引用本文： 常立功, 田智丹, 谷偉, 鄒春芳. 介入肺臟病學中快速現場評價常見判斷陷阱與應用體會. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(6): 432-436. doi: 10.7507/1671-6205.202104058 復制
快速現場評價（Rapid On Site Evaluation，ROSE）使肺臟介入病學專家真正擁有病理維度并借此審視臨床。 ROSE 本質上屬于快速細胞病理學范疇，因此對染色細胞、微生物及染色背景的識別是 ROSE 判讀的核心，判讀的前提是規范的 ROSE 染色操作。本文通過介紹 ROSE 染色步驟和注意事項，同時匯總介入肺臟病學中 ROSE 常見的正常/腫瘤細胞類型和判斷陷阱，旨在盡可能地為非病理科 ROSE 同道提供細胞評價經驗并避免判斷陷阱，同時結合 ROSE 臨床實踐分析其具體應用與體會。
1 ROSE 起源與發展
ROSE 是對所獲標本進行現場制片和快速染色，依據形態學評價所獲標本類型和性質，旨在提高獲取標本質量和疾病診治效率的一種技術。ROSE 在介入肺臟病學中的應用最早可追溯到 1981 年[1]，隨后研究發現在肺穿刺或組織活檢過程中 ROSE 有助于提高疾病診斷率及準確性[2-4]；使用 ROSE 還能明顯減少活檢次數和操作相關并發癥[5]；在確定肺癌淋巴結分期方面，若 ROSE 確認 N3 區淋巴結轉移，則可避免其他區域淋巴結的穿刺。使用 ROSE 還可以減少肺癌診斷時間和花費[6]，由病理醫生參與的 ROSE 與組織病理一致率為 89.1%，無假陽性，假陰性為 4.8%～5.7%[7-8]，因此世界支氣管和介入肺臟病學聯盟在經支氣管鏡肺活檢術（TBLB）/經支氣管鏡針吸活檢術（TBNA）指南中推薦使用 ROSE。ROSE 的根基是對染色細胞和染色背景的識別，識別的前提是正確的 ROSE 操作和判讀。隨著 ROSE 應用的深入，有必要重新認識 ROSE 在臨床中的應用。
2 ROSE 材料與操作
2.1 ROSE 所需材料
顯微鏡及成像系統，Diff-Quik 染液，無菌生理鹽水，無菌載玻片，20 mL 無菌注射器針頭，吸水紙，計時器，鉛筆[9]。
2.2 ROSE 操作步驟
2.2.1 制片
標記患者信息于載玻片，將刷檢、TBNA、TBLB、胸腔鏡活檢組織、肺穿刺組織均勻薄涂成類圓形涂片。涂片時盡量清除水分，空氣風干 10 s。
2.2.2 染色
將載玻片染色端浸入 Diff-Quik 染液 A（主要成分是酸性曙紅和甲醇，使細胞質、膠原蛋白和肌肉組織著紅色）中 20～30 s；無菌生理鹽水浸洗，吸水紙清除多余水分；再浸入 Diff-Quik 染液 B（主要成分是堿性亞甲藍，使細胞核、真菌著藍色）中 20～30 s；無菌生理鹽水浸洗載玻片，拭干后顯微鏡下觀察。
2.2.3 觀察
先低倍后高倍，先觀察異常細胞后觀察正常細胞，從上到下，由左及右，20 s 左右完成閱片并將結果反饋至操作者，向操作者匯報閱片結果，若有惡性傾向，需進一步評估異型細胞所占比例，最后記錄閱片結果待組織病理回報后比對。
觀察時有以下注意事項：（1）Diff-Quik 染液不用時應密封防止溶劑揮發；（2）每個月紗布過濾或更新染液，減少染色背景；（3）可根據著色深淺調整染色時間以求最佳染色效果；（4）Diff-Quik 染液 A 液與 B 液均具有刺激性，染液 A 含有疊氮鈉，操作者應做好防護。
3 介入肺臟病學中 ROSE 判讀
介入肺臟病學涉及 ROSE 判讀的細胞主要來源是肺實質（各級氣管和肺泡）和肺間質（血管、淋巴結/管、結締組織、神經組織及間皮組織），后續內容也將圍繞這兩部分展開。
3.1 常見肺實質細胞
3.1.1 正常肺實質細胞
常見的肺實質細胞主要有黏膜層細胞（纖毛細胞、刷細胞、杯狀細胞、基底細胞和小顆粒細胞）、遠端氣道細胞（遠端氣道上皮和組織細胞）及肺泡細胞（成纖維細胞、巨噬細胞和Ⅰ/Ⅱ型肺泡上皮）[10-11]。纖毛細胞因其頂端標志性纖毛而具有較高識別度，其細胞核呈類圓形并有細膩的核仁，多見尾絲，纖毛細胞隨氣道延伸移行為遠端氣道上皮。ROSE 涂片中纖毛細胞多聚集出現，形態規整，其大小可作為衡量異型細胞的標尺。ROSE 涂片中另一類柱狀上皮細胞是刷細胞，其表面有微絨毛，占比較少，與纖毛細胞體積相當且常與纖毛細胞伴行出現。杯狀細胞因形似高腳杯而得名，可分泌黏液，細胞質淡染，多有偏心的細胞核，哮喘和慢性肺炎患者氣道黏膜可見增多的杯狀細胞。基底細胞具定向分化成纖毛細胞和杯狀細胞的潛能，因此其核漿比較大，呈類圓形且多成團出現，可有明顯核仁，易被誤認為是腫瘤細胞（圖 1）。
圖1
常見的近端氣道上皮細胞（Diff-Quik 400×）
可見典型的纖毛柱狀上皮細胞（紅箭）、刷細胞（黃箭）及基底細胞（綠箭），其見夾雜大量紅細胞（黑箭）。
肺泡中的纖維細胞多為梭形，多以細胞群出現，細胞核位于細胞短徑中央，核仁不明顯。Ⅰ型肺泡上皮細胞呈扁平狀，數量較少，較難觀察。Ⅱ型肺泡細胞屬立方上皮，形似“倒扣碗”狀，胞質較豐富，著色較均一。肺泡損傷可導致Ⅱ型肺泡上皮增生。巨噬細胞源于單核細胞，由于巨噬細胞多存在于肺泡中，因此常被用來評估取材部位和深部痰標本是否合格。巨噬細胞胞質淡染，胞質內含較多細小空泡，細胞膜不規則，吞噬灰塵顆粒后變為塵細胞。巨噬細胞吞噬過多紅細胞形成含鐵血黃素細胞，塵細胞和含鐵血黃素細胞的區別在于前者細胞背景有較多的灰塵顆粒，結合病史和氣管鏡下碳末沉積的黏膜表現不難對二者進行識別。組織細胞亦來自于血液中單核細胞，組織細胞可分化為類上皮細胞，類上皮細胞呈不規則“瘦長”型，多個類上皮細胞組成多核巨細胞，多核巨細胞可見于異物、病毒感染等代謝產物積累等情況，多核巨細胞進一步擴展形成肉芽。肉芽腫性疾病種類繁多，最常見的結核性肉芽腫多伴淋巴細胞浸潤和壞死背景，而結節病則有較少的淋巴細胞浸潤，無明顯壞死背景（圖 2）。
圖2
常見的遠端氣道上皮細胞（Diff-Quik 400×）
a. 增生的Ⅱ型肺泡上皮細胞；b. 類上皮細胞構成的肉芽腫；c. 多核巨細胞；d. 巨噬細胞。
3.1.2 常見的異常肺腫瘤細胞
根據臨床常見的腫瘤類型，本文重點介紹鱗癌、腺癌、小細胞肺癌等經典的腫瘤細胞辨別。由于鱗癌與腺癌均起源于細支氣管肺泡干細胞[12]，因此二者細胞核均較大（>3 個紅細胞），核漿比>1/2，染色質聚集形成較為明顯的核仁。分化較好的腺癌細胞體積增大，細胞核類圓形，一致性好，分泌活躍而導致胞質深染且易聚集成團，大小差異和擠壓程度不及鱗癌。腺癌血供豐富且易早期轉移，因此多紅細胞背景，有時 TBNA 更易獲得腺癌組織且更易評價。鱗癌分化較腺癌差。鱗癌細胞體積顯著增大且多伴角化，細胞核畸形明顯，差分化鱗癌可有裸核，淡染的胞質與濃染的細胞核形成“煎蛋樣”改變，惡性程度不同導致鱗癌細胞間有較大的體積差異。鱗癌血供不豐富易發生壞死，故細胞間的相互擠壓和壞死背景也是鱗癌特征。小細胞肺癌屬神經內分泌腫瘤，起源于胺前體攝取脫羧化細胞[13]，小細胞肺癌細胞體積并不小，其具有較大的細胞核，可有核仁，小細胞肺癌細胞分化最差，壞死常見，裸露的細胞核奇形怪狀且相互擠壓、疊加和鑲嵌，細胞間缺乏連接導致分散性較好，但其無細胞質保護且細胞核疏松，涂片過程較易導致核拉絲和過度聚集（圖 3）。
圖3
典型的腫瘸細胞（Diff-Quik 200×）
a. 高分化鱗癌細胞呈“煎蛋樣”，貧瘠/甚至缺如的胞漿和不規則的胞核；b. 高分泌狀腺癌，豐沛的胞漿、類圓形胞核和濃染的核仁；c. 差分化小細胞肺癌，無胞漿（裸核）、易碎（拉絲狀）和“丑陋”的胞核。
3.2 常見肺間質細胞
ROSE 可見的肺間質細胞主要包括紅細胞和有核細胞（淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞等）。紅細胞直徑約 7～9 μm，因其無核、胞漿淡染、雙凹面結構、絕少異型、聚集出現等特征導致其最易被辨別，常被作為 ROSE 的標尺細胞用于鑒別細胞良惡性。淋巴細胞是最常見的有核血液系統細胞。正常淋巴細胞與紅細胞大小相當，細胞漿較少且有深染的胞核。淋巴細胞可分化為 B 淋巴細胞時，開始出現淡藍的胞漿，淡藍色胞漿進一步增加則是 B 淋巴細胞分化為成熟漿細胞。單核細胞體積是與 2 個紅細胞相當。單核細胞的細胞核不規則，細胞核無分頁且易偏心于胞質一側，核漿比較高但細胞體積不大。最重要的是，由于單核細胞需要經由毛細血管間隙變形進入組織，因此其細胞核常畸形扭曲，這與類圓的細胞膜形成鮮明對比。進入組織后單核細胞可分化為巨噬細胞和組織細胞等。中性粒細胞體積約是紅細胞的 2 倍，其易聚集出現的特性和典型的核分頁使其易于辨別。淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞是感染超家族成員，三者出現最常見的原因就是感染。嗜酸粒細胞盡管較少出現，但它的出現的臨床意義較。嗜酸粒細胞大小與形態均與中性粒細胞相當，前者多 2 個核分頁，后者多 3 個核分頁，關鍵的鑒別在于嗜酸粒細胞胞質內含有嗜酸性顆粒，ROSE 可見嗜酸粒細胞胞質內點狀分布的紅染的嗜酸顆粒（圖 4）。
圖4
典型感染性組織的 ROSE 表現（Diff-Quik 200×）
可見各分化階段的中性粒細胞，呈彌漫、分頁狀。
4 介入肺臟病學中快速現場評價常見判斷陷阱
4.1 基底細胞與異型細胞
初學者較易將基底細胞誤判做腺癌。基底細胞作為儲備細胞，具有一定分化潛能，基底細胞多聚集出現，多呈葡萄狀平鋪于視野，較高的核漿比和類圓形結構使其較易誤判為腺癌。鑒別要點在于正常基底細胞的體積僅較紅細胞稍大，基底細胞雖聚集出現但細胞間無競爭性和擠壓性生長傾向，細胞大小均一，而多數腺癌細胞體積多大于 3 個紅細胞，腺癌細胞間體積差異較大并呈競爭性生長。需要注意的是，當基底細胞增生時其體積可倍增，其與腺癌的鑒別難度將陡增，根據腺癌類圓形、小病灶大轉移以及其他臨床影像學資料可協診。早期浸潤腺癌由于生長微環境優越，導致其分化較好，較均勻的類圓形胞體極具迷惑性，判讀者較難定論其惡行性，但其增粗的染色質和影像學改變均有助于其惡行性的判讀（圖 5a、b）。
圖5
典型的 ROSE 識別“陷阱”（Diff-Quik 200×）
a. 高分化腺癌呈葡萄狀，深染且大小均一，但較背景紅細胞大 2～3 倍；b. 密集的基底細胞，其胞核與紅細胞、刷細胞相當；c. 淡染的成纖維細胞，有方向性、結構稍緊密、整體“飄逸”；d. TBNA 涂片，示激活的 T 淋巴細胞（紅箭），胞質疏松，整體圓形，背景可見正常淋巴細胞（黃箭）和激活的 B 淋巴細胞（藍箭）；e. 柱狀上皮化生鱗狀_上皮，細胞整體魚鱗狀，細胞漿均勻染色，細胞核類圓形且大小均一，位于細胞中心，整體“面善”。
4.2 成纖維細胞與異型細胞
成纖維細胞多出現在肺損傷修復期，在過度修復的肺損傷過程中，過多的成纖維細胞進入肺泡中分化成纖維細胞從而構成 Masson 小體[14]。成纖維細胞體積與腫瘤細胞相當或更大，核漿深染，偶可見到濃聚的核仁。當成纖維細胞增生成團聚集的情況下實難與腫瘤細胞鑒別，但成纖維細胞整體修長（似梭形）、核漿比不高、無擠壓式生長、相對整潔的細胞背景仍暗示其無惡性潛能（圖5 c）。
4.3 激活的淋巴細胞與異型細胞
在 TBNA 過程中最常見的判讀陷阱是激活的淋巴細胞。淋巴細胞受協同刺激分子刺激后被激活，激活的淋巴細胞體積為紅細胞的 2～3 倍，且核漿比可>1/2，多成團出現，核漿比>1/2，多具有淡染的細胞漿，極易與腫瘤細胞混淆，但其細胞核著色較淺、染色質疏松、罕見的染色質濃聚及較好的分散度仍暗示其良性本質。需要注意的是當大量原始淋巴細胞（細胞體積>3 個紅細胞，核漿比>1/2）聚集需警惕淋巴瘤與神經系統腫瘤（圖 5d）。
4.4 鱗狀上皮惡性病變過程
鱗狀上皮化生是另外一個需要鑒別的陷阱。正常氣道上皮細胞對病原體、放化療、氣道內燒傷、微環境改變的反應可導致鱗狀上皮化生[15]。鱗狀上皮化生不能一概被認為是癌前病變。輕度鱗狀上皮化生主要表現為多邊形平鋪或卷曲的細胞類型，細胞間連接尚緊密，細胞質著色較淺，細胞核橢圓形著色較深，核漿比不高，染色質聚集不明顯，較易得出良性判斷。但鱗狀上皮化生可發展為不典型增生甚至低/高級別上皮內瘤變，其最主要的變化在于核漿比逐漸增加，染色質逐漸增粗，直至顯著的核異型增生，細胞核大于 3 個紅細胞，“煎蛋樣”著色，細胞排列紊亂（圖 5e）。
5 ROSE 的應用體會
ROSE 屬于快速細胞病理學范疇，其核心是快速評價并實時反饋，初學者可經短期學習掌握經典細胞類型、微生物類型和細胞背景的判讀，但需要經歷較長的學習曲線才能較好地運用 ROSE，特別是在初始階段受挫后需要更大的勇氣繼續 ROSE 判讀。ROSE 協助介入肺臟病學取到真正的足夠多的病變組織以滿足后續診治，對于直視病灶或由影像引導（EBUS-TBNA/GS、CT 引導肺穿刺及虛擬導航）取材的病灶，ROSE 可對所獲標本中有診斷意義部分進行評估并指導送檢。對于不可直視病灶取材操作（TBLB/TBNA），ROSE 的作用將更加凸顯，特別對高難度或高風險的活檢，或者在患者不耐受等意外情況下，ROSE 可讓操作者從容停止操作而非繼續冒險取材，ROSE 的應用既降低操作風險又能協助診斷。另外，根據 ROSE 結果可以提前分流患者，從而降低患者住院天數和花費，提高收治效能。ROSE 讓臨床醫生便擁有了病理學維度，然而 ROSE 發揮以上作用的前提是正確判讀，只有降低誤判，才能使 ROSE 獲益于臨床和患者。
近年來，呼吸介入的高精尖設備越來越多，患者負擔越來越重，呼吸介入醫師取材壓力越來越大。ROSE 能減輕取材壓力，特別是在腫瘤性疾病方面，病灶取材與定性難度越大，ROSE 作用越強。不容回避的是，ROSE 也有其適應證，并非所有病灶都需要 ROSE 協助診斷，或者說 ROSE 在某些病灶取材過程中作用不大。對于嫻熟的介入肺臟病學專家來說，ROSE 僅是錦上添花，因為他們有其他判斷取材的方法和技巧。另外，從病理學角度看，ROSE 僅觀察二維平面的細胞學改變，缺乏對立體的組織學結構進行評估。目前各呼吸介入中心 ROSE 水平參差不齊，ROSE 入門不難，但想擁有高水平的判讀能力，就要耗費漫長的時間和精力，只有這樣才能避免只把 ROSE 當做噱頭，而無切實應用的尷尬局面。因此，要分門別類、不偏不倚地評估 ROSE 作用。
在進行 ROSE 臨床實踐中，我們曾遇到兩個問題，一是不能出具公認報告，二是無法收費。首先 ROSE 目的是評估活檢組織是否達到臨床要求，ROSE 的核心是“實時反饋”，而非獲得出具公認報告這一“名分”。既然 ROSE 能夠幫助獲得足夠多的病變組織并指導標本送檢，能否出具公認報告便不那么重要。關于第二個問題，ROSE 涂片材料成本較低，科室完全可以負擔；另外，ROSE 帶來的效益遠大于成本，例如 ROSE 可降低患者二次檢查風險、減少操作時間、減輕患者痛苦、增加呼吸介入初學者信心、增強呼吸介入團隊凝聚力、提升本單位呼吸介入綜合水平等，因此有無收費條目也顯的不那么重要。隨著醫療政策的完善，相信這兩個問題都能得到解決。筆者堅持實用主義原則，若某技術利于臨床和患者，那么該技術就應開展，因此我科將 ROSE 常規應用于氣管鏡、肺穿刺、胸腔鏡及二次活檢標本的質控中，并已從中獲益。
本文局限于對惡性腫瘤的判讀，但頂級的 ROSE 判讀者已將其應用在感染性疾病以及非腫瘤非感染性疾病中。特別是在傳統的病原學檢測已經無法滿足現實臨床需要情況下，很有必要發掘新的病原學檢測模式。ROSE 不僅能指導獲取反映疾病原貌的病灶組織，而且還能初步區分感染類型并指導后續送檢和診治方向，協助患者快速分流，這些作用均為發展新的病原學檢測模式提供契機。例如我們的臨床實踐中，若 ROSE 證實穿刺組織或肺/淋巴結內有肉芽腫及無定型壞死物，我們會加送抗酸染色；另外，若 ROSE 證實為細菌/病毒/真菌等感染性疾病，可直接送活檢組織行二代測序（NGS）檢測，并限定重點檢測范圍，這樣既可增加 NGS 檢出陽性率，又可以減少患者檢查費用。最后需要強調的是，任何精妙的介入肺臟病學操作和高水平的 ROSE 判讀都離不開對患者臨床信息的研讀，在病理醫生缺位的情況下，臨床醫生應當充分利用掌握臨床信息這一絕佳優勢并承擔 ROSE 判讀的工作。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
快速現場評價（Rapid On Site Evaluation，ROSE）使肺臟介入病學專家真正擁有病理維度并借此審視臨床。 ROSE 本質上屬于快速細胞病理學范疇，因此對染色細胞、微生物及染色背景的識別是 ROSE 判讀的核心，判讀的前提是規范的 ROSE 染色操作。本文通過介紹 ROSE 染色步驟和注意事項，同時匯總介入肺臟病學中 ROSE 常見的正常/腫瘤細胞類型和判斷陷阱，旨在盡可能地為非病理科 ROSE 同道提供細胞評價經驗并避免判斷陷阱，同時結合 ROSE 臨床實踐分析其具體應用與體會。
1 ROSE 起源與發展
ROSE 是對所獲標本進行現場制片和快速染色，依據形態學評價所獲標本類型和性質，旨在提高獲取標本質量和疾病診治效率的一種技術。ROSE 在介入肺臟病學中的應用最早可追溯到 1981 年[1]，隨后研究發現在肺穿刺或組織活檢過程中 ROSE 有助于提高疾病診斷率及準確性[2-4]；使用 ROSE 還能明顯減少活檢次數和操作相關并發癥[5]；在確定肺癌淋巴結分期方面，若 ROSE 確認 N3 區淋巴結轉移，則可避免其他區域淋巴結的穿刺。使用 ROSE 還可以減少肺癌診斷時間和花費[6]，由病理醫生參與的 ROSE 與組織病理一致率為 89.1%，無假陽性，假陰性為 4.8%～5.7%[7-8]，因此世界支氣管和介入肺臟病學聯盟在經支氣管鏡肺活檢術（TBLB）/經支氣管鏡針吸活檢術（TBNA）指南中推薦使用 ROSE。ROSE 的根基是對染色細胞和染色背景的識別，識別的前提是正確的 ROSE 操作和判讀。隨著 ROSE 應用的深入，有必要重新認識 ROSE 在臨床中的應用。
2 ROSE 材料與操作
2.1 ROSE 所需材料
顯微鏡及成像系統，Diff-Quik 染液，無菌生理鹽水，無菌載玻片，20 mL 無菌注射器針頭，吸水紙，計時器，鉛筆[9]。
2.2 ROSE 操作步驟
2.2.1 制片
標記患者信息于載玻片，將刷檢、TBNA、TBLB、胸腔鏡活檢組織、肺穿刺組織均勻薄涂成類圓形涂片。涂片時盡量清除水分，空氣風干 10 s。
2.2.2 染色
將載玻片染色端浸入 Diff-Quik 染液 A（主要成分是酸性曙紅和甲醇，使細胞質、膠原蛋白和肌肉組織著紅色）中 20～30 s；無菌生理鹽水浸洗，吸水紙清除多余水分；再浸入 Diff-Quik 染液 B（主要成分是堿性亞甲藍，使細胞核、真菌著藍色）中 20～30 s；無菌生理鹽水浸洗載玻片，拭干后顯微鏡下觀察。
2.2.3 觀察
先低倍后高倍，先觀察異常細胞后觀察正常細胞，從上到下，由左及右，20 s 左右完成閱片并將結果反饋至操作者，向操作者匯報閱片結果，若有惡性傾向，需進一步評估異型細胞所占比例，最后記錄閱片結果待組織病理回報后比對。
觀察時有以下注意事項：（1）Diff-Quik 染液不用時應密封防止溶劑揮發；（2）每個月紗布過濾或更新染液，減少染色背景；（3）可根據著色深淺調整染色時間以求最佳染色效果；（4）Diff-Quik 染液 A 液與 B 液均具有刺激性，染液 A 含有疊氮鈉，操作者應做好防護。
3 介入肺臟病學中 ROSE 判讀
介入肺臟病學涉及 ROSE 判讀的細胞主要來源是肺實質（各級氣管和肺泡）和肺間質（血管、淋巴結/管、結締組織、神經組織及間皮組織），后續內容也將圍繞這兩部分展開。
3.1 常見肺實質細胞
3.1.1 正常肺實質細胞
常見的肺實質細胞主要有黏膜層細胞（纖毛細胞、刷細胞、杯狀細胞、基底細胞和小顆粒細胞）、遠端氣道細胞（遠端氣道上皮和組織細胞）及肺泡細胞（成纖維細胞、巨噬細胞和Ⅰ/Ⅱ型肺泡上皮）[10-11]。纖毛細胞因其頂端標志性纖毛而具有較高識別度，其細胞核呈類圓形并有細膩的核仁，多見尾絲，纖毛細胞隨氣道延伸移行為遠端氣道上皮。ROSE 涂片中纖毛細胞多聚集出現，形態規整，其大小可作為衡量異型細胞的標尺。ROSE 涂片中另一類柱狀上皮細胞是刷細胞，其表面有微絨毛，占比較少，與纖毛細胞體積相當且常與纖毛細胞伴行出現。杯狀細胞因形似高腳杯而得名，可分泌黏液，細胞質淡染，多有偏心的細胞核，哮喘和慢性肺炎患者氣道黏膜可見增多的杯狀細胞。基底細胞具定向分化成纖毛細胞和杯狀細胞的潛能，因此其核漿比較大，呈類圓形且多成團出現，可有明顯核仁，易被誤認為是腫瘤細胞（圖 1）。
圖1
常見的近端氣道上皮細胞（Diff-Quik 400×）
可見典型的纖毛柱狀上皮細胞（紅箭）、刷細胞（黃箭）及基底細胞（綠箭），其見夾雜大量紅細胞（黑箭）。
肺泡中的纖維細胞多為梭形，多以細胞群出現，細胞核位于細胞短徑中央，核仁不明顯。Ⅰ型肺泡上皮細胞呈扁平狀，數量較少，較難觀察。Ⅱ型肺泡細胞屬立方上皮，形似“倒扣碗”狀，胞質較豐富，著色較均一。肺泡損傷可導致Ⅱ型肺泡上皮增生。巨噬細胞源于單核細胞，由于巨噬細胞多存在于肺泡中，因此常被用來評估取材部位和深部痰標本是否合格。巨噬細胞胞質淡染，胞質內含較多細小空泡，細胞膜不規則，吞噬灰塵顆粒后變為塵細胞。巨噬細胞吞噬過多紅細胞形成含鐵血黃素細胞，塵細胞和含鐵血黃素細胞的區別在于前者細胞背景有較多的灰塵顆粒，結合病史和氣管鏡下碳末沉積的黏膜表現不難對二者進行識別。組織細胞亦來自于血液中單核細胞，組織細胞可分化為類上皮細胞，類上皮細胞呈不規則“瘦長”型，多個類上皮細胞組成多核巨細胞，多核巨細胞可見于異物、病毒感染等代謝產物積累等情況，多核巨細胞進一步擴展形成肉芽。肉芽腫性疾病種類繁多，最常見的結核性肉芽腫多伴淋巴細胞浸潤和壞死背景，而結節病則有較少的淋巴細胞浸潤，無明顯壞死背景（圖 2）。
圖2
常見的遠端氣道上皮細胞（Diff-Quik 400×）
a. 增生的Ⅱ型肺泡上皮細胞；b. 類上皮細胞構成的肉芽腫；c. 多核巨細胞；d. 巨噬細胞。
3.1.2 常見的異常肺腫瘤細胞
根據臨床常見的腫瘤類型，本文重點介紹鱗癌、腺癌、小細胞肺癌等經典的腫瘤細胞辨別。由于鱗癌與腺癌均起源于細支氣管肺泡干細胞[12]，因此二者細胞核均較大（>3 個紅細胞），核漿比>1/2，染色質聚集形成較為明顯的核仁。分化較好的腺癌細胞體積增大，細胞核類圓形，一致性好，分泌活躍而導致胞質深染且易聚集成團，大小差異和擠壓程度不及鱗癌。腺癌血供豐富且易早期轉移，因此多紅細胞背景，有時 TBNA 更易獲得腺癌組織且更易評價。鱗癌分化較腺癌差。鱗癌細胞體積顯著增大且多伴角化，細胞核畸形明顯，差分化鱗癌可有裸核，淡染的胞質與濃染的細胞核形成“煎蛋樣”改變，惡性程度不同導致鱗癌細胞間有較大的體積差異。鱗癌血供不豐富易發生壞死，故細胞間的相互擠壓和壞死背景也是鱗癌特征。小細胞肺癌屬神經內分泌腫瘤，起源于胺前體攝取脫羧化細胞[13]，小細胞肺癌細胞體積并不小，其具有較大的細胞核，可有核仁，小細胞肺癌細胞分化最差，壞死常見，裸露的細胞核奇形怪狀且相互擠壓、疊加和鑲嵌，細胞間缺乏連接導致分散性較好，但其無細胞質保護且細胞核疏松，涂片過程較易導致核拉絲和過度聚集（圖 3）。
圖3
典型的腫瘸細胞（Diff-Quik 200×）
a. 高分化鱗癌細胞呈“煎蛋樣”，貧瘠/甚至缺如的胞漿和不規則的胞核；b. 高分泌狀腺癌，豐沛的胞漿、類圓形胞核和濃染的核仁；c. 差分化小細胞肺癌，無胞漿（裸核）、易碎（拉絲狀）和“丑陋”的胞核。
3.2 常見肺間質細胞
ROSE 可見的肺間質細胞主要包括紅細胞和有核細胞（淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞、嗜酸粒細胞等）。紅細胞直徑約 7～9 μm，因其無核、胞漿淡染、雙凹面結構、絕少異型、聚集出現等特征導致其最易被辨別，常被作為 ROSE 的標尺細胞用于鑒別細胞良惡性。淋巴細胞是最常見的有核血液系統細胞。正常淋巴細胞與紅細胞大小相當，細胞漿較少且有深染的胞核。淋巴細胞可分化為 B 淋巴細胞時，開始出現淡藍的胞漿，淡藍色胞漿進一步增加則是 B 淋巴細胞分化為成熟漿細胞。單核細胞體積是與 2 個紅細胞相當。單核細胞的細胞核不規則，細胞核無分頁且易偏心于胞質一側，核漿比較高但細胞體積不大。最重要的是，由于單核細胞需要經由毛細血管間隙變形進入組織，因此其細胞核常畸形扭曲，這與類圓的細胞膜形成鮮明對比。進入組織后單核細胞可分化為巨噬細胞和組織細胞等。中性粒細胞體積約是紅細胞的 2 倍，其易聚集出現的特性和典型的核分頁使其易于辨別。淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞是感染超家族成員，三者出現最常見的原因就是感染。嗜酸粒細胞盡管較少出現，但它的出現的臨床意義較。嗜酸粒細胞大小與形態均與中性粒細胞相當，前者多 2 個核分頁，后者多 3 個核分頁，關鍵的鑒別在于嗜酸粒細胞胞質內含有嗜酸性顆粒，ROSE 可見嗜酸粒細胞胞質內點狀分布的紅染的嗜酸顆粒（圖 4）。
圖4
典型感染性組織的 ROSE 表現（Diff-Quik 200×）
可見各分化階段的中性粒細胞，呈彌漫、分頁狀。
4 介入肺臟病學中快速現場評價常見判斷陷阱
4.1 基底細胞與異型細胞
初學者較易將基底細胞誤判做腺癌。基底細胞作為儲備細胞，具有一定分化潛能，基底細胞多聚集出現，多呈葡萄狀平鋪于視野，較高的核漿比和類圓形結構使其較易誤判為腺癌。鑒別要點在于正常基底細胞的體積僅較紅細胞稍大，基底細胞雖聚集出現但細胞間無競爭性和擠壓性生長傾向，細胞大小均一，而多數腺癌細胞體積多大于 3 個紅細胞，腺癌細胞間體積差異較大并呈競爭性生長。需要注意的是，當基底細胞增生時其體積可倍增，其與腺癌的鑒別難度將陡增，根據腺癌類圓形、小病灶大轉移以及其他臨床影像學資料可協診。早期浸潤腺癌由于生長微環境優越，導致其分化較好，較均勻的類圓形胞體極具迷惑性，判讀者較難定論其惡行性，但其增粗的染色質和影像學改變均有助于其惡行性的判讀（圖 5a、b）。
圖5
典型的 ROSE 識別“陷阱”（Diff-Quik 200×）
a. 高分化腺癌呈葡萄狀，深染且大小均一，但較背景紅細胞大 2～3 倍；b. 密集的基底細胞，其胞核與紅細胞、刷細胞相當；c. 淡染的成纖維細胞，有方向性、結構稍緊密、整體“飄逸”；d. TBNA 涂片，示激活的 T 淋巴細胞（紅箭），胞質疏松，整體圓形，背景可見正常淋巴細胞（黃箭）和激活的 B 淋巴細胞（藍箭）；e. 柱狀上皮化生鱗狀_上皮，細胞整體魚鱗狀，細胞漿均勻染色，細胞核類圓形且大小均一，位于細胞中心，整體“面善”。
4.2 成纖維細胞與異型細胞
成纖維細胞多出現在肺損傷修復期，在過度修復的肺損傷過程中，過多的成纖維細胞進入肺泡中分化成纖維細胞從而構成 Masson 小體[14]。成纖維細胞體積與腫瘤細胞相當或更大，核漿深染，偶可見到濃聚的核仁。當成纖維細胞增生成團聚集的情況下實難與腫瘤細胞鑒別，但成纖維細胞整體修長（似梭形）、核漿比不高、無擠壓式生長、相對整潔的細胞背景仍暗示其無惡性潛能（圖5 c）。
4.3 激活的淋巴細胞與異型細胞
在 TBNA 過程中最常見的判讀陷阱是激活的淋巴細胞。淋巴細胞受協同刺激分子刺激后被激活，激活的淋巴細胞體積為紅細胞的 2～3 倍，且核漿比可>1/2，多成團出現，核漿比>1/2，多具有淡染的細胞漿，極易與腫瘤細胞混淆，但其細胞核著色較淺、染色質疏松、罕見的染色質濃聚及較好的分散度仍暗示其良性本質。需要注意的是當大量原始淋巴細胞（細胞體積>3 個紅細胞，核漿比>1/2）聚集需警惕淋巴瘤與神經系統腫瘤（圖 5d）。
4.4 鱗狀上皮惡性病變過程
鱗狀上皮化生是另外一個需要鑒別的陷阱。正常氣道上皮細胞對病原體、放化療、氣道內燒傷、微環境改變的反應可導致鱗狀上皮化生[15]。鱗狀上皮化生不能一概被認為是癌前病變。輕度鱗狀上皮化生主要表現為多邊形平鋪或卷曲的細胞類型，細胞間連接尚緊密，細胞質著色較淺，細胞核橢圓形著色較深，核漿比不高，染色質聚集不明顯，較易得出良性判斷。但鱗狀上皮化生可發展為不典型增生甚至低/高級別上皮內瘤變，其最主要的變化在于核漿比逐漸增加，染色質逐漸增粗，直至顯著的核異型增生，細胞核大于 3 個紅細胞，“煎蛋樣”著色，細胞排列紊亂（圖 5e）。
5 ROSE 的應用體會
ROSE 屬于快速細胞病理學范疇，其核心是快速評價并實時反饋，初學者可經短期學習掌握經典細胞類型、微生物類型和細胞背景的判讀，但需要經歷較長的學習曲線才能較好地運用 ROSE，特別是在初始階段受挫后需要更大的勇氣繼續 ROSE 判讀。ROSE 協助介入肺臟病學取到真正的足夠多的病變組織以滿足后續診治，對于直視病灶或由影像引導（EBUS-TBNA/GS、CT 引導肺穿刺及虛擬導航）取材的病灶，ROSE 可對所獲標本中有診斷意義部分進行評估并指導送檢。對于不可直視病灶取材操作（TBLB/TBNA），ROSE 的作用將更加凸顯，特別對高難度或高風險的活檢，或者在患者不耐受等意外情況下，ROSE 可讓操作者從容停止操作而非繼續冒險取材，ROSE 的應用既降低操作風險又能協助診斷。另外，根據 ROSE 結果可以提前分流患者，從而降低患者住院天數和花費，提高收治效能。ROSE 讓臨床醫生便擁有了病理學維度，然而 ROSE 發揮以上作用的前提是正確判讀，只有降低誤判，才能使 ROSE 獲益于臨床和患者。
近年來，呼吸介入的高精尖設備越來越多，患者負擔越來越重，呼吸介入醫師取材壓力越來越大。ROSE 能減輕取材壓力，特別是在腫瘤性疾病方面，病灶取材與定性難度越大，ROSE 作用越強。不容回避的是，ROSE 也有其適應證，并非所有病灶都需要 ROSE 協助診斷，或者說 ROSE 在某些病灶取材過程中作用不大。對于嫻熟的介入肺臟病學專家來說，ROSE 僅是錦上添花，因為他們有其他判斷取材的方法和技巧。另外，從病理學角度看，ROSE 僅觀察二維平面的細胞學改變，缺乏對立體的組織學結構進行評估。目前各呼吸介入中心 ROSE 水平參差不齊，ROSE 入門不難，但想擁有高水平的判讀能力，就要耗費漫長的時間和精力，只有這樣才能避免只把 ROSE 當做噱頭，而無切實應用的尷尬局面。因此，要分門別類、不偏不倚地評估 ROSE 作用。
在進行 ROSE 臨床實踐中，我們曾遇到兩個問題，一是不能出具公認報告，二是無法收費。首先 ROSE 目的是評估活檢組織是否達到臨床要求，ROSE 的核心是“實時反饋”，而非獲得出具公認報告這一“名分”。既然 ROSE 能夠幫助獲得足夠多的病變組織并指導標本送檢，能否出具公認報告便不那么重要。關于第二個問題，ROSE 涂片材料成本較低，科室完全可以負擔；另外，ROSE 帶來的效益遠大于成本，例如 ROSE 可降低患者二次檢查風險、減少操作時間、減輕患者痛苦、增加呼吸介入初學者信心、增強呼吸介入團隊凝聚力、提升本單位呼吸介入綜合水平等，因此有無收費條目也顯的不那么重要。隨著醫療政策的完善，相信這兩個問題都能得到解決。筆者堅持實用主義原則，若某技術利于臨床和患者，那么該技術就應開展，因此我科將 ROSE 常規應用于氣管鏡、肺穿刺、胸腔鏡及二次活檢標本的質控中，并已從中獲益。
本文局限于對惡性腫瘤的判讀，但頂級的 ROSE 判讀者已將其應用在感染性疾病以及非腫瘤非感染性疾病中。特別是在傳統的病原學檢測已經無法滿足現實臨床需要情況下，很有必要發掘新的病原學檢測模式。ROSE 不僅能指導獲取反映疾病原貌的病灶組織，而且還能初步區分感染類型并指導后續送檢和診治方向，協助患者快速分流，這些作用均為發展新的病原學檢測模式提供契機。例如我們的臨床實踐中，若 ROSE 證實穿刺組織或肺/淋巴結內有肉芽腫及無定型壞死物，我們會加送抗酸染色；另外，若 ROSE 證實為細菌/病毒/真菌等感染性疾病，可直接送活檢組織行二代測序（NGS）檢測，并限定重點檢測范圍，這樣既可增加 NGS 檢出陽性率，又可以減少患者檢查費用。最后需要強調的是，任何精妙的介入肺臟病學操作和高水平的 ROSE 判讀都離不開對患者臨床信息的研讀，在病理醫生缺位的情況下，臨床醫生應當充分利用掌握臨床信息這一絕佳優勢并承擔 ROSE 判讀的工作。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
