引用本文： 沈軼, 潘雁, 尹成勝, 李鋒, 周文勇, 潘旭峰, 陳宇清, 張海. 二代測序診斷肺移植后耶氏肺孢子菌肺炎二例并文獻復習. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(7): 479-486. doi: 10.7507/1671-6205.202104007 復制
耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）是一種免疫抑制患者中主要的機會性感染，20 世紀 80 年代隨著人類免疫缺陷病毒（HIV）的出現，耶氏肺孢子菌肺炎（PCP）的患病率顯著增加。由于抗逆轉錄病毒治療和預防治療的介入，HIV 感染患者 PCP 的發病率和致死率獲得明顯下降，然而在非 HIV 感染的免疫缺陷患者中 PCP 的發病率卻在逐漸增加[1-3]。在此我們報道 2 例常規檢測手段陰性，而二代測序（NGS）確診耶氏肺孢子菌感染的臨床病例，同時匯總肺移植患者 PCP 診斷治療的文獻復習。
1 臨床資料
1.1 病例一
患者男，48 歲，2019 年 4 月 26 日因“特發性肺纖維化、呼吸衰竭”于上海市胸科醫院行雙肺移植術，術后恢復良好。2020 年 2 月 24 日出現發熱，體溫 37.8 ℃，持續 3 d，未處理；2 月 27 日起先后自服莫西沙星 400 mg 1 次/d（qd），連續 4 d，左氧氟沙星 500 mg qd，連續 4 d，未見明顯好轉；3 月 9 日出現腹痛、低熱、嘔吐、低氧（指尖氧飽和度 92%～94%），3 月 12 日來我院就診，收治入院。查體：神志清，精神差，活動后氣促，左肺聞及濕性啰音。心率 108 次/min，律齊，雙下肢無浮腫，體溫 36.8 ℃，血壓 138/80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），呼吸頻率 24 次/min。輔助檢查：3 月 12 日肺部 CT 提示肺移植術后，兩肺浸潤影，兩肺門軟組織增厚；心臟超聲提示二尖瓣輕度反流，肺動脈收縮壓約 34 mm Hg，左室射血分數 63%，心臟大小正常。血常規：白細胞計數 4.8×109/L，中性粒細胞百分比 44.3%，血小板計數 350×109/L，血紅蛋白 115 g/L，C 反應蛋白 75.15 mg/L，紅細胞沉降率 96 mm/1 h，乳酸脫氫酶（LDH）340 U/L，降鈣素原（PCT）0.06 ng/mL，血真菌（1-3）-β-D-葡聚糖（BDG）136 pg/mL；T 淋巴細胞 CD3+ 93.6%↑，輔助性 T 細胞 CD3+CD4+ 23.7%↓，細胞毒性 T 細胞 CD3+CD8+ 63.2%↑，CD4+/CD8+ 比值 0.4↓，B 淋巴細胞 CD3–CD19+ 2.5%↓，自然殺傷細胞 CD3–CD16+CD56+ 3.8%↓。
患者肺移植后一直維持口服抗排異藥物：嗎替麥考酚酯（商品名驍悉）1 g 1 次/12 h（q12h），他克莫司（FK506）2 mg q12h，強的松 5 mg 1 次/2 d。入院時 FK506 谷濃度 12.1 ng/mL。入院診斷為：肺移植術后，肺部感染。3 月 12 日予以美羅培南 1 g 1 次/8 h（q8h），伏立康唑 200 mg q12h，更昔洛韋 250 mg q12h 抗感染治療，同時予以吸氧、化痰、霧化對癥處理。因患者低氧不能耐受纖支鏡檢查，未取得支氣管肺泡灌洗液（BALF），遂取痰標本送 NGS 檢測，3 月 14 日痰 NGS 送檢結果報告未發現寄生蟲和分枝桿菌，主要致病微生物為耶氏肺孢子菌和人類 β 皰疹病毒 5 型，檢出序列數分別為 10914 和 1873，細菌結果考慮為口腔定植菌，其他微生物結果因序列數較低，亦不考慮為致病菌（表 1）。3 月 16 日加用復方磺胺甲基異噁唑（TMP/SMZ）1920 mg q8h 和卡泊芬凈（首劑 70 mg，維持 50 mg qd）抗 PCP 治療，繼續美羅培南抗細菌和更昔洛韋抗病毒治療。患者服用 TMP/SMZ 后出現嚴重胃腸道不良反應，嘔吐劇烈，不能進食，無法足量服用 TMP/SMZ。3 月 18 日復查胸部 CT，提示患者肺部感染較前加重（圖 1a、b），停用美羅培南，加用利奈唑胺 600 mg q12h 和頭孢美唑 2 g q12h，兩性霉素脂質體 10 mg q12h 霧化吸入，甲強龍 40 mg qd，同時維持卡泊芬凈。3 月 21 日測定患者磺胺甲基異噁唑（SMZ）血藥峰濃度 46.8 μg/mL，調整 TMP/SMZ 針劑 480 mg q8h 肌注，聯合 TMP/SMZ 480 mg q8h 口服。3 月 27 日，患者體溫正常，復查胸部 CT，肺部感染癥狀較前有所吸收（圖 1c、d），停用利奈唑胺。3 月 31 日患者胃腸道反應好轉，停用 SMZ 肌肉注射，TMP/SMZ 調整至 960 mg q8h 口服，測定 SMZ 血藥峰濃度 85.9 μg/mL。4 月 6 日停止氧療，無發熱、咳嗽咳痰，指尖氧飽和度 98%。4 月 13 日復查胸部 CT 提示肺部感染較前明顯吸收（圖 1e、f），予以出院。囑患者繼續 TMP/SMZ 960 mg q8h 口服；更昔洛韋 1000 mg q12h 口服；強的松 5 mg q8h 維持治療。
表1
2 例肺移植患者的痰 NGS 結果
圖1
病例一患者胸部 CT 檢查像
a、b. 2020-03-18。提示左肺感染，左肺上葉及下葉彌漫磨玻璃浸潤性病變（黑箭）。c、d. 2020-03-27。左肺感染較前片相比有所吸收，左肺上葉磨玻璃浸潤影（黑箭），下葉滲出減少。e、f. 2020-04-13。浸潤影吸收，呈條索狀改變。
1.2 病例二
患者男，65 歲，2019 年 12 月 12 日因慢性阻塞性肺疾病終末期于我院行體外循環下行左肺移植術+右肺減容術，術后給予抗炎、化痰、平喘、保肝、抗排異等處理，康復出院，院外每月隨訪，病情穩定，FK506 谷濃度控制在 6～12 ng/mL。2021 年 1 月 12 起出現間斷發熱，體溫 37～38 ℃，咳喘多痰，院外自服莫西沙星，效果不佳，后咳喘明顯加重，予收治入院。
患者不吸氧靜息狀態下，指尖氧飽和度 98% 左右，活動可。胸部 CT 提示肺氣腫，兩肺多發慢性炎癥，新發磨玻璃影，左肺較顯著（圖 2a、b）。抗排異藥物使用中，嗎替麥考酚酯 500 g q12h，FK506 早 4 mg、晚 4.5 mg，強的松 5 mg qd；2021 年 1 月 19 日血常規檢驗報告：白細胞計數 8.1×109/L，中性粒細胞百分比 67.1%，淋巴細胞百分比 16.7% ↓，單核細胞計數 0.8×109/L↑，血小板計數 267×109/L，C 反應蛋白 43.81 mg/L ↑；LDH 329 U/L ↑；血真菌 BDG <37.5 pg/mL。微生物報告：嗜肺軍團菌抗體 IgM 陰性，肺炎支原體抗體 IgM 陰性，Q 熱立克次體抗體 IgM 陰性，肺炎衣原體抗體 IgM 陰性，腺病毒抗體 IgM 陰性，呼吸道合胞病毒抗體 IgM 陰性，甲型流感病毒抗體 IgM 陰性，乙型流感病毒抗體 IgM 陰性，副流感病毒抗體 IgM 陰性，新型冠狀病毒核酸檢測陰性，FK506 谷濃度 8.90 ng/mL。
圖2
病例二胸部 CT 檢查像
a、b. 2021-01-19。兩肺散在斑片不均勻浸潤影，部分呈網織狀改變，左肺顯著。c. 2021-02-01。斑片浸潤影較前吸收。d. 2021-04-13。浸潤影完全吸收。
入院后予頭孢他啶 2 g q12h，莫西沙星 0.4 g qd，更昔洛韋 250 mg q12h，伏立康唑 200 mg q12h 抗感染治療。1 月 21 日局麻下行支氣管鏡檢查并取 BALF，檢查所見：氣管管腔通暢，黏膜光滑，隆突銳利；左總支、左上葉、左下葉各支管腔通暢，黏膜光滑，左側吻合口愈合良好；右總支、右上葉、右中下葉各支管腔通暢，黏膜光滑。心臟超聲：三尖瓣反流（輕中度）肺高壓可能，靜息狀態下左室各節段收縮活動未見明顯異常。連續多普勒據輕中度三尖瓣反流估測肺動脈收縮壓約 41 mm Hg。1 月 23 日 BALF 的 NGS 提示膿腫分枝桿菌、耶氏肺孢子菌、細環病毒等，調整抗生素方案，停用伏立康唑、莫西沙星等，換用 TMP/SMZ 480 mg q8h 口服，卡泊芬凈首劑 70 mg，維持 50 mg qd，維持更昔洛韋治療。1 月 25 日患者體溫正常，服用 TMP/SMZ 后無胃腸道反應，加量至 960 mg q8h 口服。1 月 26 日 BALF 微生物檢驗報告：培養 5 d 無真菌生長。痰微生物其他檢驗報告：分枝桿菌抗酸染色未找到抗酸桿菌。FK506 12.00 ng/mL。1 月 27 日痰微生物檢驗報告：分枝桿菌生長，未找到真菌菌絲及孢子。考慮患者 NGS 存在膿腫分枝桿菌，1 月 28 日予以阿米卡星 0.2 g q12h 霧化，頭孢西丁 2 g 靜滴 q12h，繼續阿奇霉素 250 mg qd 口服，更昔洛韋 1 g q8h 口服，停用卡泊芬凈，增加 TMP/SMZ 口服劑量至 1440 mg q8h 口服，FK506 調整為早 3.5 mg、晚 4 mg 口服。2 月 1 日復查 CT，兩肺磨玻璃影較前有所吸收（圖 2c），臨床癥狀改善。2 月 2 日測定患者 SMZ 峰濃度 196.6 μg/mL，調整 SMZ 劑量為 960 mg q8h 口服。2 月 5 日患者一般情況可，FK506 谷濃度 6.60 ng/mL，予出院門診服藥隨訪。4 月 13 日門診復查 CT，兩肺慢性炎癥，炎癥已基本吸收（圖 2d）。抗分枝桿菌治療終止，患者目前 SMZ 口服維持，定期隨訪中。
2 文獻復習
通過 PubMed 以關鍵詞“Lung transplantation”和 “Pneumocystis jirovecii”組合搜索，共檢索到 6 篇相關研究文獻，其中病例報道 3 篇。總共有 66 例肺移植患者合并耶氏肺孢子菌感染。以（solid organ transplant）AND（Pneumocystis jirovecii）組合搜索，共檢索到 73 篇文獻，經篩選共有 7 篇文獻涉及肺移植病例，其中 1 篇與前一組合搜索出的結果重復。將有關文獻綜述匯總如下（表 2）。
表2
肺移植后患者 PCP 文獻匯總
3 討論
實體器官移植受者因接受長期抗排異治療，T 淋巴細胞功能抑制，在無預防的情況下，PCP 的發生率為 5%～15%，肺移植和心肺聯合移植受者中 PCP 發生率最高。患者早期癥狀不典型，容易被忽視，病情進展至呼吸衰竭時，總死亡率大于 25%[10]，為臨床診斷和治療帶來困難。
對于具有 PCP 危險因素、存在肺炎和具有特異放射影像學表現的患者，應考慮 PCP 的診斷。在 HIV 感染患者中 PCP 最常見的表現是亞急性發作的進行性呼吸困難、發燒、干咳和胸部不適，這些癥狀在幾天到幾周內惡化[11]；而非 HIV 感染的 PCP 感染者臨床表現更惰性，可有發熱、嚴重程度不等的呼吸困難和咳嗽、血常規正常或偏高。幾乎所有 PCP 患者均存在靜息時或運動時低氧血癥，低氧飽和度較普遍，但并非特異性[12]。PCP 的胸部 X 線片通常表現為彌漫性、雙側、對稱的“磨玻璃”間質浸潤，以蝴蝶模式從肺門發出[13]。在早期疾病患者中，胸部 X 線片可能是正常的，CT 作為 PCP 診斷的敏感檢查手段，特別是胸部 X 線片顯示正常的病例中可作為首選檢查。本文病例一的胸部 CT 表現為較特異的磨玻璃浸潤影，病例二表現不典型。早期 PCP 在 CT 上可表現為彌漫性磨玻璃浸潤，類似本文報道病例的圖 1a、b，繼而可發展為分布不均的實變，最終以整個肺實變為主要表現。然而這些影像學改變并不是 PCP 的特異表現，并不能作為確診依據。但 CT 檢查正常通常可用于排除 PCP 的診斷[14]。
從 PCP 的微生物學實驗室檢查分析，血清 BDG 檢測似乎敏感度較好但缺乏特異性[15]，Meta 分析提示血清/血漿 BDG 陰性預測值≥97%，敏感性≥90%[16-18]。但是 BDG 不能用于 PCP 的特異性檢查，BDG 陽性可見于其他真菌病原菌感染，PCP 患者中 BDG 可顯著升高（>500 pg/mL）[19]。盡管目前 BALF 標本可以檢測 BDG 代謝，但由于較低的特異性，無法與其他呼吸道定植菌（例如念珠菌屬或非肺囊蟲屬）相鑒別[20-21]。從非真菌學實驗室檢查分析，LDH 升高（LDH>500 mg/dL）提示肺損傷，特別是對于 HIV 陽性的患者，高 LDH 與疾病的嚴重程度呈正相關[22]。LDH 正常可用于排除 PCP 的診斷，但由于特異性較差需要輔以真菌學檢查佐證[23]，對于 HIV 陰性患者，LDH 檢查缺乏特異性和靈敏性，并且初始 LDH 升高的程度是院內死亡率的預測因子[5]；PCT 升高提示與 PCP 程度相關，但 PCP 患者的 PCT 水平總體低于細菌性肺炎或者結核性肺炎[24]；PCP 感染者中 C 反應蛋白（CRP）可正常，因此不能作為排除診斷的標準[22]。
鑒于 PCP 的臨床表現、血液學檢查和胸部 X 線片表現不是特異性診斷的依據，而組織、BALF 或誘導痰液樣本中的生物的組織病理學或細胞病理學證明則是確定診斷 PCP 所必需的。耶氏肺孢子菌作為 PCP 感染的致病菌在體外無法可靠生長，因此 PCP 的病原學診斷主要依靠先對呼吸道標本進行化學或免疫熒光染色，隨后通過顯微鏡鏡檢找到耶氏肺孢子菌而確診[25-26]，顯微鏡檢有助于確診 PCP，建議使用針對 PCP 孢子囊的單克隆抗體進行免疫熒光法檢測[27]；相比于淺表呼吸道標本如痰液，對于深部呼吸道標本如 BALF，免疫熒光鏡檢可提高其檢測準確度[28]。以往對各種方法獲得的染色呼吸道樣本的研究表明，痰液敏感性為 50%～90%，BALF 敏感性 90%～99%，經支氣管活檢敏感性 95%～100%，開放肺活檢敏感性 95%～100%[11]。
目前開展的 PCR 相對于常規檢測手段可顯著提高敏感性和特異性。有研究顯示 PCR 的敏感性≥97%，陰性預測值≥99%[29-31]。如果 BALF 的 PCR 檢測為陰性，則可排除 PCP 的診斷。既往認為上呼吸道標本檢測陽性可以提示存在耶氏肺孢子菌定植，同時可以反映下呼吸道感染程度。目前不推薦用巢氏 PCR（nested-PCR）或者用 RT-PCR（real-time PCR）取代常規 PCR 用于量化細菌定植或者與其他感染鑒別。因為 RT-PCR 對于 DNA 要求較高，對于低標準的 DNA 片段，PCR 檢測陽性率較低。如果 PCR 檢測出耶氏肺孢子菌的水平較低，需結合臨床具體表現及標本送檢的精確度[32]。
聯合檢測時，免疫熒光鏡檢+PCR+BDG 可顯著提高診斷準確率，特別是 HIV 陽性患者[27]。BALF 的 PCR 檢測和血清/血漿 BDG 代謝具有高度敏感性，可以減少免疫熒光鏡檢的重復次數。但由于目前缺乏 BALF 標本和 PCR 擴增的標準化程序，免疫熒光鏡檢在特異性方面仍無法被取代。敏感性分子或生物標志物檢測手段可用于臨床癥狀較輕或者非典型癥狀的患者。如果具有典型臨床表現的患者其 BDG 和 PCR 檢測均為陽性，則盡管顯微鏡檢陰性，臨床上仍考慮該患者存在耶氏肺孢子菌感染。雖然免疫熒光鏡檢目前仍然是 PCP 診斷的金標準，但是指南建議 BALF 的 PCR 陰性和血清/血漿 BDG 代謝陰性可作為排除診斷標準[27, 33-35]。
近年來 NGS 技術迅猛發展，作為一項有前途的、普遍的、不需要培養基的檢測手段，可直接對標本進行病原菌檢測[36-37]。NGS 可以檢測樣本的所有核酸序列并通過其數據庫匹配確定樣本所含致病菌的種類和比例[38]。NGS 已經成功用于診斷包括 PCP 在內的各種感染性疾病[39-42]，暫未發現假陽性的報道。現有的分子檢測手段包括 PCR、蛋白芯片等，僅是針對 1 個或者數量有限的可知病原菌。NGS 與之相比，可以針對樣本中的所有 DNA 或 RNA 序列，檢測完整的微生物組包括人類自身的基因組或者患者樣本中的轉錄組。本文 2 例患者的 NGS 檢測結果除了提示耶氏肺孢子蟲感染外，還提示有其他病毒感染，包括人巨細胞病毒（CMV）和細環病毒，并且在病程中都進行了抗病毒治療。CMV 感染細胞主要有產毒性感染和潛伏感染兩種途徑，人 CMV 的組織嗜性與宿主年齡和免疫狀況有密切關聯，有報道提示 CMV 和其他可能引起呼吸道感染的病毒通常在使用免疫抑制劑后 1～3 個月發生[43]。免疫抑制個體的肺部最常被侵及，引發巨細胞病毒肺炎（CMP）甚至造成全身性感染。CMP 發病初期表現為發熱和干咳癥狀，肺部無異常體征，胸部影像學亦無明顯異常，但是隨著病情進展，患者可迅速出現呼吸窘迫和低氧血癥等，在短期內出現呼吸衰竭。肺部高分辨 CT 檢查最初的表現如果是雙肺彌散性病變或發展成含氣的非實變的磨玻璃影[44]。如前述總結的文獻中，總共 106 例肺移植合并 PCP 感染的患者中有 27 例患者合并 CMV 感染。因此，根據我們的經驗，對這類患者宜早期進行更昔洛韋抗病毒治療，且給予維持治療，同時監測病毒抗體滴度。
對于高風險的患者，預防治療仍然是防止發生 PCP 的主要手段。然而由于缺乏相關的指南推薦，對于高危風險因素也認識有限，臨床上某些病情可能得不到必須的預防治療。這些特殊情況包括對于一系列炎癥使用非常規劑量抗生素；對惡性腫瘤使用激進的化療方案；或者接受 TNF 阻滯劑、CD-52 抗體、鈣調磷酸酶抑制劑（環孢素、FK506）、B-細胞阻斷劑和選擇性 T 細胞阻斷劑等，此外額外使用抗嘌呤藥物、核苷類藥物，或者使用高劑量激素等臨床上也會忽視預防治療的介入[45-48]。系統性回顧和 Meta 分析提示預防治療可顯著降低 PCP 致死率和發生率[48]。
治療方面，TMP/SMZ 是治療 PCP 的首選藥物，強調早期足量應用效果甚佳[4]。腎功能正常患者的 TMP/SMZ 劑量以甲氧芐啶（TMP）計為 15～20 mg/（kg·d），分 3 次或 4 次靜脈給藥或口服，PCP 標準藥物治療療程為 3 周[49]，重癥患者可適當延長。在一項對非 HIV 患者的 PCP 研究中，57% 的患者在治療開始后 13 d（中位時間）通過復查胸部 CT 可觀察到病情改善。TMP/SMZ 生物利用度較好，對于胃腸道功能正常的患者都適合口服給藥。對于磺胺不耐受或過敏患者，治療 PCP 可選用的藥物包括克林霉素、伯氨喹、氨苯砜、戊烷脒、棘白菌素類等。近年來，卡泊芬凈聯合低劑量 TMP/SMZ 用于實質器官移植后 PCP 感染患者，取得滿意療效且不良反應發生率低[35]。體外實驗證明卡泊芬凈可抑制耶氏肺孢子菌細胞壁的形成，當與 TMP/SMZ 合用時因兩者作用機制不同[50-51]，具有協同作用。此外，PCP 治療中應重視血藥濃度的監測。TMP/SMZ 的藥物監測始于上世紀 90 年代，Simonds 等[52]研究指出，治療 PCP 時，SMZ 與 TMP 的藥物監測參考濃度范圍分別為血藥峰濃度 100～150 μg/mL 和 3～8 μg/mL。TMP/SMZ 口服吸收較少受食物及其他藥物的影響，患者的血藥峰濃度差異較大，預期目標濃度范圍的實現程度較低，照標準治療方案仍有 45.0% 的患者給藥后劑量偏高或低，需要調整。對于肌酐清除率<30 mL/min（Cockcroft-Gault 法），可以按 TMP 7～10 mg/kg 給藥[53]。關于 SMZ 血藥峰濃度與療效之間的關系，目前仍缺乏前瞻性的研究，Ice 等[54]的研究表明，低濃度組（峰濃度小于 100 μg/mL）與標準濃度組（峰濃度 100～150 μg/mL）比較，臨床失敗率無顯著性差異。Chang 等[55]的回顧性研究表明，TMP/SMZ 的大多數不良反應發生在治療的第 1、2 周內，TMP/SMZ 的日劑量與不良反應獨立相關。不良反應組的平均日劑量≥16 mg/kg。胃腸道反應的發生率為 14.3%，發生的中位時間（5 d）明顯短于其他不良反應（12 d），惡心、嘔吐和胃腸道癥狀被認為是“絕對可以預防的”，可以通過減少劑量得到改善，在 21 例患者中，17 例（80.9%）在調整劑量或改變另一種治療方式后完全恢復。另外，使用 TMP/SMZ 患者，腎功能異常（血肌酐值升高）的發生率為 38.1%（8/21）。SMZ 主要經腎小管分泌排泄，易在腎小管形成結晶，其腎毒性主要表現為結晶性腎病。減少單次給藥劑量，增加給藥次數，降低峰濃度，可減少不良反應的發生。本文的 2 例患者均進行了 SMZ 血藥峰濃度的監測，并根據濃度及患者腎功能進行了給藥劑量的調整，第一例患者初始治療由于嘔吐等胃腸道反應，造成血藥峰濃度過低（46.8 μg/mL），在調整給藥方案（減量、肌注結合口服）后，不良反應減輕、臨床癥狀和體征均有改善，雖然血藥峰濃度（85.9 μg/mL）略低于目標值（100～150 μg/mL），但未進一步調整方案。第二例患者初始血藥峰濃度過高（196.6 μg/mL），減量給藥后，濃度達標，臨床癥狀和影像學也獲得改善。
綜上，本文中的 2 例肺移植患者術后一直口服 FK506、霉酚酸酯、強的松三聯抗排異治療，且均出現呼吸系統感染癥狀。在院外進行常規的經驗性抗感染治療后，病情呈進展性加重，入院后根據進一步的檢測結果不斷調整治療方案后對患者進行了成功的救治。結合我們回顧的文獻復習，從該兩例患者的診療過程中我們得到以下體會。（1）器官移植患者在長期運用抗排異的免疫抑制劑治療的過程中，耶氏肺孢子菌機會性感染可能大，是否應該予以小劑量的 SMZ 預防治療，有待進一步研究和觀察。（2）對于長期使用免疫抑制治療的患者，CMV 合并真菌感染較為常見，在抗真菌感染的同時應注意患者是否合并病毒感染。（3）對于有免疫缺陷或免疫抑制的患者合并嚴重的感染時，NGS 可否作為常規的檢查方法，仍值得商榷，畢竟 NGS 的檢測費用高昂，而且不是真菌鑒定的最佳選擇。建議在綜合考慮患者病情和費用后早期應用 NGS，以快速進行微生物檢測，協助臨床醫生對侵入性病原體做出快速準確的診斷并及時調整治療方案，早期應用 NGS 可使患者有更大的獲益。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）是一種免疫抑制患者中主要的機會性感染，20 世紀 80 年代隨著人類免疫缺陷病毒（HIV）的出現，耶氏肺孢子菌肺炎（PCP）的患病率顯著增加。由于抗逆轉錄病毒治療和預防治療的介入，HIV 感染患者 PCP 的發病率和致死率獲得明顯下降，然而在非 HIV 感染的免疫缺陷患者中 PCP 的發病率卻在逐漸增加[1-3]。在此我們報道 2 例常規檢測手段陰性，而二代測序（NGS）確診耶氏肺孢子菌感染的臨床病例，同時匯總肺移植患者 PCP 診斷治療的文獻復習。
1 臨床資料
1.1 病例一
患者男，48 歲，2019 年 4 月 26 日因“特發性肺纖維化、呼吸衰竭”于上海市胸科醫院行雙肺移植術，術后恢復良好。2020 年 2 月 24 日出現發熱，體溫 37.8 ℃，持續 3 d，未處理；2 月 27 日起先后自服莫西沙星 400 mg 1 次/d（qd），連續 4 d，左氧氟沙星 500 mg qd，連續 4 d，未見明顯好轉；3 月 9 日出現腹痛、低熱、嘔吐、低氧（指尖氧飽和度 92%～94%），3 月 12 日來我院就診，收治入院。查體：神志清，精神差，活動后氣促，左肺聞及濕性啰音。心率 108 次/min，律齊，雙下肢無浮腫，體溫 36.8 ℃，血壓 138/80 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），呼吸頻率 24 次/min。輔助檢查：3 月 12 日肺部 CT 提示肺移植術后，兩肺浸潤影，兩肺門軟組織增厚；心臟超聲提示二尖瓣輕度反流，肺動脈收縮壓約 34 mm Hg，左室射血分數 63%，心臟大小正常。血常規：白細胞計數 4.8×109/L，中性粒細胞百分比 44.3%，血小板計數 350×109/L，血紅蛋白 115 g/L，C 反應蛋白 75.15 mg/L，紅細胞沉降率 96 mm/1 h，乳酸脫氫酶（LDH）340 U/L，降鈣素原（PCT）0.06 ng/mL，血真菌（1-3）-β-D-葡聚糖（BDG）136 pg/mL；T 淋巴細胞 CD3+ 93.6%↑，輔助性 T 細胞 CD3+CD4+ 23.7%↓，細胞毒性 T 細胞 CD3+CD8+ 63.2%↑，CD4+/CD8+ 比值 0.4↓，B 淋巴細胞 CD3–CD19+ 2.5%↓，自然殺傷細胞 CD3–CD16+CD56+ 3.8%↓。
患者肺移植后一直維持口服抗排異藥物：嗎替麥考酚酯（商品名驍悉）1 g 1 次/12 h（q12h），他克莫司（FK506）2 mg q12h，強的松 5 mg 1 次/2 d。入院時 FK506 谷濃度 12.1 ng/mL。入院診斷為：肺移植術后，肺部感染。3 月 12 日予以美羅培南 1 g 1 次/8 h（q8h），伏立康唑 200 mg q12h，更昔洛韋 250 mg q12h 抗感染治療，同時予以吸氧、化痰、霧化對癥處理。因患者低氧不能耐受纖支鏡檢查，未取得支氣管肺泡灌洗液（BALF），遂取痰標本送 NGS 檢測，3 月 14 日痰 NGS 送檢結果報告未發現寄生蟲和分枝桿菌，主要致病微生物為耶氏肺孢子菌和人類 β 皰疹病毒 5 型，檢出序列數分別為 10914 和 1873，細菌結果考慮為口腔定植菌，其他微生物結果因序列數較低，亦不考慮為致病菌（表 1）。3 月 16 日加用復方磺胺甲基異噁唑（TMP/SMZ）1920 mg q8h 和卡泊芬凈（首劑 70 mg，維持 50 mg qd）抗 PCP 治療，繼續美羅培南抗細菌和更昔洛韋抗病毒治療。患者服用 TMP/SMZ 后出現嚴重胃腸道不良反應，嘔吐劇烈，不能進食，無法足量服用 TMP/SMZ。3 月 18 日復查胸部 CT，提示患者肺部感染較前加重（圖 1a、b），停用美羅培南，加用利奈唑胺 600 mg q12h 和頭孢美唑 2 g q12h，兩性霉素脂質體 10 mg q12h 霧化吸入，甲強龍 40 mg qd，同時維持卡泊芬凈。3 月 21 日測定患者磺胺甲基異噁唑（SMZ）血藥峰濃度 46.8 μg/mL，調整 TMP/SMZ 針劑 480 mg q8h 肌注，聯合 TMP/SMZ 480 mg q8h 口服。3 月 27 日，患者體溫正常，復查胸部 CT，肺部感染癥狀較前有所吸收（圖 1c、d），停用利奈唑胺。3 月 31 日患者胃腸道反應好轉，停用 SMZ 肌肉注射，TMP/SMZ 調整至 960 mg q8h 口服，測定 SMZ 血藥峰濃度 85.9 μg/mL。4 月 6 日停止氧療，無發熱、咳嗽咳痰，指尖氧飽和度 98%。4 月 13 日復查胸部 CT 提示肺部感染較前明顯吸收（圖 1e、f），予以出院。囑患者繼續 TMP/SMZ 960 mg q8h 口服；更昔洛韋 1000 mg q12h 口服；強的松 5 mg q8h 維持治療。
表1
2 例肺移植患者的痰 NGS 結果
圖1
病例一患者胸部 CT 檢查像
a、b. 2020-03-18。提示左肺感染，左肺上葉及下葉彌漫磨玻璃浸潤性病變（黑箭）。c、d. 2020-03-27。左肺感染較前片相比有所吸收，左肺上葉磨玻璃浸潤影（黑箭），下葉滲出減少。e、f. 2020-04-13。浸潤影吸收，呈條索狀改變。
1.2 病例二
患者男，65 歲，2019 年 12 月 12 日因慢性阻塞性肺疾病終末期于我院行體外循環下行左肺移植術+右肺減容術，術后給予抗炎、化痰、平喘、保肝、抗排異等處理，康復出院，院外每月隨訪，病情穩定，FK506 谷濃度控制在 6～12 ng/mL。2021 年 1 月 12 起出現間斷發熱，體溫 37～38 ℃，咳喘多痰，院外自服莫西沙星，效果不佳，后咳喘明顯加重，予收治入院。
患者不吸氧靜息狀態下，指尖氧飽和度 98% 左右，活動可。胸部 CT 提示肺氣腫，兩肺多發慢性炎癥，新發磨玻璃影，左肺較顯著（圖 2a、b）。抗排異藥物使用中，嗎替麥考酚酯 500 g q12h，FK506 早 4 mg、晚 4.5 mg，強的松 5 mg qd；2021 年 1 月 19 日血常規檢驗報告：白細胞計數 8.1×109/L，中性粒細胞百分比 67.1%，淋巴細胞百分比 16.7% ↓，單核細胞計數 0.8×109/L↑，血小板計數 267×109/L，C 反應蛋白 43.81 mg/L ↑；LDH 329 U/L ↑；血真菌 BDG <37.5 pg/mL。微生物報告：嗜肺軍團菌抗體 IgM 陰性，肺炎支原體抗體 IgM 陰性，Q 熱立克次體抗體 IgM 陰性，肺炎衣原體抗體 IgM 陰性，腺病毒抗體 IgM 陰性，呼吸道合胞病毒抗體 IgM 陰性，甲型流感病毒抗體 IgM 陰性，乙型流感病毒抗體 IgM 陰性，副流感病毒抗體 IgM 陰性，新型冠狀病毒核酸檢測陰性，FK506 谷濃度 8.90 ng/mL。
圖2
病例二胸部 CT 檢查像
a、b. 2021-01-19。兩肺散在斑片不均勻浸潤影，部分呈網織狀改變，左肺顯著。c. 2021-02-01。斑片浸潤影較前吸收。d. 2021-04-13。浸潤影完全吸收。
入院后予頭孢他啶 2 g q12h，莫西沙星 0.4 g qd，更昔洛韋 250 mg q12h，伏立康唑 200 mg q12h 抗感染治療。1 月 21 日局麻下行支氣管鏡檢查并取 BALF，檢查所見：氣管管腔通暢，黏膜光滑，隆突銳利；左總支、左上葉、左下葉各支管腔通暢，黏膜光滑，左側吻合口愈合良好；右總支、右上葉、右中下葉各支管腔通暢，黏膜光滑。心臟超聲：三尖瓣反流（輕中度）肺高壓可能，靜息狀態下左室各節段收縮活動未見明顯異常。連續多普勒據輕中度三尖瓣反流估測肺動脈收縮壓約 41 mm Hg。1 月 23 日 BALF 的 NGS 提示膿腫分枝桿菌、耶氏肺孢子菌、細環病毒等，調整抗生素方案，停用伏立康唑、莫西沙星等，換用 TMP/SMZ 480 mg q8h 口服，卡泊芬凈首劑 70 mg，維持 50 mg qd，維持更昔洛韋治療。1 月 25 日患者體溫正常，服用 TMP/SMZ 后無胃腸道反應，加量至 960 mg q8h 口服。1 月 26 日 BALF 微生物檢驗報告：培養 5 d 無真菌生長。痰微生物其他檢驗報告：分枝桿菌抗酸染色未找到抗酸桿菌。FK506 12.00 ng/mL。1 月 27 日痰微生物檢驗報告：分枝桿菌生長，未找到真菌菌絲及孢子。考慮患者 NGS 存在膿腫分枝桿菌，1 月 28 日予以阿米卡星 0.2 g q12h 霧化，頭孢西丁 2 g 靜滴 q12h，繼續阿奇霉素 250 mg qd 口服，更昔洛韋 1 g q8h 口服，停用卡泊芬凈，增加 TMP/SMZ 口服劑量至 1440 mg q8h 口服，FK506 調整為早 3.5 mg、晚 4 mg 口服。2 月 1 日復查 CT，兩肺磨玻璃影較前有所吸收（圖 2c），臨床癥狀改善。2 月 2 日測定患者 SMZ 峰濃度 196.6 μg/mL，調整 SMZ 劑量為 960 mg q8h 口服。2 月 5 日患者一般情況可，FK506 谷濃度 6.60 ng/mL，予出院門診服藥隨訪。4 月 13 日門診復查 CT，兩肺慢性炎癥，炎癥已基本吸收（圖 2d）。抗分枝桿菌治療終止，患者目前 SMZ 口服維持，定期隨訪中。
2 文獻復習
通過 PubMed 以關鍵詞“Lung transplantation”和 “Pneumocystis jirovecii”組合搜索，共檢索到 6 篇相關研究文獻，其中病例報道 3 篇。總共有 66 例肺移植患者合并耶氏肺孢子菌感染。以（solid organ transplant）AND（Pneumocystis jirovecii）組合搜索，共檢索到 73 篇文獻，經篩選共有 7 篇文獻涉及肺移植病例，其中 1 篇與前一組合搜索出的結果重復。將有關文獻綜述匯總如下（表 2）。
表2
肺移植后患者 PCP 文獻匯總
3 討論
實體器官移植受者因接受長期抗排異治療，T 淋巴細胞功能抑制，在無預防的情況下，PCP 的發生率為 5%～15%，肺移植和心肺聯合移植受者中 PCP 發生率最高。患者早期癥狀不典型，容易被忽視，病情進展至呼吸衰竭時，總死亡率大于 25%[10]，為臨床診斷和治療帶來困難。
對于具有 PCP 危險因素、存在肺炎和具有特異放射影像學表現的患者，應考慮 PCP 的診斷。在 HIV 感染患者中 PCP 最常見的表現是亞急性發作的進行性呼吸困難、發燒、干咳和胸部不適，這些癥狀在幾天到幾周內惡化[11]；而非 HIV 感染的 PCP 感染者臨床表現更惰性，可有發熱、嚴重程度不等的呼吸困難和咳嗽、血常規正常或偏高。幾乎所有 PCP 患者均存在靜息時或運動時低氧血癥，低氧飽和度較普遍，但并非特異性[12]。PCP 的胸部 X 線片通常表現為彌漫性、雙側、對稱的“磨玻璃”間質浸潤，以蝴蝶模式從肺門發出[13]。在早期疾病患者中，胸部 X 線片可能是正常的，CT 作為 PCP 診斷的敏感檢查手段，特別是胸部 X 線片顯示正常的病例中可作為首選檢查。本文病例一的胸部 CT 表現為較特異的磨玻璃浸潤影，病例二表現不典型。早期 PCP 在 CT 上可表現為彌漫性磨玻璃浸潤，類似本文報道病例的圖 1a、b，繼而可發展為分布不均的實變，最終以整個肺實變為主要表現。然而這些影像學改變并不是 PCP 的特異表現，并不能作為確診依據。但 CT 檢查正常通常可用于排除 PCP 的診斷[14]。
從 PCP 的微生物學實驗室檢查分析，血清 BDG 檢測似乎敏感度較好但缺乏特異性[15]，Meta 分析提示血清/血漿 BDG 陰性預測值≥97%，敏感性≥90%[16-18]。但是 BDG 不能用于 PCP 的特異性檢查，BDG 陽性可見于其他真菌病原菌感染，PCP 患者中 BDG 可顯著升高（>500 pg/mL）[19]。盡管目前 BALF 標本可以檢測 BDG 代謝，但由于較低的特異性，無法與其他呼吸道定植菌（例如念珠菌屬或非肺囊蟲屬）相鑒別[20-21]。從非真菌學實驗室檢查分析，LDH 升高（LDH>500 mg/dL）提示肺損傷，特別是對于 HIV 陽性的患者，高 LDH 與疾病的嚴重程度呈正相關[22]。LDH 正常可用于排除 PCP 的診斷，但由于特異性較差需要輔以真菌學檢查佐證[23]，對于 HIV 陰性患者，LDH 檢查缺乏特異性和靈敏性，并且初始 LDH 升高的程度是院內死亡率的預測因子[5]；PCT 升高提示與 PCP 程度相關，但 PCP 患者的 PCT 水平總體低于細菌性肺炎或者結核性肺炎[24]；PCP 感染者中 C 反應蛋白（CRP）可正常，因此不能作為排除診斷的標準[22]。
鑒于 PCP 的臨床表現、血液學檢查和胸部 X 線片表現不是特異性診斷的依據，而組織、BALF 或誘導痰液樣本中的生物的組織病理學或細胞病理學證明則是確定診斷 PCP 所必需的。耶氏肺孢子菌作為 PCP 感染的致病菌在體外無法可靠生長，因此 PCP 的病原學診斷主要依靠先對呼吸道標本進行化學或免疫熒光染色，隨后通過顯微鏡鏡檢找到耶氏肺孢子菌而確診[25-26]，顯微鏡檢有助于確診 PCP，建議使用針對 PCP 孢子囊的單克隆抗體進行免疫熒光法檢測[27]；相比于淺表呼吸道標本如痰液，對于深部呼吸道標本如 BALF，免疫熒光鏡檢可提高其檢測準確度[28]。以往對各種方法獲得的染色呼吸道樣本的研究表明，痰液敏感性為 50%～90%，BALF 敏感性 90%～99%，經支氣管活檢敏感性 95%～100%，開放肺活檢敏感性 95%～100%[11]。
目前開展的 PCR 相對于常規檢測手段可顯著提高敏感性和特異性。有研究顯示 PCR 的敏感性≥97%，陰性預測值≥99%[29-31]。如果 BALF 的 PCR 檢測為陰性，則可排除 PCP 的診斷。既往認為上呼吸道標本檢測陽性可以提示存在耶氏肺孢子菌定植，同時可以反映下呼吸道感染程度。目前不推薦用巢氏 PCR（nested-PCR）或者用 RT-PCR（real-time PCR）取代常規 PCR 用于量化細菌定植或者與其他感染鑒別。因為 RT-PCR 對于 DNA 要求較高，對于低標準的 DNA 片段，PCR 檢測陽性率較低。如果 PCR 檢測出耶氏肺孢子菌的水平較低，需結合臨床具體表現及標本送檢的精確度[32]。
聯合檢測時，免疫熒光鏡檢+PCR+BDG 可顯著提高診斷準確率，特別是 HIV 陽性患者[27]。BALF 的 PCR 檢測和血清/血漿 BDG 代謝具有高度敏感性，可以減少免疫熒光鏡檢的重復次數。但由于目前缺乏 BALF 標本和 PCR 擴增的標準化程序，免疫熒光鏡檢在特異性方面仍無法被取代。敏感性分子或生物標志物檢測手段可用于臨床癥狀較輕或者非典型癥狀的患者。如果具有典型臨床表現的患者其 BDG 和 PCR 檢測均為陽性，則盡管顯微鏡檢陰性，臨床上仍考慮該患者存在耶氏肺孢子菌感染。雖然免疫熒光鏡檢目前仍然是 PCP 診斷的金標準，但是指南建議 BALF 的 PCR 陰性和血清/血漿 BDG 代謝陰性可作為排除診斷標準[27, 33-35]。
近年來 NGS 技術迅猛發展，作為一項有前途的、普遍的、不需要培養基的檢測手段，可直接對標本進行病原菌檢測[36-37]。NGS 可以檢測樣本的所有核酸序列并通過其數據庫匹配確定樣本所含致病菌的種類和比例[38]。NGS 已經成功用于診斷包括 PCP 在內的各種感染性疾病[39-42]，暫未發現假陽性的報道。現有的分子檢測手段包括 PCR、蛋白芯片等，僅是針對 1 個或者數量有限的可知病原菌。NGS 與之相比，可以針對樣本中的所有 DNA 或 RNA 序列，檢測完整的微生物組包括人類自身的基因組或者患者樣本中的轉錄組。本文 2 例患者的 NGS 檢測結果除了提示耶氏肺孢子蟲感染外，還提示有其他病毒感染，包括人巨細胞病毒（CMV）和細環病毒，并且在病程中都進行了抗病毒治療。CMV 感染細胞主要有產毒性感染和潛伏感染兩種途徑，人 CMV 的組織嗜性與宿主年齡和免疫狀況有密切關聯，有報道提示 CMV 和其他可能引起呼吸道感染的病毒通常在使用免疫抑制劑后 1～3 個月發生[43]。免疫抑制個體的肺部最常被侵及，引發巨細胞病毒肺炎（CMP）甚至造成全身性感染。CMP 發病初期表現為發熱和干咳癥狀，肺部無異常體征，胸部影像學亦無明顯異常，但是隨著病情進展，患者可迅速出現呼吸窘迫和低氧血癥等，在短期內出現呼吸衰竭。肺部高分辨 CT 檢查最初的表現如果是雙肺彌散性病變或發展成含氣的非實變的磨玻璃影[44]。如前述總結的文獻中，總共 106 例肺移植合并 PCP 感染的患者中有 27 例患者合并 CMV 感染。因此，根據我們的經驗，對這類患者宜早期進行更昔洛韋抗病毒治療，且給予維持治療，同時監測病毒抗體滴度。
對于高風險的患者，預防治療仍然是防止發生 PCP 的主要手段。然而由于缺乏相關的指南推薦，對于高危風險因素也認識有限，臨床上某些病情可能得不到必須的預防治療。這些特殊情況包括對于一系列炎癥使用非常規劑量抗生素；對惡性腫瘤使用激進的化療方案；或者接受 TNF 阻滯劑、CD-52 抗體、鈣調磷酸酶抑制劑（環孢素、FK506）、B-細胞阻斷劑和選擇性 T 細胞阻斷劑等，此外額外使用抗嘌呤藥物、核苷類藥物，或者使用高劑量激素等臨床上也會忽視預防治療的介入[45-48]。系統性回顧和 Meta 分析提示預防治療可顯著降低 PCP 致死率和發生率[48]。
治療方面，TMP/SMZ 是治療 PCP 的首選藥物，強調早期足量應用效果甚佳[4]。腎功能正常患者的 TMP/SMZ 劑量以甲氧芐啶（TMP）計為 15～20 mg/（kg·d），分 3 次或 4 次靜脈給藥或口服，PCP 標準藥物治療療程為 3 周[49]，重癥患者可適當延長。在一項對非 HIV 患者的 PCP 研究中，57% 的患者在治療開始后 13 d（中位時間）通過復查胸部 CT 可觀察到病情改善。TMP/SMZ 生物利用度較好，對于胃腸道功能正常的患者都適合口服給藥。對于磺胺不耐受或過敏患者，治療 PCP 可選用的藥物包括克林霉素、伯氨喹、氨苯砜、戊烷脒、棘白菌素類等。近年來，卡泊芬凈聯合低劑量 TMP/SMZ 用于實質器官移植后 PCP 感染患者，取得滿意療效且不良反應發生率低[35]。體外實驗證明卡泊芬凈可抑制耶氏肺孢子菌細胞壁的形成，當與 TMP/SMZ 合用時因兩者作用機制不同[50-51]，具有協同作用。此外，PCP 治療中應重視血藥濃度的監測。TMP/SMZ 的藥物監測始于上世紀 90 年代，Simonds 等[52]研究指出，治療 PCP 時，SMZ 與 TMP 的藥物監測參考濃度范圍分別為血藥峰濃度 100～150 μg/mL 和 3～8 μg/mL。TMP/SMZ 口服吸收較少受食物及其他藥物的影響，患者的血藥峰濃度差異較大，預期目標濃度范圍的實現程度較低，照標準治療方案仍有 45.0% 的患者給藥后劑量偏高或低，需要調整。對于肌酐清除率<30 mL/min（Cockcroft-Gault 法），可以按 TMP 7～10 mg/kg 給藥[53]。關于 SMZ 血藥峰濃度與療效之間的關系，目前仍缺乏前瞻性的研究，Ice 等[54]的研究表明，低濃度組（峰濃度小于 100 μg/mL）與標準濃度組（峰濃度 100～150 μg/mL）比較，臨床失敗率無顯著性差異。Chang 等[55]的回顧性研究表明，TMP/SMZ 的大多數不良反應發生在治療的第 1、2 周內，TMP/SMZ 的日劑量與不良反應獨立相關。不良反應組的平均日劑量≥16 mg/kg。胃腸道反應的發生率為 14.3%，發生的中位時間（5 d）明顯短于其他不良反應（12 d），惡心、嘔吐和胃腸道癥狀被認為是“絕對可以預防的”，可以通過減少劑量得到改善，在 21 例患者中，17 例（80.9%）在調整劑量或改變另一種治療方式后完全恢復。另外，使用 TMP/SMZ 患者，腎功能異常（血肌酐值升高）的發生率為 38.1%（8/21）。SMZ 主要經腎小管分泌排泄，易在腎小管形成結晶，其腎毒性主要表現為結晶性腎病。減少單次給藥劑量，增加給藥次數，降低峰濃度，可減少不良反應的發生。本文的 2 例患者均進行了 SMZ 血藥峰濃度的監測，并根據濃度及患者腎功能進行了給藥劑量的調整，第一例患者初始治療由于嘔吐等胃腸道反應，造成血藥峰濃度過低（46.8 μg/mL），在調整給藥方案（減量、肌注結合口服）后，不良反應減輕、臨床癥狀和體征均有改善，雖然血藥峰濃度（85.9 μg/mL）略低于目標值（100～150 μg/mL），但未進一步調整方案。第二例患者初始血藥峰濃度過高（196.6 μg/mL），減量給藥后，濃度達標，臨床癥狀和影像學也獲得改善。
綜上，本文中的 2 例肺移植患者術后一直口服 FK506、霉酚酸酯、強的松三聯抗排異治療，且均出現呼吸系統感染癥狀。在院外進行常規的經驗性抗感染治療后，病情呈進展性加重，入院后根據進一步的檢測結果不斷調整治療方案后對患者進行了成功的救治。結合我們回顧的文獻復習，從該兩例患者的診療過程中我們得到以下體會。（1）器官移植患者在長期運用抗排異的免疫抑制劑治療的過程中，耶氏肺孢子菌機會性感染可能大，是否應該予以小劑量的 SMZ 預防治療，有待進一步研究和觀察。（2）對于長期使用免疫抑制治療的患者，CMV 合并真菌感染較為常見，在抗真菌感染的同時應注意患者是否合并病毒感染。（3）對于有免疫缺陷或免疫抑制的患者合并嚴重的感染時，NGS 可否作為常規的檢查方法，仍值得商榷，畢竟 NGS 的檢測費用高昂，而且不是真菌鑒定的最佳選擇。建議在綜合考慮患者病情和費用后早期應用 NGS，以快速進行微生物檢測，協助臨床醫生對侵入性病原體做出快速準確的診斷并及時調整治療方案，早期應用 NGS 可使患者有更大的獲益。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
