序所需工作流程復雜，價格昂貴，一般要3 d才能出報告，很難當天拿到結果，對于ICU重癥感染患者來說仍然顯得太慢[3, 19-20]。而基于LAMP技術的細菌檢測對環境要求低，技術設備相對簡單，操作簡單，成本低，可在各級醫院普及開展，尤其是其檢測速度非常快，可在短時間內進行，當天就可以出結果，操作簡單，對技術人員要求低。因此，LAMP相較宏基因組高通量測序更適合用于病原體的快速檢測，初始治療的藥物選擇依據。
綜上所述，LAMP技術檢測RICU患者呼吸道標本靈敏度高，可快速得到結果，有助于指導臨床精準治療，適合在各級醫院普及開展。通過LAMP技術檢測出至少2種下呼吸道病原體是RICU患者預后不佳的預測因素。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
下呼吸道感染是呼吸重癥監護病房（respiratory intensive care unit，RICU）中的常見疾病，與高病死率相關。根據文獻報道，我國2016年肺炎標化死亡率為11.3/10萬[1]。因此，對肺部感染的診治是臨床工作的重點。RICU患者下呼吸道感染的起始治療多為經驗性治療，因為通常無法在患者就診時立即獲取患者感染的病原學依據。但經驗性治療有時不能完全覆蓋病原體，而且常規經驗性使用廣譜抗生素可能加劇重癥監護室細菌的耐藥[2]。因此，準確、及時地檢測下呼吸道感染的病原體可以指導臨床精確的抗感染治療，縮短患者住院時間，減少廣譜抗生素的使用，進而減少耐藥菌產生[3]。傳統的病原體培養經濟，標本容易收集，但敏感性及特異性均較低，無法檢測非培養病原體，而且某些病原培養十分耗時或無法培養[4]。臨床工作中亟需新的檢測方法指導精準治療。
環介導恒溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是由Notomi等[5]于2000年首次報道的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，近年來越來越多的應用于下呼吸道病原體的檢測。該方法擴增效率可達1×109～1×1010個拷貝數量級，反應僅需1 h，擴增反應結果肉眼可辨。LAMP具有簡便、快捷、準確、廉價、易檢測等特點。基于此，LAMP技術可能有助于快速檢測呼吸道病原體，指導抗生素合理用藥。目前尚未見到關于LAMP方法檢測RICU患者呼吸道標本與患者預后關系的報道。因此，本研究通過回顧性分析應用LAMP技術檢測出的RICU患者的致病菌，結合患者的臨床特點及預后，分析LAMP技術對RICU抗感染治療的作用以及患者預后的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取2018年10月至2020年12月RICU應用LAMP技術檢測下呼吸道感染的患者，研究期間同一患者重復住院只納入第1次住院情況，不重復納入。呼吸道標本應為合格呼吸道深部痰液、氣道吸取物或支氣管鏡肺泡灌洗液。排除標準：（1）因非醫療因素導致住院時間超過100 d的患者；（2）診斷不明的患者。
1.2 方法
1.2.1 研究設計
基于LAMP技術的RICU患者下呼吸道標本的細菌檢測的回顧性研究。
1.2.2 研究方法
調查入組患者的臨床資料：（1）一般資料，包括住院號、性別、年齡、住院天數、吸煙狀況，是否有糖尿病、高血壓、冠心病、腦卒中等基礎疾病；（2）臨床指標，包括淋巴細胞數、血清白蛋白水平、超敏C反應蛋白（hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP）、降鈣素原（procalcitonin，PCT）、是否插管、是否應用限制級抗生素，限制級抗生素包括碳青霉烯類、替加環素、多粘菌素、糖肽類或利奈唑胺；（3）下呼吸道標本培養結果，包括是否培養出細菌，是否培養出多重耐藥菌，同一患者住院期間多次細菌培養中1次檢測結果陽性即列為結果陽性；（4）基于LAMP技術檢測的下呼吸道標本的結果，LAMP技術檢測的病原體共13種，包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、結核分枝桿菌復合群、肺炎支原體、肺炎衣原體同一患者住院期間多次檢測中1次檢測結果陽性即列為結果陽性，MRSA檢測患者的mecA耐藥基因，若mecA基因檢測陽性并且金黃色葡萄球菌檢測陽性則視為MRSA檢測陽性；（5）臨床結局，根據病程記錄將患者結局分為死亡、非死亡兩類。
1.3 統計學方法
采用SPSS 22.0統計軟件。將年齡、住院天數按中位數分為兩類，PCT、hs-CRP分為正常值范圍以下或正常值范圍以上，淋巴細胞數分為正常下限以下及正常范圍及以上，有血液系統疾病排除，血清白蛋白分為正常或正常范圍以下。分類變量使用頻數和百分比表示，不同臨床結局組的變量比較采用χ2檢驗（有理論數T<5或n<40，則用Fisher檢驗）。與患者死亡有合理關聯的協變量（P<0.05）進入模型，對有關暴露因素進行單因素分析和多因素條件Logistic回歸分析，計算比值比及其95%可信區間。檢驗水準α＝0.05。檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
本研究共納入符合標準的RICU患者117例，患者基本情況如表1所示。其中男90例（76.92%），女27例（23.08%）。年齡18～89歲，中位年齡為64歲，入住RICU的患者以老年人居多。中位住院天數為24 d（范圍2～93 d）。有吸煙史的有56例，無吸煙史61例。
表1
RICU下呼吸道感染患者死亡相關危險因素的單因素分析
2.2 臨床指標
在RICU，有慢性基礎疾病的患者比例為88.03%，合并有冠心病、糖尿病、腦卒中、高血壓慢性基礎疾病的比例分別為22.22%、24.79%、21.37%、43.59%（n=117）。在治療方面，使用過機械通氣輔助呼吸的患者比例為57.26%，使用限制級抗生素的比例高達87.18%（表1）。
2.3 下呼吸道標本檢測結果
在115例進行了下呼吸道標本培養的患者中，培養出細菌的患者數為45例（39.13%），培養出兩種或以上細菌的比例僅10例（8.70%）。其中，培養陽性的患者中多重耐藥菌、MRSA細菌比例分別占95.56%、6.67%（n=45）。培養陽性的細菌前4位分別為鮑曼不動桿菌（29例）、銅綠假單胞菌（12例）、肺炎克雷伯菌（11例）、金黃色葡萄球菌（3例），分別占總樣本的25.22%、10.43%、9.57%、2.61%。而117例患者中，用LAMP技術檢測陽性的病例數為85例（72.65%），而檢出2種或2種以上細菌的病例數為43例（36.75%），均明顯高于傳統培養方法。其中檢出最多的細菌前4位分別為鮑曼不動桿菌（47例）、肺炎克雷伯菌（40例）、銅綠假單胞菌（29例）、嗜麥芽窄食單胞菌（21例），分別占總人數的40.17%、34.19%、24.79%、17.95%（表2）。對傳統培養方法檢測出的細菌進行耐藥性分析，其中鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌全部為多重耐藥菌，鮑曼不動桿菌全部對碳青霉烯耐藥。
表2
LAMP技術檢測病原體結果與病原體培養結果比較
2.4 臨床結局
患者出院時的臨床結局分為死亡與非死亡，其中14例死亡（11.97%），103例患者未死亡（88.03%）。未死亡患者中，好轉或痊愈75例（72.82%，n=103），無好轉或惡化28例（27.18%，n=103）。其中年齡≥64歲的患者病死率為14.52%（9/62），<64歲患者病死率9.09%（5/55）。
2.5 死亡相關危險因素分析
單因素分析中，機械通氣（χ2=5.260，P=0.022）、患者用LAMP技術檢測病原菌2項或以上陽性（χ2=8.227，P=0.004）與患者的臨床結局有關（表1）。
將單因素方差分析具有統計學差異的機械通氣及LAMP技術檢出至少2種病原菌代入Logistic回歸進行多因素分析，結果患者病原菌核酸檢測至少檢出2種細菌有統計學意義，機械通氣無統計學意義。RICU患者LAMP方法至少檢出2種細菌的患者死亡風險是未檢出2種細菌患者死亡風險的4.789倍（P=0.027），95%可信區間為1.198～19.144（表3）。
表3
RICU下呼吸道感染患者死亡風險相關的多因素Logistic回歸分析
3 討論
隨著近年來耐藥菌逐漸增多、人口老齡化及免疫受損人群數量的增加，使得感染性疾病患者日益增多。雖然不斷有新的抗生素問世，肺炎的死亡率仍無明顯下降趨勢。據報道，2016年我國肺炎各年齡段標化死亡率分別為0.3/10萬（<35歲），5.5/10萬（35～65歲），以及241.8/10萬（≥65歲），高齡患者死亡率明顯升高[1]。肺炎死亡率無明顯下降的原因可能為感染的病原體難以明確。傳統的病原體培養、涂片方法因其局限性，可能導致病原學診斷延誤或無法確診，臨床有時難以實現精準治療，從而影響患者的療效和預后[6-7]。
根據全國細菌耐藥監測網監測的數據顯示，RICU中分離到的細菌前4位分別為鮑曼不動桿菌（25.8%）、銅綠假單胞菌（13.1%）、肺炎克雷伯菌（12.2%）、金黃色葡萄球菌（9.2%）。呼吸道痰標本或肺泡灌洗液標本檢測到的細菌前4位為肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌及肺炎鏈球菌[8]。在RICU中，培養出MRSA、耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌、耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌、產超廣譜β-內酰胺酶大腸桿菌、產超廣譜β-內酰胺酶肺炎克雷伯菌的檢出率分別為76.5%、20.1%、90.6%、64.2%、47.2%和43.0%[8]。本研究通過痰或肺泡灌洗液培養檢測到的細菌與報道基本一致。本研究中培養到的鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌均為多重耐藥菌，其中鮑曼不動桿菌對碳青霉烯均提示耐藥。可見重癥監護室中細菌耐藥嚴重，常規經驗性治療選用碳青霉烯類藥物存在治療失敗可能，必須充分完善病原學檢查以早期精準治療，以避免廣譜抗生素濫用。
本研究經過分析LAMP在下呼吸道標本中細菌檢測的應用，發現LAMP檢測陽性的患者數遠高于傳統培養，同時檢測出至少2種細菌患者比例更是明顯高于細菌培養至少2項細菌陽性的患者。LAMP技術反應全程可在恒定溫度（60～65 ℃）條件下實現靶核酸的高效擴增。采用4條引物（2條外引物，2條內引物）特異性的識別靶序列上6個區域，包括靶基因3’端的F3c、F2c和Fic區以及5’端的B1、B2和B3區，依靠具有高鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在65 ℃左右進行核酸的指數級擴增，靶序列的擴增產物在不到1 h便可累積到1×109拷貝[5]。同時，LAMP反應具有雙鏈DNA生成、單鏈環結構生成、焦磷酸離子生成、反應體系pH值降低及Mg2+濃度減少等多個反應特點，因此，其產物檢測除瓊脂糖凝膠電泳檢測外可兼容熒光檢測、化學發光檢測、濁度檢測、比色檢測及電化學檢測，選擇與設計靈活，是該技術應用廣泛的又一優勢[9]。利用LAMP技術來檢測易引發呼吸系統感染的常見病原體，所需設備步驟簡便；因在恒溫條件下擴增，對于中小醫院只需水浴鍋即可；結果可通過肉眼判斷；從痰液或肺泡灌洗液樣本中提取核酸到獲取最終結果，全過程僅需數小時，在時效性上明顯優于傳統痰培養檢測方法[10]。本研究總結了利用LAMP技術對RICU患者進行呼吸道病原體檢測的結果，發現LAMP檢測陽性率明顯高于傳統細菌培養方法。患者中用LAMP技術檢出至少2種細菌的比例為36.75%，而培養僅8.70%。相較于傳統病原體培養方法，LAMP技術可以更快捷、準確地檢出患者呼吸道感染的病原體。特別是多重細菌感染的患者，病原體培養方法往往只能培養出優勢菌群，LAMP則可以更全面地檢出致病菌群，指導患者精準的抗菌治療，避免廣譜抗生素的過度使用，進而減少耐藥菌的產生[4, 11-13]。
傳統培養方法檢測肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等陽性率極低，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌均為苛養菌，營養要求高，一般加送檢到接種時間不能超過30 min。而在臨床工作中，從患者留取標本至接種多超過30 min，因此苛養菌的培養陽性率不高[14]。嗜肺軍團菌屬于胞內寄生菌，傳統培養法操作繁瑣，培養鑒定周期長[15]。而LAMP檢測靈敏度高，肺炎鏈球菌、嗜肺軍團菌均有檢出，可以彌補傳統培養方法的不足。
本研究發現RICU中LAMP技術檢測出的細菌譜與傳統培養方法有所不同。LAMP技術檢出病原體陽性率最高的4種為鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和嗜麥芽窄食單胞菌。鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌為近年報道的RICU最常見的下呼吸道感染致病菌，與病原體培養結果接近。嗜麥芽窄食單胞菌是通過LAMP方法檢測出的與傳統培養方法差異較大的細菌。關于嗜麥芽窄食單胞菌的流行病學研究顯示嗜麥芽窄食單胞菌在近年檢出明顯增加，其中重癥監護室，包括心血管、血液、手術、外傷等科室的重癥監護室占比達47.49%[16-17]。使用頭孢菌素+酶抑制劑、碳青霉烯類和糖肽類是嗜麥芽窄食單胞菌醫院感染的獨立危險因素[18]。本RICU中嗜麥芽窄食單胞菌檢出多可能與抗生素的使用、部分患者為術后合并肺部感染有關。通過單因素分析，我們發現機械通氣、病原菌核酸檢測出2種細菌與患者的臨床結局有關。通過多因素Logistic回歸，進一步證實通過LAMP技術檢出兩種病原體，是提示患者死亡風險增高的重要因素。
當然，LAMP技術檢測除了快速、敏感、特異的優點，也有其不足之處，如假陽性率高，污染風險高，難于區分致病菌與定植菌，只能用于診斷常見和某些特殊病原體。本研究中，死亡患者數目較少，結論仍需進一步大樣本量的研究進一步驗證。
宏基因組高通量測序是近年來發展迅速的微生物檢測方式，其優勢是可無偏性覆蓋幾乎所有病原微生物，包括病毒、細菌、真菌等，甚至可以發現新病原，但目前存在的問題是檢測呼吸道標本的前處理、測序方法和生物信息分析技術無統一。與LAMP相比，宏基因組高通量測序所需工作流程復雜，價格昂貴，一般要3 d才能出報告，很難當天拿到結果，對于ICU重癥感染患者來說仍然顯得太慢[3, 19-20]。而基于LAMP技術的細菌檢測對環境要求低，技術設備相對簡單，操作簡單，成本低，可在各級醫院普及開展，尤其是其檢測速度非常快，可在短時間內進行，當天就可以出結果，操作簡單，對技術人員要求低。因此，LAMP相較宏基因組高通量測序更適合用于病原體的快速檢測，初始治療的藥物選擇依據。
綜上所述，LAMP技術檢測RICU患者呼吸道標本靈敏度高，可快速得到結果，有助于指導臨床精準治療，適合在各級醫院普及開展。通過LAMP技術檢測出至少2種下呼吸道病原體是RICU患者預后不佳的預測因素。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
