miR-499a-5p 靶向 MMP-16 通過 Nrf2 信號通路減輕急性呼吸窘迫綜合征大鼠的肺損傷_《中國呼吸與危重監護雜志》

作者：

段凌霄 ¹ , 李芹 ² ,  伍長學 ¹

1. 西南醫科大學附屬醫院重癥醫學科（四川瀘州 646000）;
2. 西南醫科大學附屬醫院藥學部（四川瀘州 646000）;

關鍵詞：

急性呼吸窘迫綜合征 miR-499a-5p 基質金屬蛋白酶-16 Nrf2 信號通路

DOI：

10.7507/1671-6205.201907059

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的探討 miR-499a-5p 高表達靶向基質金屬蛋白酶-16（MMP-16）對急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）大鼠肺損傷的影響。方法實驗設置假手術組、模型組、miR-499a-5p 模擬物組、MMP-16 組、miR-499a-5p 模擬物+MMP-16 組、Nrf2 信號通路抑制劑 D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB）組、miR-499a-5p 模擬物+DRB 組。利用盲腸穿刺的方法構建急性呼吸窘迫綜合征大鼠模型，術前 1 h，用微型注射器將 50 μL 的轉染復合物注入氣管，術前 30 min，腹腔注射 DRB（5 mg/kg）。RT-qPCR 檢測肺組織中 miR-499 和 MMP-16 表達水平；雙熒光素酶報告基因驗證靶向關系；分離模型組大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞，MMP-16 3’UTR WT 和 MUT 熒光素酶報告質粒分別與 miR-499 共轉染肺泡Ⅱ型上皮細胞，驗證 miR-499 和 MMP-16 靶向關系；蘇木素–伊紅染色觀察肺損傷；酶聯免疫吸附試驗檢測支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子和肺組織中氧化應激水平；蛋白印跡法分析肺組織中還原型輔酶/醌氧化還原酶（NQO1）、血紅素加氧酶（HO）-1、核因子 E2 相關因子 2（Nrf2）蛋白表達水平。結果 miR-499 在 ARDS 模型大鼠的肺中低表達（P<0.01），而 MMP-16 高表達（P<0.01）；miR-499a-5p 與 MMP-16 3’UTR 區存在結合位點，且 miR-499a-5p 直接靶向負調控 MMP-16 表達（P<0.01）；miR-499a-5p 過表達能夠明顯降低 ARDS 大鼠的肺濕干重比（P<0.05），減輕肺組織損傷（P<0.01），降低支氣管肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α、白細胞介素（IL）-1β 和 IL-6 含量（P<0.01），降低肺組織中丙二醛和髓過氧化物酶水平，提高總抗氧化能力（P<0.01），上調肺組織中 NQO1、HO-1、Nrf2 蛋白表達（P<0.01）。而加入 MMP-16 和 DRB 后都能夠明顯逆轉該現象。結論 miR-499a-5p 過表達靶向負調控 MMP-16，通過激活 Nrf2 信號通路來減輕急性呼吸窘迫綜合征大鼠的肺損傷。

引用本文： 段凌霄, 李芹, 伍長學. miR-499a-5p 靶向 MMP-16 通過 Nrf2 信號通路減輕急性呼吸窘迫綜合征大鼠的肺損傷. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(7): 487-494. doi: 10.7507/1671-6205.201907059 復制

急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指各種肺內和肺外致病因素所導致的急性彌漫性肺損傷和進而發展的急性呼吸衰竭^[1]。其特征是肺微血管通透性增高、肺水腫、低氧血癥，以及局部或全身肺部炎癥程度明顯增加^[2]。盡管 ARDS 的治療策略已經取得了進步，但 ARDS 在重癥患者死亡中仍然占有相當大的比例^[3]。越來越多的證據表明，β2 受體激動劑（沙美特羅、福莫特羅）等藥物雖可用于治療 ARDS，但會導致包括毒性肝臟和應激障礙、偏執和抑郁等不良反應，且臨床藥物治療基本無效^[4]。近年來，微小 RNA（miRNA，miR）被認為是 ARDS 的診斷生物標志物或治療靶點^[5]。miR-499a-5p 可作為肺癌的治療靶點，且能夠保護心肌免受缺血損傷^[6-7]。雖有報道稱 miR-499 在 ARDS 患者血清中低表達，但對其在 ARDS 的作用及機制尚不清楚^[8]。基質金屬蛋白酶-16（MMP-16）蛋白能夠激活基質金屬蛋白酶-2（MMP-2），而已有研究表明 MMP-2 在 ARDS 中高表達，下調 MMP-2 能夠抑制 ARDS 引起的損傷^[9]。眾多研究表明激活核因子 E2 相關因子 2（Nrf2）信號通路能夠預防急性肺損傷^[10]。基于上述文獻，本研究主要通過 MMP-16 和 Nrf2 信號通路兩方面來研究 miR-499a-5p 對 ARDS 大鼠的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料

健康雄性 SD 大鼠 84 只，清潔級（8～9 周齡），體重 240～280 g，購自四川夏派森醫藥科技有限公司［許可證：SYXK（川）2017-203］。所有大鼠均于 24 ℃、相對濕度 50%、無特異性病原體環境中飼養，光照和黑暗交替 12 h。該研究經西南醫科大學附屬醫院倫理委員會審查并批準［批準號 XNYKDXFSYY-2019012］。

miR-499a-5p 模擬物序列及 MMP-16 過表達質粒及各引物均由上海基因制藥有限公司設計并合成。D-呋喃核糖基苯并咪唑（DRB；美國 Sigma 公司)，QIAzol 裂解試劑（北京鴻躍創新科技有限公司），cDNA 逆轉錄試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司），SYBR-Green PCR 試劑盒（賽默飛世爾科技公司），脫氧核糖核酶Ⅰ（DNase Ⅰ，北京鼎國生物技術），DMEM 培養基、胰蛋白酶和胎牛血清（美國 Gibco 公司），溶液Ⅰ配制（NaCl 140 mmol/L、KCl 5 mmol/L、Na₂HPO₄ 2.5 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖 6 mmol/L、pH 7.4)，溶液Ⅱ配制（NaCl 140 mmol/L、KCl 5 mmol/L、CaCl₂ 2 mmol/L、MgSO₄ 1.3 mmol/L、Na₂HPO₄ 2.5 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖 6 mmol/L、pH 7.4），雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（北京原平皓生物技術有限公司），RIPA 裂解緩沖液（南京海克爾生物科技有限公司），二辛可酸（BCA）試劑盒（上海易色醫療科技有限公司），Nrf2 抗體（上海艾博抗生物科技有限公司），還原型輔酶/醌氧化還原酶（NQO1）抗體（上海艾博抗生物科技有限公司），血紅素加氧酶（HO）-1 抗體（上海艾博抗生物科技有限公司），白細胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海聯碩生物刻科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 試驗動物分組、模型建立及處理^[11]

將大鼠隨機分為 7 組（n=12）：假手術組（Sham 組）、模型組（Model 組）、miR-499a-5p 模擬物組、MMP-16 組、miR-499a-5p 模擬物+MMP-16 組、Nrf2 信號通路抑制劑 DRB 組、miR-499a-5p 模擬物+DRB 組。所有大鼠術前禁食 12 h。大鼠麻醉后，固定在手術臺上，然后去除腹部毛發；切開大鼠腹部，取出 Sham 組大鼠盲腸縫合，暴露于大鼠腹部，其余組大鼠盲腸中央用絲線結扎；用穿刺針從腸系膜一側穿刺盲腸至另一側；取出適量的腸內容物，縫合盲腸。術前 1 h，將大鼠麻醉后固定于手術臺上，頸部除毛；用微型注射器將 50 μL的轉染復合物（miR-499a-5p 模擬物、MMP-16 過表達質粒）注入氣管；轉染后，將大鼠直立旋轉，使轉染復合物均勻分布于肺內。DRB 組和 miR-494 模擬物+DRB 組大鼠在模型建立前 30 min 腹腔注射 DRB（5 mg/kg）。術后 24 h 處死大鼠，開胸結扎大鼠肺。肺灌洗后收集支氣管肺泡灌洗液（BALF）。將肺左葉部分–80 ℃ 保存，提取總蛋白和 RNA，將肺左葉部分浸泡在 10% 甲醛中，進行組織學檢測。切除右肺中葉，稱濕重。然后在恒溫箱中 56 ℃ 干燥 72 h，再次稱重，記為干重。計算濕干重比（W/D）。

1.2.2 RT-qPCR 檢測肺組織中 miR-499a-5p 和 MMP-16 表達水平

用 Trizol 試劑盒從左肺組織中提取總 RNA。采用分光光度計測定 RNA 中 D260/D280 的比例和 RNA 的濃度。D260/D280 范圍 1.8～2.0 為提取 RNA 的高純度，用于進一步檢測。按照 cDNA 逆轉錄試劑盒和 qPCR 試劑盒的說明書分別將 RNA 逆轉錄成 cDNA 并制備 qPCR 體系。反應采用實時 PCR 儀進行。反應條件：95 ℃ 預變性 15 min，95 ℃ 預變性 10 s，40 個循環，65 ℃ 退火延伸 30 s。引物序列由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列如下：GAPDH 的上游引物序列：5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3'；GAPDH 的下游引物序列：5'-GCCATCACGCCACAGTTTC-3'。miR-499a-5p 的上游引物序列：5'-ACTGCTTAAGACTTGGAGTGA-3'；miR-499a-5p 的下游引物序列：5'-TACATTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3'。MMP-16 的上游引物序列：5'-TGGCCAATCCGGGCCATGACCT-3'；MMP-16 的下游引物序列：5'-TGGCCTCTAAGGCCTTATTTA-3'。

1.2.3 大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離^[12]

取模型組大鼠肺組織，經肺動脈用溶液Ⅱ灌洗肺，氣管通氣 8 次，經氣管插管用溶液 Ι 灌洗肺 8 次，再用溶液Ⅱ灌洗 3 次，用胰蛋白酶注入肺，快速取出肺，37 ℃ 水浴 30 min，去除大氣道，在含有 DNase Ⅰ 的小燒杯中剪碎肺，用胎牛血清滅活胰蛋白酶，補足溶液Ⅱ倒入燒杯中，37 ℃ 水浴振蕩 5 min，200 目濾網過濾 800 r/min 離心 10 min，棄上清，用 DMEM 重懸細胞，即獲得肺泡Ⅱ型上皮細胞。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因驗證靶向關系

利用生物預測網站（http://www.targetscan.org）預測 miR-499a-5p 與 MMP-16 的靶點關系，以及 miR-499a-5p 與 MMP-16 3’UTR 的結合位點，并通過雙熒光素酶報告基因檢測進行鑒定。合成含有 miR-499a-5p 結合位點的 MMP-16 3'UTR 啟動子序列，構建 MMP-16 3'UTR 野生型（WT）質粒。在此質粒的基礎上，構建突變型（MUT）MMP-16 3’UTR 質粒，結合位點發生突變。上述質粒由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，根據質粒提取試劑盒進行操作。將 MMP-16 3’UTR WT 和 MUT 熒光素酶報告質粒分別與 miR-499a-5p 共轉染肺泡Ⅱ型上皮細胞。48 h 后收集細胞進行裂解，熒光素酶活性測定采用熒光測定試劑盒。采用 Glomax 20/20 發光計測定熒光素酶活性。實驗重復 3 次。

1.2.5 蘇木素–伊紅染色觀察肺損傷

將左肺組織塊固定 24 h 后，用二甲苯脫水，石蠟包埋，切片，干燥，脫蠟。隨后，切片進行蘇木素–伊紅（HE）染色，蘇木素染色 5 min 后蒸餾水沖洗，乙醇鹽酸顯色，然后用伊紅染色 2 min，脫水、清除、干燥、裱裝。用光學顯微鏡觀察組織學變化并拍照。

1.2.6 ELISA 法檢測 BALF 中炎癥因子水平和肺組織中氧化應激水平

收集各組 BALF，離心 10 min。收集上清液，使用 IL-1β、IL-6、TNF-α 酶聯免疫試劑盒檢測 IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。每個樣品重復 3 次。收集大鼠的肺，裂解肺組織，使用酶聯免疫試劑盒測定丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）、總抗氧化（TAOC）的水平。

1.2.7 蛋白印跡法分析肺組織中 NQO1、HO-1 和 Nrf2 蛋白表達水平

取各組大鼠左肺組織提取蛋白，采用 BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將 30 μg 提取的蛋白質 10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳電壓分離后，樣品濕法轉移到聚偏氟乙烯膜上，然后在 10% 脫脂牛奶中室溫封膜 1 h。樣本與抗體 I（NQO1 1∶1 000、HO-1 1∶500、Nrf2 1∶1 000），在 4 ℃ 孵育過夜。TBST 沖洗 3 次，然后加入用辣根過氧化物酶標記的二級抗體 IgG 山羊抗兔多克隆抗體，在 37 ℃ 孵育 2 h。TBST 沖洗 3 次，用二氨基苯并苯胺制備了膜。GAPDH 作為內參，薄膜由 Bio-rad 凝膠 Doc EZ 成像儀拍攝，利用 Image J 軟件分析目標蛋白帶的灰度值比值。

1.3 統計學方法

采用 SPSS 21.0 統計軟件。采用非配對 t 檢驗比較兩組數據的正態分布和方差齊性，呈正態分布的測量數據用均數±標準差（±s）表示。兩組間比較采用 LSD-t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-499a-5p 和 MMP-16 在 ARDS 模型大鼠肺中的表達

如圖 1 所示，與 Sham 組相比，模型組大鼠肺組織中 miR-499a-5p 表達明顯下調（P<0.01），MMP-16 mRNA 表達明顯上調（P<0.01），說明 miR-499a-5p 在 ARDS 模型大鼠的肺中低表達，而 MMP-16 高表達。與 Model 組相比，miR-499a-5p 模擬物組 miR-499a-5p 表達明顯上調（P<0.01），MMP-16 mRNA 表達明顯下調（P<0.01），MMP-16 組 miR-499a-5p 表達明顯下調（P<0.01），MMP-16 mRNA 表達明顯上調（P<0.01），說明轉染成功。

圖1 RT-qPCR 檢測肺組織中 miR-499a-5p 和 MMP-16 mRNA 表達水平（n=3，

）　

與 Sham 組比較，^&P<0.01；與 Model 組比較，^*P<0.01；與 miR-499a-5p 模擬物組比較，^#P<0.01。

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