引用本文： 徐曉榮, 王海濱, 白曉月, 蘇新云, 郭冉. miR-146a-3p 靶向 TLR4 減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(7): 495-502. doi: 10.7507/1671-6205.202005034 復制
急性肺損傷（ALI）是呼吸系統常見急危重癥，發病率和病死率均非常高，年病死率大于 40%[1]。脂多糖（LPS）是 ALI 的主要誘發因素之一，其實質是誘導肺中各種炎癥細胞的活化和浸潤以及炎癥介質的釋放，從而導致肺損傷[2]。同時，更多的炎性細胞被激活，更多的炎性介質被釋放，這進一步放大并增強了肺損傷信號，導致肺泡–毛細血管膜損傷[3]。因此，抑制炎癥反應及其后續級聯擴增作用對于控制 ALI 疾病進展以及降低 ALI 患者病死率非常重要，研究 ALI 的分子機制以設計更有效和有用的治療靶標甚為必要[4]。微小 RNA（miR）-146a 屬于 miR-146 家族，能夠調節多種炎性因子的表達，發揮抗炎作用[5]。研究已證明諸多 miR 參與 ALI 的發展[6]。長鏈非編碼 RNA MALAT1 通過上調 miR-146a 表達在抑制 LPS 誘導的 ALI 的炎癥反應[7]。Toll 樣受體（TLRs）家族中的 TLR4 是 LPS 的受體，它與先天性免疫系統關系密切。應盼等[8]研究表明烏司他丁通過 miR-146a/TLR4/NF-κB 信號緩解創傷失血性休克大鼠的肺部炎癥。但并未證實 miR-146a 和 TLR4 之間的靶向關系，且 miR-146a 和 TLR4 在 LPS 誘導的 ALI 中的作用尚未報道。本研究主要探討 miR-146a-3p 靶向負調控 TLR4 對 LPS 誘導的小鼠 ALI 和炎癥反應的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
miR 激動劑陰性對照（agomiR-NC）、miR-146a-3p 激動劑（agomiR-146a-3p）、過表達 miR-146a-3p（miR-146a-3p mimic）、過表達 Toll 樣受體 4（pcDNA3.1-TLR4，pc-TLR4）質粒及所需引物均由上海生工生物科技有限公司設計并合成。LPS（貨號 L2630）、原位末端轉移酶標記法（TUNEL）試劑盒（美國 Sigma 公司，貨號 06432344001）；miRNeasy 試劑盒（德國 Qiagen，貨號 217004）；cDNA 逆轉錄試劑盒 PrimeScript RT Master Mix（貨號 RR036A）、TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（寶生物工程大連有限公司，貨號 RR820Q）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（貨號 P0012）、蘇木精–伊紅（HE）染色試劑盒（貨號 C0105）、青霉素和鏈霉素雙抗溶液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號 C0222）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、Bcl-2 相關 X 蛋白（Bax）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、TLR4 兔來源的單克隆抗體（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號 ab6721、ab214430、ab182733、ab182858、ab13556）；RPMI-1640 培養基（貨號 ATCC 30-2001）、胎牛血清（上海素爾生物科技有限公司，貨號 SH30406.05），Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國 Thermo Fisher 公司，貨號 11668-019）；白細胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，貨號 ml063159、ml063132、ml002095）。
1.2 方法
1.2.1 分組、模型建立及處理
32 只 BALB/c 小鼠（雄性，6～8 周齡，18～20 g）購自山東斯科貝斯生物科技股份有限公司，許可證號 SCXK（魯）2016 0001。本實驗中所有動物操作均已獲得倫理委員會的批準，實驗動物的飼養和管理均嚴格遵守相關法律法規。小鼠飼養于山東斯科貝斯生物科技股份有限公司動物飼養室。先適應飼養 1 周，（24±1）℃，相對濕度 65%，12 h 的光/暗循環，自由飲食和飲水。將小鼠隨機分為假手術組、ALI 組、ALI+agomiR-NC 組、ALI+agomiR-146a-3p 組，每組 8 只。切開頸部皮膚分離暴露氣管后，行氣管穿刺向支氣管內緩慢滴注 LPS（5 mg/kg）以建立 ALI 模型[9]。假手術組者滴入等量生理鹽水。ALI+agomiR-146a-3p/NC 組小鼠在制備 ALI 模型前 3 d 開始給予尾靜脈注射 8 mg/kg agomiR-146a-3p 或 agomiR-NC，1 次/d，持續 3 d；假手術組和 ALI 組給予尾靜脈注射等量生理鹽水。造模 24 h 后處死并收集肺組織。
1.2.2 細胞培養和分組、處理
人正常肺細胞 MRC-5 購自寧波明舟生物科技有限公司（貨號 165193）。細胞在常規 RPMI-1640 培養基（含 10% 胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和 100 μg/mL 的鏈霉素），于濟南市人民醫院細胞實驗室的培養箱（溫度為 37 ℃、體積分數為 5% CO2）培養。將細胞分為對照組、LPS 組、LPS+過表達 miR-146a-3p 組（LPS+miR-146a-3p mimic 組）、LPS+過表達 TLR4 組（LPS+pc-TLR4 組）、LPS+miR-146a-3p mimic+pc-TLR4 組。當細胞融合達到 80% 時，按照 Lipofectamine 2000 說明書將 100 nmol/L 的 miR-146a-3p mimic、pc-TLR4 質粒分別或聯合轉染進入 MRC-5 細胞。轉染 24 h 后，將 MRC-5 細胞用 1 000 ng/mL 的 LPS 或生理鹽水處理 72 h。
1.2.3 RT-qPCR 檢測肺組織中 miR-146a-3p mRNA 和 TLR4 mRNA 的表達[6 ]
使用 miRNeasy 試劑盒從肺組織和細胞系中提取總 RNA，并用 Nano-Drop 分光光度計測量 RNA 質量和濃度。用 PrimeScript RT Master Mix Kit 將 mRNA 反轉錄為 cDNA，并按 TB Green PCR 試劑盒說明擴增并檢測 mRNA。miR-146a-3p 的循環條件：95 ℃ 20 s 和 59 ℃ 40 s 的 40 個循環，用 U6 標準化。TLR4 的循環條件為：94 ℃ 20 s 和 60 ℃ 60 s 的 40 個循環，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）標準化。每個樣品進行 3 次重復分析。使用 2－ΔΔct方法計算。引物序列如下：miR-146a-3p 的上游引物序列 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'，下游引物序列 5'-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3'；TLR4 的上游引物序列 5'-CGAGGAAGAGAAGACACCAGT-3'，下游引物序列 5'- CATCATCCTCACTGCTTCTGT-3'；U6 的上游引物序列 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；GAPDH 的上游引物序列 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'；下游引物序列 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。
1.2.4 蛋白印跡檢測 TLR4、活化的 caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達水平[7 ]
用 RIPA 裂解液提取 1.2.1 步驟各組肺組織和 1.2.2 步驟各組細胞總蛋白，并用 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，然后經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至 PVDF 膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白 2 h，再加入兔來源的單克隆一抗（TLR4 1∶1 000、活化的 caspase-3 1∶500、Bax 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000）在 4 ℃ 封閉過夜，接著加入對應山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫封閉 1 h，最后滴電化學反應液曝光，以 GAPDH 為內參，使用 Quantity One 軟件進行分析蛋白條帶灰度，以目標蛋白與內參蛋白 GAPDH 積分吸光度值比值表示蛋白的表達水平。
1.2.5 HE 染色觀察肺組織病理變化[9 ]
將小鼠肺用 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，石蠟包埋切成 4 μm 的切片，干燥，脫蠟。根據 HE 染色試劑盒說明進行 HE 染色，并在 400 倍顯微鏡觀察組織學變化。
1.2.6 TUNEL 檢測肺組織細胞凋亡情況[9 ]
按照 TUNEL 試劑盒說明書將 4 μm 的肺組織石蠟切片進行 TUNEL 染色，其中細胞核被染為棕褐色的為凋亡細胞。在 400 倍顯微鏡下隨機選取 8 個視野，棕褐色細胞數與總細胞數的比值即為細胞凋亡率。
1.2.7 ELISA 檢測 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 表達水平[10 ]
將肺組織在 PBS 中按 1∶10 勻漿，然后在 4 ℃ 14 000 r/min 下離心 10 min，收集上清液。收集 MRC-5 細胞培養上清液。根據相應 ELISA 試劑盒說明書測定肺組織和細胞上清液中的促炎細胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達水平。
1.2.8 TargetScan 軟件預測結合靶點[6 ]
通過軟件 TargetScan（
1.2.9 雙熒光素酶報告系統檢測靶向關系[6 ]
MRC-5 細胞接種在 24 孔板中，并孵育 24 h。將 1 μg 螢火蟲熒光素酶報告基因構建體 PGL3-TLR4-WT（TLR4 野生型）或 PGL3-TLR4-MUT（TLR4 突變型）以及 miR-146a-3p mimic 或 mimic-NC 和 PRL-CMV 海腎熒光素酶報告質粒轉染細胞，轉染 48 h 后，MRC-5 細胞裂解 15 min，雙熒光素酶檢測系統測量熒光素酶的相對活性。熒光素酶的相對活性用螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值表示。
1.2.10 流式細胞術檢測細胞凋亡率[11 ]
取 1.2.2 步驟處理的細胞，用 5 μL Annexin-V- FITC 和 5 μL PI 雙標記后，用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件。數據經 Shapiro-wilk 檢驗發現均呈正態分布，以均數±標準差（
±s）表示，多組比較進行 One-way ANOVA 分析，兩組比較使用 SNK 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺組織中 miR-146a-3p 表達下調，而 TLR4 表達上調
與假手術組相比，ALI 組小鼠肺組織中 miR-146a-3p mRNA 表達下調，而 TLR4 mRNA 和蛋白表達均上調（均 P<0.05）；與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織中 miR-146a-3p 和 TLR4 表達無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺組織中 miR-146a-3p 表達上調，而 TLR4 mRNA 和蛋白表達均下調（均 P<0.05）。結果見圖 1。
圖1
ALI 小鼠肺組織中 miR-146a-3p 和 TLR4 表達變化
a. RT-qPCR 檢測肺組織中 miR-146a-3p 表達水平；b. RT-qPCR 檢測肺組織中 TLR4 mRNA 的表達水平；c、d. 蛋白印跡檢測肺組織中 TLR4 蛋白的表達水平。與假手術組比較，*
2.2 miR-146a-3p 減輕 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺損傷
假手術組小鼠肺結構清晰完整，肺泡結構清晰，肺泡壁較薄，肺泡腔無炎性浸潤，滲出或血性排出；ALI 組小鼠肺泡結構受損，肺泡腔炎性細胞浸潤，肺泡間質出血，肺泡腔內透明膜形成。與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺病理程度明顯減輕（圖 2a）。與假手術組相比，ALI 組小鼠肺組織細胞凋亡率增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，而 Bcl-2 蛋白表達下調（均 P<0.05）；與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織細胞凋亡率、活化的 caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺組織細胞凋亡率減少，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達下調，而 Bcl-2 蛋白表達上調（均 P<0.05，圖 2b～e）。
圖2
miR-146a-3p 減輕 ALI 小鼠肺損傷
a. 各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）：假手術組小鼠肺泡形態規則，結構清晰完整；ALI 小鼠肺泡壁增厚，肺泡腔內可見大量炎性細胞；ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠較 ALI 小鼠肺組織病變學改變明顯減輕。b. TUNEL 檢測肺組織細胞凋亡情況（×200）：凋亡細胞染色為棕褐色，假手術組小鼠肺組織凋亡細胞寥寥無幾；ALI 小鼠肺組織可見大量棕褐色細胞；ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠較 ALI 小鼠肺組織凋亡細胞明顯減少。c. TUNEL 檢測細胞凋亡率統計圖。d、e. 蛋白印跡檢測活化的 caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達水平。與假手術組比較，*
2.3 miR-146a-3p 減輕 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺部炎癥反應
與假手術組相比，ALI 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）；與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量減少（均 P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
miR-146a-3p 減輕 ALI 小鼠肺部炎癥反應
a. ELISA 檢測肺組織中 TNF-α 表達水平；b. ELISA 檢測肺組織中 IL-6 表達水平；c. ELISA 檢測肺組織中 IL-1β 表達水平。與假手術組比較，*
2.4 miR-146a-3p 靶向下調 TLR4 表達
TargetScan 軟件預測結果表明，miR-146a-3p 與 TLR4 在 3’UTR 區存在結合位點（圖 4a）；雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-146a-3p mimic 與 PGL3-TLR4-WT 共轉染顯著降低了熒光素酶活性（P<0.05，圖 4b）。與對照組相比，LPS 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達上調（P<0.05）；與 LPS 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達下調，LPS+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達上調（均 P<0.05，圖 4c、d）；與 LPS+miR-146a-3p mimic 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達上調（P<0.05，圖 4c、d）。
圖4
miR-146a-3p 靶向下調 TLR4 表達
a. TargetScan 軟件預測 miR-146a-3p 與 TLR4 靶點；b. 雙熒光素酶報告實驗驗證 miR-146a-3p 與 TLR4 的靶向關系；c. 蛋白印跡檢測 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達水平；d. TLR4 蛋白相對表達量統計。與對照組比較，*
2.5 miR-146a-3p 靶向 TLR4 抑制 LPS 誘導的 MRC-5 細胞凋亡和炎癥反應
與對照組相比，LPS 組 MRC-5 細胞凋亡增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）；與 LPS 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic 組 MRC-5 細胞凋亡減少，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達下調，Bcl-2 蛋白表達上調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量減少，LPS+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞凋亡增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）；與 LPS+miR-146a-3p mimic 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞凋亡增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）。結果見圖 5。
圖5
miR-146a-3p 靶向 TLR4 抑制 LPS 誘導的 MRC-5 細胞凋亡和炎癥反應
a. 流式細胞術檢測 MRC-5 細胞凋亡結果；b. 細胞凋亡率統計；c. 蛋白印跡檢測 MRC-5 細胞中活化的 caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達水平；d. 蛋白相對表達量統計；e. ELISA 檢測 MRC-5 細胞 TNF-α 表達水平；f. ELISA 檢測 MRC-5 細胞 IL-6 表達水平；g. ELISA 檢測 MRC-5 細胞 IL-1β 表達水平。與對照組比較，*
3 討論
ALI 主要特征是過度的炎癥反應，引起彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致肺水腫、肺不張、毛細血管通透性增加以及肺部氣體交換障礙[12]。LPS 被認為是 ALI 發病機制中的重要刺激因素，可引起急性炎癥反應，并造成肺部病理學改變[13]。LPS 所致 ALI 動物模型表現出與臨床 ALI 患者相似特征，因此，本研究采用氣管滴入 LPS 的方法建立小鼠 ALI 模型[13]。本研究的 ALI 小鼠與臨床 ALI 患者肺部表現相一致，均出現肺泡結構受損、肺泡腔炎性細胞浸潤等現象，表明本研究的 ALI 動物模型是成功的。ALI 的發病機制和預后與機體的免疫反應密切相關。研究表明，miR 在體內豐富、敏感、高效，作為一類新的免疫調節因子參與先天免疫反應和炎癥反應的調控[14]。利用與炎癥相關的 miR 靶向治療來減少炎癥可能是治療 ALI 的一種新的有效手段。同研究 miR-146a 在嚴重燒傷所致 ALI 大鼠中表達明顯下調[15]相一致，本研究表明 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺組織中 miR-146a-3p 表達下調，而 miR-146a-3p 過表達明顯減輕 ALI 小鼠肺病理程度。
通常凋亡被認為是正常細胞的一種保護行為，然而 ALI 進展過程中過度的細胞凋亡會導致肺泡上皮細胞和血管內皮細胞的損傷，因此有效地抑制肺細胞的凋亡可減輕 ALI[16]。本研究結果表明，miR-146a-3p 高表達減少 ALI 小鼠肺組織細胞凋亡率，下調活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達，上調 Bcl-2 蛋白表達。這同 miR-34b-5p 通過靶向前顆粒蛋白減輕了 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺部細胞凋亡結果相似[17]。
LPS 通過激活 TLR 觸發炎癥反應，然后將中性粒細胞募集到炎癥部位[18]。炎癥反應和細胞因子蓄積在 ALI 的發病機制和發展中起著重要作用[18]。LPS 誘導肺中各種炎癥細胞的活化和浸潤以及一系列炎癥介質（TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等）的釋放，從而導致肺損傷[19]。有效抑制肺部炎癥反應可減輕 ALI，例如 miR-16 可通過調節 TLR4/NF-κB 通路抑制炎癥反應來預防小鼠 ALI[20]。本研究表明用 LPS 處理的 ALI 小鼠的肺中 TLR4 表達增加，并促進 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等細胞因子的分泌。過表達 miR-146a-3p 可顯著下調 TLR4 的表達，減少 ALI 小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量。因此猜測 miR-146a-3p 可能通過靶向負調控 TLR4 的表達減輕 LPS 誘導的小鼠 ALI。本研究在常用的人肺 MRC-5 細胞系中證實 miR-146a-3p 靶向下調 TLR4 的表達，并通過一系列細胞實驗證實 TLR4 高表達逆轉 miR-146a-3p 對 MRC-5 細胞凋亡和炎癥反應的作用。因此，本研究表明 miR-146a-3p 通過靶向下調 TLR4 抑制 LPS 誘導的細胞凋亡和炎癥反應，從而緩解小鼠 ALI。
研究表明 TLR4 與髓樣分化因子 88（MYD88）相互作用并激活 IκB 激酶（IKK），最終導致 p65 的磷酸化，磷酸化的 p65 可引起促炎性細胞因子（如 IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的分泌，而這些促炎性細胞因子會誘導過度炎癥，從而導致組織損傷[21]。因此，TLR4 是否通過調節 MYD88/IKK/p65 通路參與 LPS 誘導的 ALI 是本實驗室下一步的研究計劃。
綜上，本研究通過體內體外實驗證明 miR-146a-3p 通過靶向下調 TLR4 減輕 LPS 誘導的小鼠 ALI，提示 miR-146a-3p 和 TLR4 可能是干預 ALI 發生和發展的潛在分子靶標，從而為 ALI 的治療提供了新的方向。但是具體分子通路還有待深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
急性肺損傷（ALI）是呼吸系統常見急危重癥，發病率和病死率均非常高，年病死率大于 40%[1]。脂多糖（LPS）是 ALI 的主要誘發因素之一，其實質是誘導肺中各種炎癥細胞的活化和浸潤以及炎癥介質的釋放，從而導致肺損傷[2]。同時，更多的炎性細胞被激活，更多的炎性介質被釋放，這進一步放大并增強了肺損傷信號，導致肺泡–毛細血管膜損傷[3]。因此，抑制炎癥反應及其后續級聯擴增作用對于控制 ALI 疾病進展以及降低 ALI 患者病死率非常重要，研究 ALI 的分子機制以設計更有效和有用的治療靶標甚為必要[4]。微小 RNA（miR）-146a 屬于 miR-146 家族，能夠調節多種炎性因子的表達，發揮抗炎作用[5]。研究已證明諸多 miR 參與 ALI 的發展[6]。長鏈非編碼 RNA MALAT1 通過上調 miR-146a 表達在抑制 LPS 誘導的 ALI 的炎癥反應[7]。Toll 樣受體（TLRs）家族中的 TLR4 是 LPS 的受體，它與先天性免疫系統關系密切。應盼等[8]研究表明烏司他丁通過 miR-146a/TLR4/NF-κB 信號緩解創傷失血性休克大鼠的肺部炎癥。但并未證實 miR-146a 和 TLR4 之間的靶向關系，且 miR-146a 和 TLR4 在 LPS 誘導的 ALI 中的作用尚未報道。本研究主要探討 miR-146a-3p 靶向負調控 TLR4 對 LPS 誘導的小鼠 ALI 和炎癥反應的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
miR 激動劑陰性對照（agomiR-NC）、miR-146a-3p 激動劑（agomiR-146a-3p）、過表達 miR-146a-3p（miR-146a-3p mimic）、過表達 Toll 樣受體 4（pcDNA3.1-TLR4，pc-TLR4）質粒及所需引物均由上海生工生物科技有限公司設計并合成。LPS（貨號 L2630）、原位末端轉移酶標記法（TUNEL）試劑盒（美國 Sigma 公司，貨號 06432344001）；miRNeasy 試劑盒（德國 Qiagen，貨號 217004）；cDNA 逆轉錄試劑盒 PrimeScript RT Master Mix（貨號 RR036A）、TB Green? Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（寶生物工程大連有限公司，貨號 RR820Q）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（貨號 P0012）、蘇木精–伊紅（HE）染色試劑盒（貨號 C0105）、青霉素和鏈霉素雙抗溶液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號 C0222）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、Bcl-2 相關 X 蛋白（Bax）、B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、TLR4 兔來源的單克隆抗體（上海艾博抗生物科技有限公司，貨號 ab6721、ab214430、ab182733、ab182858、ab13556）；RPMI-1640 培養基（貨號 ATCC 30-2001）、胎牛血清（上海素爾生物科技有限公司，貨號 SH30406.05），Lipofectamine 2000 轉染試劑（美國 Thermo Fisher 公司，貨號 11668-019）；白細胞介素（IL）-6、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，貨號 ml063159、ml063132、ml002095）。
1.2 方法
1.2.1 分組、模型建立及處理
32 只 BALB/c 小鼠（雄性，6～8 周齡，18～20 g）購自山東斯科貝斯生物科技股份有限公司，許可證號 SCXK（魯）2016 0001。本實驗中所有動物操作均已獲得倫理委員會的批準，實驗動物的飼養和管理均嚴格遵守相關法律法規。小鼠飼養于山東斯科貝斯生物科技股份有限公司動物飼養室。先適應飼養 1 周，（24±1）℃，相對濕度 65%，12 h 的光/暗循環，自由飲食和飲水。將小鼠隨機分為假手術組、ALI 組、ALI+agomiR-NC 組、ALI+agomiR-146a-3p 組，每組 8 只。切開頸部皮膚分離暴露氣管后，行氣管穿刺向支氣管內緩慢滴注 LPS（5 mg/kg）以建立 ALI 模型[9]。假手術組者滴入等量生理鹽水。ALI+agomiR-146a-3p/NC 組小鼠在制備 ALI 模型前 3 d 開始給予尾靜脈注射 8 mg/kg agomiR-146a-3p 或 agomiR-NC，1 次/d，持續 3 d；假手術組和 ALI 組給予尾靜脈注射等量生理鹽水。造模 24 h 后處死并收集肺組織。
1.2.2 細胞培養和分組、處理
人正常肺細胞 MRC-5 購自寧波明舟生物科技有限公司（貨號 165193）。細胞在常規 RPMI-1640 培養基（含 10% 胎牛血清、100 U/mL 的青霉素和 100 μg/mL 的鏈霉素），于濟南市人民醫院細胞實驗室的培養箱（溫度為 37 ℃、體積分數為 5% CO2）培養。將細胞分為對照組、LPS 組、LPS+過表達 miR-146a-3p 組（LPS+miR-146a-3p mimic 組）、LPS+過表達 TLR4 組（LPS+pc-TLR4 組）、LPS+miR-146a-3p mimic+pc-TLR4 組。當細胞融合達到 80% 時，按照 Lipofectamine 2000 說明書將 100 nmol/L 的 miR-146a-3p mimic、pc-TLR4 質粒分別或聯合轉染進入 MRC-5 細胞。轉染 24 h 后，將 MRC-5 細胞用 1 000 ng/mL 的 LPS 或生理鹽水處理 72 h。
1.2.3 RT-qPCR 檢測肺組織中 miR-146a-3p mRNA 和 TLR4 mRNA 的表達[6 ]
使用 miRNeasy 試劑盒從肺組織和細胞系中提取總 RNA，并用 Nano-Drop 分光光度計測量 RNA 質量和濃度。用 PrimeScript RT Master Mix Kit 將 mRNA 反轉錄為 cDNA，并按 TB Green PCR 試劑盒說明擴增并檢測 mRNA。miR-146a-3p 的循環條件：95 ℃ 20 s 和 59 ℃ 40 s 的 40 個循環，用 U6 標準化。TLR4 的循環條件為：94 ℃ 20 s 和 60 ℃ 60 s 的 40 個循環，用甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）標準化。每個樣品進行 3 次重復分析。使用 2－ΔΔct方法計算。引物序列如下：miR-146a-3p 的上游引物序列 5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3'，下游引物序列 5'-GGGTGAGAACTGAATTCCA-3'；TLR4 的上游引物序列 5'-CGAGGAAGAGAAGACACCAGT-3'，下游引物序列 5'- CATCATCCTCACTGCTTCTGT-3'；U6 的上游引物序列 5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，下游引物序列 5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；GAPDH 的上游引物序列 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3'；下游引物序列 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'。
1.2.4 蛋白印跡檢測 TLR4、活化的 caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達水平[7 ]
用 RIPA 裂解液提取 1.2.1 步驟各組肺組織和 1.2.2 步驟各組細胞總蛋白，并用 BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，然后經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至 PVDF 膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白 2 h，再加入兔來源的單克隆一抗（TLR4 1∶1 000、活化的 caspase-3 1∶500、Bax 1∶1 000、GAPDH 1∶1 000）在 4 ℃ 封閉過夜，接著加入對應山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫封閉 1 h，最后滴電化學反應液曝光，以 GAPDH 為內參，使用 Quantity One 軟件進行分析蛋白條帶灰度，以目標蛋白與內參蛋白 GAPDH 積分吸光度值比值表示蛋白的表達水平。
1.2.5 HE 染色觀察肺組織病理變化[9 ]
將小鼠肺用 4% 多聚甲醛固定 24 h 后，石蠟包埋切成 4 μm 的切片，干燥，脫蠟。根據 HE 染色試劑盒說明進行 HE 染色，并在 400 倍顯微鏡觀察組織學變化。
1.2.6 TUNEL 檢測肺組織細胞凋亡情況[9 ]
按照 TUNEL 試劑盒說明書將 4 μm 的肺組織石蠟切片進行 TUNEL 染色，其中細胞核被染為棕褐色的為凋亡細胞。在 400 倍顯微鏡下隨機選取 8 個視野，棕褐色細胞數與總細胞數的比值即為細胞凋亡率。
1.2.7 ELISA 檢測 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 表達水平[10 ]
將肺組織在 PBS 中按 1∶10 勻漿，然后在 4 ℃ 14 000 r/min 下離心 10 min，收集上清液。收集 MRC-5 細胞培養上清液。根據相應 ELISA 試劑盒說明書測定肺組織和細胞上清液中的促炎細胞因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的表達水平。
1.2.8 TargetScan 軟件預測結合靶點[6 ]
通過軟件 TargetScan（
1.2.9 雙熒光素酶報告系統檢測靶向關系[6 ]
MRC-5 細胞接種在 24 孔板中，并孵育 24 h。將 1 μg 螢火蟲熒光素酶報告基因構建體 PGL3-TLR4-WT（TLR4 野生型）或 PGL3-TLR4-MUT（TLR4 突變型）以及 miR-146a-3p mimic 或 mimic-NC 和 PRL-CMV 海腎熒光素酶報告質粒轉染細胞，轉染 48 h 后，MRC-5 細胞裂解 15 min，雙熒光素酶檢測系統測量熒光素酶的相對活性。熒光素酶的相對活性用螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性比值表示。
1.2.10 流式細胞術檢測細胞凋亡率[11 ]
取 1.2.2 步驟處理的細胞，用 5 μL Annexin-V- FITC 和 5 μL PI 雙標記后，用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 統計軟件。數據經 Shapiro-wilk 檢驗發現均呈正態分布，以均數±標準差（±s）表示，多組比較進行 One-way ANOVA 分析，兩組比較使用 SNK 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺組織中 miR-146a-3p 表達下調，而 TLR4 表達上調
與假手術組相比，ALI 組小鼠肺組織中 miR-146a-3p mRNA 表達下調，而 TLR4 mRNA 和蛋白表達均上調（均 P<0.05）；與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織中 miR-146a-3p 和 TLR4 表達無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺組織中 miR-146a-3p 表達上調，而 TLR4 mRNA 和蛋白表達均下調（均 P<0.05）。結果見圖 1。
圖1
ALI 小鼠肺組織中 miR-146a-3p 和 TLR4 表達變化
a. RT-qPCR 檢測肺組織中 miR-146a-3p 表達水平；b. RT-qPCR 檢測肺組織中 TLR4 mRNA 的表達水平；c、d. 蛋白印跡檢測肺組織中 TLR4 蛋白的表達水平。與假手術組比較，*
2.2 miR-146a-3p 減輕 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺損傷
假手術組小鼠肺結構清晰完整，肺泡結構清晰，肺泡壁較薄，肺泡腔無炎性浸潤，滲出或血性排出；ALI 組小鼠肺泡結構受損，肺泡腔炎性細胞浸潤，肺泡間質出血，肺泡腔內透明膜形成。與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺病理程度明顯減輕（圖 2a）。與假手術組相比，ALI 組小鼠肺組織細胞凋亡率增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，而 Bcl-2 蛋白表達下調（均 P<0.05）；與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織細胞凋亡率、活化的 caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺組織細胞凋亡率減少，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達下調，而 Bcl-2 蛋白表達上調（均 P<0.05，圖 2b～e）。
圖2
miR-146a-3p 減輕 ALI 小鼠肺損傷
a. 各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）：假手術組小鼠肺泡形態規則，結構清晰完整；ALI 小鼠肺泡壁增厚，肺泡腔內可見大量炎性細胞；ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠較 ALI 小鼠肺組織病變學改變明顯減輕。b. TUNEL 檢測肺組織細胞凋亡情況（×200）：凋亡細胞染色為棕褐色，假手術組小鼠肺組織凋亡細胞寥寥無幾；ALI 小鼠肺組織可見大量棕褐色細胞；ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠較 ALI 小鼠肺組織凋亡細胞明顯減少。c. TUNEL 檢測細胞凋亡率統計圖。d、e. 蛋白印跡檢測活化的 caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白的表達水平。與假手術組比較，*
2.3 miR-146a-3p 減輕 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺部炎癥反應
與假手術組相比，ALI 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）；與 ALI 組相比，ALI+agomiR-NC 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量無明顯變化，ALI+agomiR-146a-3p 組小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量減少（均 P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
miR-146a-3p 減輕 ALI 小鼠肺部炎癥反應
a. ELISA 檢測肺組織中 TNF-α 表達水平；b. ELISA 檢測肺組織中 IL-6 表達水平；c. ELISA 檢測肺組織中 IL-1β 表達水平。與假手術組比較，*
2.4 miR-146a-3p 靶向下調 TLR4 表達
TargetScan 軟件預測結果表明，miR-146a-3p 與 TLR4 在 3’UTR 區存在結合位點（圖 4a）；雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-146a-3p mimic 與 PGL3-TLR4-WT 共轉染顯著降低了熒光素酶活性（P<0.05，圖 4b）。與對照組相比，LPS 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達上調（P<0.05）；與 LPS 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達下調，LPS+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達上調（均 P<0.05，圖 4c、d）；與 LPS+miR-146a-3p mimic 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達上調（P<0.05，圖 4c、d）。
圖4
miR-146a-3p 靶向下調 TLR4 表達
a. TargetScan 軟件預測 miR-146a-3p 與 TLR4 靶點；b. 雙熒光素酶報告實驗驗證 miR-146a-3p 與 TLR4 的靶向關系；c. 蛋白印跡檢測 MRC-5 細胞中 TLR4 蛋白表達水平；d. TLR4 蛋白相對表達量統計。與對照組比較，*
2.5 miR-146a-3p 靶向 TLR4 抑制 LPS 誘導的 MRC-5 細胞凋亡和炎癥反應
與對照組相比，LPS 組 MRC-5 細胞凋亡增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）；與 LPS 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic 組 MRC-5 細胞凋亡減少，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達下調，Bcl-2 蛋白表達上調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量減少，LPS+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞凋亡增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）；與 LPS+miR-146a-3p mimic 組相比，LPS+miR-146a-3p mimic+pc-TLR4 組 MRC-5 細胞凋亡增加，活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達上調，Bcl-2 蛋白表達下調，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量增加（均 P<0.05）。結果見圖 5。
圖5
miR-146a-3p 靶向 TLR4 抑制 LPS 誘導的 MRC-5 細胞凋亡和炎癥反應
a. 流式細胞術檢測 MRC-5 細胞凋亡結果；b. 細胞凋亡率統計；c. 蛋白印跡檢測 MRC-5 細胞中活化的 caspase-3、Bax 和 Bcl-2 蛋白表達水平；d. 蛋白相對表達量統計；e. ELISA 檢測 MRC-5 細胞 TNF-α 表達水平；f. ELISA 檢測 MRC-5 細胞 IL-6 表達水平；g. ELISA 檢測 MRC-5 細胞 IL-1β 表達水平。與對照組比較，*
3 討論
ALI 主要特征是過度的炎癥反應，引起彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致肺水腫、肺不張、毛細血管通透性增加以及肺部氣體交換障礙[12]。LPS 被認為是 ALI 發病機制中的重要刺激因素，可引起急性炎癥反應，并造成肺部病理學改變[13]。LPS 所致 ALI 動物模型表現出與臨床 ALI 患者相似特征，因此，本研究采用氣管滴入 LPS 的方法建立小鼠 ALI 模型[13]。本研究的 ALI 小鼠與臨床 ALI 患者肺部表現相一致，均出現肺泡結構受損、肺泡腔炎性細胞浸潤等現象，表明本研究的 ALI 動物模型是成功的。ALI 的發病機制和預后與機體的免疫反應密切相關。研究表明，miR 在體內豐富、敏感、高效，作為一類新的免疫調節因子參與先天免疫反應和炎癥反應的調控[14]。利用與炎癥相關的 miR 靶向治療來減少炎癥可能是治療 ALI 的一種新的有效手段。同研究 miR-146a 在嚴重燒傷所致 ALI 大鼠中表達明顯下調[15]相一致，本研究表明 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺組織中 miR-146a-3p 表達下調，而 miR-146a-3p 過表達明顯減輕 ALI 小鼠肺病理程度。
通常凋亡被認為是正常細胞的一種保護行為，然而 ALI 進展過程中過度的細胞凋亡會導致肺泡上皮細胞和血管內皮細胞的損傷，因此有效地抑制肺細胞的凋亡可減輕 ALI[16]。本研究結果表明，miR-146a-3p 高表達減少 ALI 小鼠肺組織細胞凋亡率，下調活化的 caspase-3 和 Bax 蛋白表達，上調 Bcl-2 蛋白表達。這同 miR-34b-5p 通過靶向前顆粒蛋白減輕了 LPS 誘導的 ALI 小鼠肺部細胞凋亡結果相似[17]。
LPS 通過激活 TLR 觸發炎癥反應，然后將中性粒細胞募集到炎癥部位[18]。炎癥反應和細胞因子蓄積在 ALI 的發病機制和發展中起著重要作用[18]。LPS 誘導肺中各種炎癥細胞的活化和浸潤以及一系列炎癥介質（TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等）的釋放，從而導致肺損傷[19]。有效抑制肺部炎癥反應可減輕 ALI，例如 miR-16 可通過調節 TLR4/NF-κB 通路抑制炎癥反應來預防小鼠 ALI[20]。本研究表明用 LPS 處理的 ALI 小鼠的肺中 TLR4 表達增加，并促進 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 等細胞因子的分泌。過表達 miR-146a-3p 可顯著下調 TLR4 的表達，減少 ALI 小鼠肺組織中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量。因此猜測 miR-146a-3p 可能通過靶向負調控 TLR4 的表達減輕 LPS 誘導的小鼠 ALI。本研究在常用的人肺 MRC-5 細胞系中證實 miR-146a-3p 靶向下調 TLR4 的表達，并通過一系列細胞實驗證實 TLR4 高表達逆轉 miR-146a-3p 對 MRC-5 細胞凋亡和炎癥反應的作用。因此，本研究表明 miR-146a-3p 通過靶向下調 TLR4 抑制 LPS 誘導的細胞凋亡和炎癥反應，從而緩解小鼠 ALI。
研究表明 TLR4 與髓樣分化因子 88（MYD88）相互作用并激活 IκB 激酶（IKK），最終導致 p65 的磷酸化，磷酸化的 p65 可引起促炎性細胞因子（如 IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的分泌，而這些促炎性細胞因子會誘導過度炎癥，從而導致組織損傷[21]。因此，TLR4 是否通過調節 MYD88/IKK/p65 通路參與 LPS 誘導的 ALI 是本實驗室下一步的研究計劃。
綜上，本研究通過體內體外實驗證明 miR-146a-3p 通過靶向下調 TLR4 減輕 LPS 誘導的小鼠 ALI，提示 miR-146a-3p 和 TLR4 可能是干預 ALI 發生和發展的潛在分子靶標，從而為 ALI 的治療提供了新的方向。但是具體分子通路還有待深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
