引用本文： 劉佳, 劉海文, 姚婷, 潘殿柱. 串聯質譜法觀察慢性阻塞性肺疾病患者外周血氨基酸水平變化特點. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(8): 542-548. doi: 10.7507/1671-6205.202011043 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）以持續的氣流受限和不完全可逆的氣道結構受損為特征，是世界上主要的健康負擔，影響 10%～15% 40 歲以上的成年人口[1-2]。目前慢阻肺的診斷是基于病史、癥狀以及肺功能相關的臨床參數，如第 1 秒用力呼氣容積/用力肺活量（FEV1/FVC），然而這些臨床參數與患者的整體健康狀況并不直接相關[3]。相比之下，代謝組學為系統生理學/病理生理學提供了一個潛在的窗口，并提供可能預測慢阻肺生物標志物的信息。為了彌補臨床肺功能參數對于預后評估潛力的限制，我們試圖尋找與慢阻肺健康狀況和疾病嚴重程度相關的血清代謝物，利用串聯質譜法探究不同嚴重程度慢阻肺患者之間的代謝組學差異，并綜合評估其在慢阻肺中的應用價值。
代謝組學是指系統地分析生物標本中低分子量物質，包括糖、氨基酸、有機酸、核苷酸和脂類[4]。目前，高通量代謝組學研究已涵蓋表型分化、診斷、鑒別診斷和治療干預，包括慢阻肺的肺康復治療[5-9]。樣本包括血液/血清/血漿、尿液、痰液、呼出氣凝液、支氣管肺泡灌洗液、肺組織等，其獨特的代謝物和紊亂的代謝途徑可能為闡明慢阻肺的發病機制提供依據[10]。目前，最常應用的代謝組學檢測技術主要有核磁共振技術（NMR）和質譜技術（MS）。質譜聯用色譜技術分為三種：液相色譜–質譜聯用技術（LC-MS）、氣相色譜–質譜聯用技術（GC-MS）以及毛細管電泳–質譜聯用技術（CE-MS）。LC-MS 為代謝組學最常用的分析方法。既往一些代謝組學研究發現慢阻肺患者和健康體檢者之間存在不同的代謝模式[6, 11-13]，而這類研究的結果尚未應用于臨床。對代謝組學數據的全面了解可能為慢阻肺的早期診斷、預后及營養支持治療提供新的思路。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集錦州醫科大學附屬第一醫院 2020 年 5 月至 2020 年 8 月期間收治的正常飲食狀態下的慢阻肺患者 99 例，其中 GOLD Ⅰ/Ⅱ組 30 例，GOLD Ⅲ組 44 例，GOLD Ⅳ組 25 例；并納入同期健康體檢者 30 例作為對照組 30 例。慢阻肺的納入標準：符合慢阻肺診斷標準[14]；年齡 40～80 歲；就診期間能配合完善肺功能檢查。排除標準：慢阻肺合并肺部感染或其他肺部疾病如哮喘、肺癌、支氣管擴張、肺結核等；合并嚴重的原發性疾病如肝腎疾病、血液系統疾病及惡性腫瘤等；妊娠期或哺乳期婦女；近期進行過大型手術的患者；近期存在節食的患者；近期注射或服用過影響氨基酸代謝的藥物或正在進行氨基酸補充治療的患者。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院醫學研究倫理委員會批準（批準號為 202032），納入者均簽署知情同意書。
1.2 方法
依據 GOLD 分級將慢阻肺病例組分為 GOLD Ⅰ/Ⅱ組（FEV1%pred≥50%）、GOLD Ⅲ組（30%≤FEV1%pred<50%）、GOLD Ⅳ組（FEV1%pred<30%）[14]。樣品的收集采用干血滴濾紙片法，空腹采血，從第 3 指遠節指骨尖端收集受試者指尖血，第 1 滴血被丟棄，其后的血滴分別滴在串聯質譜儀（AB SCIEX 4000）檢測專用濾紙片上，每個血斑的直徑大于 8 mm，樣本收集后及時送到我院遺傳代謝研究中心完成檢測。具體的儀器與制備方法請參照文獻[15]，測定了如下 19 種氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 軟件對數據進行統計學分析并標準化數據。呈正態分布的一般臨床計量資料以均數±標準差（
±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。非正態分布計量資料以中位數（四分位間距）［M（Q）］表示，進行非參數檢驗，多組間比較采用 K 個獨立樣本檢驗，兩組間比較采用獨立樣本檢驗。采用 SIMCA-P 14.1 軟件分析標準化數據，應用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）方法分別對不同 GOLD 分級的慢阻肺患者與對照組間進行氨基酸數據的分析，所得相應的散點圖及排列分析圖。在模型的積分圖中顯示一個橢圓形區域，定義模型變量的 95% 置信區間。該模型的質量由 R2X 或者 R2Y 和 Q2 來描述。R2X 或者 R2Y 表示模型的擬合程度。Q2 表示模型的預測性。一般認為 R2、Q2 越接近于 1，其模型的擬合程度越好。同時為了保證數據不被過度擬合，在 SIMCA-P 中進行 200次的置換檢驗（permutation test)對OPLS-DA模型的有效性 進行驗證，并得出相應的排列分析圖。一般認為變量投影的重要性（VIP）>1.0 的代謝物為與試驗條件有關的代謝物。
2 結果
2.1 一般臨床資料
各組受試者的年齡、性別差異沒有統計學意義（均 P>0.05）。慢阻肺患者的吸煙指數較對照組高。結果見表 1。
表1
研究人群的一般臨床特征［（
）/例（%）］
2.2 血漿樣本氨基酸含量分析
不同 GOLD 分級的慢阻肺患者的亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸均低于對照組，GOLD Ⅰ/Ⅱ組及 GOLD Ⅲ的甲硫氨酸低于對照組，GOLD Ⅲ組苯丙氨酸高于對照組，GOLD Ⅳ組谷氨酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸高于對照組，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 2。
表2
篩選不同 GOLD 分級間具有差異性的代謝指標［M（Q），μmol/L］
2.3 各組慢阻肺患者血漿代謝物圖譜模式識別分析
散點圖中每一個點代表一個樣本，本試驗中可見不同組別間的樣本均能明顯區分開（圖 1a、2a、3a、4a），數據組間差異大，數據質量比較好。其中，GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組在橫軸（t 軸）上有明顯的分離趨勢（R2X=0.284，R2Y=0.823，Q2=0.736），兩組間存在顯著差異（圖 1a）。GOLD Ⅲ組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.408，R2Y=0.79，Q2=0.736），兩組間存在顯著差異（圖 2a）。GOLD Ⅳ組與對照組在橫軸上有明顯分離趨勢（R2X=0.229，R2Y =0.805，Q2=0.706），兩組間存在顯著差異（圖 3a）。慢阻肺組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.387，R2Y=0.743，Q2=0.704），兩組間存在顯著差異（圖 4a）。驗證模型中可見累計的 R2、Q2 值（左下部）均明顯低于原始的 R2、Q2 值（右上部），數據穩健（圖 1b、2b、3b、4b）。
圖1
GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見 GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組在橫軸（t 軸）上有明顯的分離趨勢，R2X=0.284，R2Y=0.823，Q2=0.736；b. 排列分析圖中最右邊是真實的值，左邊是模擬的值，橫坐標表示與原模型的相似程度，縱坐標表示 R2 及 Q2 的值，累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
圖2
GOLD Ⅲ組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見 GOLD Ⅲ組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢，R2X=0.408，R2Y=0.79，Q2=0.736；b.排列分析中可見累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
圖3
GOLD Ⅳ組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見 GOLD Ⅳ組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.229，R2Y =0.805，Q2=0.706）；b. 排列分析中可見累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
圖4
慢阻肺組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見慢阻肺組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.387，R2Y=0.743，Q2=0.704）；b.排列分析中可見累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
2.4 篩選組間差異代謝物
通過 SIMCA-P 軟件篩選出不同組別間的差異性代謝物質，GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組相比滿足 VIP>1 的指標有精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸。GOLD Ⅲ組與對照組相比滿足 VIP>1 的指標有亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸。GOLD Ⅳ組與對照組相比滿足 VIP>1 的指標有精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。結果見表 3。
表3
不同 GOLD 分級與試驗條件有關的代謝物的 VIP 值
3 討論
不同分級的慢阻肺患者均存在氨基酸代謝紊亂，并且隨著肺功能的加重，代謝紊亂越明顯。本研究發現有 11 種氨基酸與慢阻肺的發病相關，其中支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸）在不同分級的慢阻肺中差異均有統計學意義（P<0.05 且 VIP>1），可以作為早期識別慢阻肺的潛在標志物，而谷氨酸及谷氨酰胺僅于 GOLD Ⅳ期差異性明顯（P<0.05 且 VIP>1），表明其增高可能預示著病情預后不良。
從營養學的角度來說，人體氨基酸分為必須從食物中獲取的必須氨基酸（賴氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸）以及自身可以合成的非必須氨基酸（谷氨酸、甘氨酸等）。本研究發現慢阻肺患者較正常對照組而言，亮氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等必需氨基酸水平明顯降低（均 P<0.05），說明慢阻肺患者氨基酸攝入不足或供需平衡失調。這為慢阻肺患者加強營養支持治療進而促進骨骼肌功能恢復提供了方向。
支鏈氨基酸（BCAAs）是一種包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在內的必需的氨基酸，在肌肉蛋白質中占必需氨基酸總量的 35%。同時，BCAAs 可以作為能量底物、糖異生底物對肌肉蛋白質代謝具有調節作用[16]。BCAAs 中最重要的是亮氨酸，它可以通過促進肌肉蛋白質多肽鏈的合成來促進蛋白質的生成，還可作為底物合成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又能促進肌肉增長，有助于蛋白質的合成[17]。因此 BCAAs 是參與肌肉蛋白質生成的重要底物。本研究發現慢阻肺患者的亮氨酸、纈氨酸水平降低（P<0.05），說明慢阻肺患者存在肌肉蛋白質營養不良。也有學者認為慢阻肺患者 BCAAs 濃度降低主要是由于病情加重和呼吸肌無力引起的高代謝所致[18]，補充 BCAAs 可以促進慢阻肺老年患者的蛋白質合成[19]。
血清中的谷氨酰胺和精氨酸等幾種氨基酸可作為蛋白質降解的標志物，它們被鑒定出來并用于慢阻肺的定量代謝組學診斷[9, 11]。人體中 90% 的谷氨酰胺是由骨骼肌產生的，BCAAs 和谷氨酰胺之間的代謝平衡是調節去脂體重、肌肉蛋白質代謝的核心。然而在應激條件下肺也可以釋放谷氨酰胺，這表明肺組織對谷氨酰胺的利用增加[20]。在本研究中，慢阻肺患者的谷氨酰胺增高，尤其是在 GOLD Ⅳ級中明顯，說明谷氨酰胺含量增加可能預示著病情的惡化或加重，這與 Ubhi 等[13]的研究結果一致。因此，慢阻肺患者的谷氨酰胺水平升高，可能與骨骼肌蛋白代謝異常及氧化應激有關。慢阻肺患者的精氨酸含量也增加，表明慢阻肺患者肌肉蛋白質代謝增強。精氨酸在慢阻肺中的代謝機制尚不明確，但精氨酸與賴氨酸均為堿性氨基酸，不同堿性氨基酸間存在轉運載體競爭機制（堿性氨基酸轉運載體），以精氨酸與賴氨酸之間的拮抗作用最為顯著[21]，這也可能是導致慢阻肺患者纈氨酸降低及精氨酸升高的原因之一。我們推測精氨酸和谷氨酰胺的變化可能作為早期發現慢阻肺患者病情變化的一個預測指標。
酪氨酸、苯丙氨酸為芳香族氨基酸，只能由肌肉蛋白分解生成而不能被骨骼肌吸取，其含量可用于反映肌肉蛋白質的降解情況或分解程度[22]。慢阻肺患者本身存在營養不良，特別是在進食狀態較差的情況下骨骼肌的苯丙氨酸凈釋放增多，這與禁食狀態下雷帕霉素靶蛋白的激活降低有關[23]，這可能是導致慢阻肺患者苯丙氨酸增高的原因之一。在 GOLD Ⅲ/Ⅳ級慢阻肺患者中可見明顯的苯丙氨酸及酪氨酸增高，這說明病情重的慢阻肺患者肌肉蛋白分解代謝增強，也可能是導致重度慢阻肺患者呼吸肌無力并且呼吸困難加重的原因之一。在不同 GOLD 分級間苯丙氨酸和酪氨酸的含量有逐漸升高趨勢，尤其是在 GOLD Ⅳ級中升高明顯（P<0.05 且 VIP>1），提示其水平可能與慢阻肺的嚴重程度相關，這與 Ubhi 等 [11]及 Kuo 等[24]的研究結果相符。Kuo 等[24]研究發現組氨酸的含量也隨著病情的嚴重逐漸升高，本研究中組氨酸含量升高不明顯，可能與本實驗樣本含量較小有關。也有研究發現苯丙氨酸增高與全身炎癥明顯相關[25]，這也可能是引起慢阻肺患者苯丙氨酸增高的原因之一。
綜上所述，慢阻肺患者存在明顯的氨基酸代謝紊亂，包括攝入不足以及肌肉蛋白質的分解代謝增強，同時氨基酸的代謝紊亂也導致病情惡化，從而影響患者的生活質量及預后。對于慢阻肺的氨基酸代謝機制還需要進一步研究，許多混雜因素也可能會干擾對代謝的解釋，包括年齡、營養狀況、肌肉質量等。氨基酸代謝紊亂的規律還需進一步探索，這些不同代謝物還需要在大群體的研究中進行驗證。此外，這些鑒別代謝物也有望成為探索慢阻肺發病機制的標志物。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）以持續的氣流受限和不完全可逆的氣道結構受損為特征，是世界上主要的健康負擔，影響 10%～15% 40 歲以上的成年人口[1-2]。目前慢阻肺的診斷是基于病史、癥狀以及肺功能相關的臨床參數，如第 1 秒用力呼氣容積/用力肺活量（FEV1/FVC），然而這些臨床參數與患者的整體健康狀況并不直接相關[3]。相比之下，代謝組學為系統生理學/病理生理學提供了一個潛在的窗口，并提供可能預測慢阻肺生物標志物的信息。為了彌補臨床肺功能參數對于預后評估潛力的限制，我們試圖尋找與慢阻肺健康狀況和疾病嚴重程度相關的血清代謝物，利用串聯質譜法探究不同嚴重程度慢阻肺患者之間的代謝組學差異，并綜合評估其在慢阻肺中的應用價值。
代謝組學是指系統地分析生物標本中低分子量物質，包括糖、氨基酸、有機酸、核苷酸和脂類[4]。目前，高通量代謝組學研究已涵蓋表型分化、診斷、鑒別診斷和治療干預，包括慢阻肺的肺康復治療[5-9]。樣本包括血液/血清/血漿、尿液、痰液、呼出氣凝液、支氣管肺泡灌洗液、肺組織等，其獨特的代謝物和紊亂的代謝途徑可能為闡明慢阻肺的發病機制提供依據[10]。目前，最常應用的代謝組學檢測技術主要有核磁共振技術（NMR）和質譜技術（MS）。質譜聯用色譜技術分為三種：液相色譜–質譜聯用技術（LC-MS）、氣相色譜–質譜聯用技術（GC-MS）以及毛細管電泳–質譜聯用技術（CE-MS）。LC-MS 為代謝組學最常用的分析方法。既往一些代謝組學研究發現慢阻肺患者和健康體檢者之間存在不同的代謝模式[6, 11-13]，而這類研究的結果尚未應用于臨床。對代謝組學數據的全面了解可能為慢阻肺的早期診斷、預后及營養支持治療提供新的思路。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集錦州醫科大學附屬第一醫院 2020 年 5 月至 2020 年 8 月期間收治的正常飲食狀態下的慢阻肺患者 99 例，其中 GOLD Ⅰ/Ⅱ組 30 例，GOLD Ⅲ組 44 例，GOLD Ⅳ組 25 例；并納入同期健康體檢者 30 例作為對照組 30 例。慢阻肺的納入標準：符合慢阻肺診斷標準[14]；年齡 40～80 歲；就診期間能配合完善肺功能檢查。排除標準：慢阻肺合并肺部感染或其他肺部疾病如哮喘、肺癌、支氣管擴張、肺結核等；合并嚴重的原發性疾病如肝腎疾病、血液系統疾病及惡性腫瘤等；妊娠期或哺乳期婦女；近期進行過大型手術的患者；近期存在節食的患者；近期注射或服用過影響氨基酸代謝的藥物或正在進行氨基酸補充治療的患者。本研究經錦州醫科大學附屬第一醫院醫學研究倫理委員會批準（批準號為 202032），納入者均簽署知情同意書。
1.2 方法
依據 GOLD 分級將慢阻肺病例組分為 GOLD Ⅰ/Ⅱ組（FEV1%pred≥50%）、GOLD Ⅲ組（30%≤FEV1%pred<50%）、GOLD Ⅳ組（FEV1%pred<30%）[14]。樣品的收集采用干血滴濾紙片法，空腹采血，從第 3 指遠節指骨尖端收集受試者指尖血，第 1 滴血被丟棄，其后的血滴分別滴在串聯質譜儀（AB SCIEX 4000）檢測專用濾紙片上，每個血斑的直徑大于 8 mm，樣本收集后及時送到我院遺傳代謝研究中心完成檢測。具體的儀器與制備方法請參照文獻[15]，測定了如下 19 種氨基酸：丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 25.0 軟件對數據進行統計學分析并標準化數據。呈正態分布的一般臨床計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。非正態分布計量資料以中位數（四分位間距）［M（Q）］表示，進行非參數檢驗，多組間比較采用 K 個獨立樣本檢驗，兩組間比較采用獨立樣本檢驗。采用 SIMCA-P 14.1 軟件分析標準化數據，應用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）方法分別對不同 GOLD 分級的慢阻肺患者與對照組間進行氨基酸數據的分析，所得相應的散點圖及排列分析圖。在模型的積分圖中顯示一個橢圓形區域，定義模型變量的 95% 置信區間。該模型的質量由 R2X 或者 R2Y 和 Q2 來描述。R2X 或者 R2Y 表示模型的擬合程度。Q2 表示模型的預測性。一般認為 R2、Q2 越接近于 1，其模型的擬合程度越好。同時為了保證數據不被過度擬合，在 SIMCA-P 中進行 200次的置換檢驗（permutation test)對OPLS-DA模型的有效性 進行驗證，并得出相應的排列分析圖。一般認為變量投影的重要性（VIP）>1.0 的代謝物為與試驗條件有關的代謝物。
2 結果
2.1 一般臨床資料
各組受試者的年齡、性別差異沒有統計學意義（均 P>0.05）。慢阻肺患者的吸煙指數較對照組高。結果見表 1。
表1
研究人群的一般臨床特征［（）/例（%）］
2.2 血漿樣本氨基酸含量分析
不同 GOLD 分級的慢阻肺患者的亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸均低于對照組，GOLD Ⅰ/Ⅱ組及 GOLD Ⅲ的甲硫氨酸低于對照組，GOLD Ⅲ組苯丙氨酸高于對照組，GOLD Ⅳ組谷氨酰胺、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸高于對照組，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 2。
表2
篩選不同 GOLD 分級間具有差異性的代謝指標［M（Q），μmol/L］
2.3 各組慢阻肺患者血漿代謝物圖譜模式識別分析
散點圖中每一個點代表一個樣本，本試驗中可見不同組別間的樣本均能明顯區分開（圖 1a、2a、3a、4a），數據組間差異大，數據質量比較好。其中，GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組在橫軸（t 軸）上有明顯的分離趨勢（R2X=0.284，R2Y=0.823，Q2=0.736），兩組間存在顯著差異（圖 1a）。GOLD Ⅲ組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.408，R2Y=0.79，Q2=0.736），兩組間存在顯著差異（圖 2a）。GOLD Ⅳ組與對照組在橫軸上有明顯分離趨勢（R2X=0.229，R2Y =0.805，Q2=0.706），兩組間存在顯著差異（圖 3a）。慢阻肺組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.387，R2Y=0.743，Q2=0.704），兩組間存在顯著差異（圖 4a）。驗證模型中可見累計的 R2、Q2 值（左下部）均明顯低于原始的 R2、Q2 值（右上部），數據穩健（圖 1b、2b、3b、4b）。
圖1
GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見 GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組在橫軸（t 軸）上有明顯的分離趨勢，R2X=0.284，R2Y=0.823，Q2=0.736；b. 排列分析圖中最右邊是真實的值，左邊是模擬的值，橫坐標表示與原模型的相似程度，縱坐標表示 R2 及 Q2 的值，累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
圖2
GOLD Ⅲ組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見 GOLD Ⅲ組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢，R2X=0.408，R2Y=0.79，Q2=0.736；b.排列分析中可見累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
圖3
GOLD Ⅳ組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見 GOLD Ⅳ組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.229，R2Y =0.805，Q2=0.706）；b. 排列分析中可見累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
圖4
慢阻肺組與對照組血漿氨基酸的 OPLS-DA 分型圖
a. 散點圖中可見慢阻肺組與對照組在橫軸上有明顯的分離趨勢（R2X=0.387，R2Y=0.743，Q2=0.704）；b.排列分析中可見累計的 R2、Q2（左下部）值均明顯低于原始的 R2、Q2（右上部）值。
2.4 篩選組間差異代謝物
通過 SIMCA-P 軟件篩選出不同組別間的差異性代謝物質，GOLD Ⅰ/Ⅱ組與對照組相比滿足 VIP>1 的指標有精氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸。GOLD Ⅲ組與對照組相比滿足 VIP>1 的指標有亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸。GOLD Ⅳ組與對照組相比滿足 VIP>1 的指標有精氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。結果見表 3。
表3
不同 GOLD 分級與試驗條件有關的代謝物的 VIP 值
3 討論
不同分級的慢阻肺患者均存在氨基酸代謝紊亂，并且隨著肺功能的加重，代謝紊亂越明顯。本研究發現有 11 種氨基酸與慢阻肺的發病相關，其中支鏈氨基酸（亮氨酸、纈氨酸）在不同分級的慢阻肺中差異均有統計學意義（P<0.05 且 VIP>1），可以作為早期識別慢阻肺的潛在標志物，而谷氨酸及谷氨酰胺僅于 GOLD Ⅳ期差異性明顯（P<0.05 且 VIP>1），表明其增高可能預示著病情預后不良。
從營養學的角度來說，人體氨基酸分為必須從食物中獲取的必須氨基酸（賴氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸）以及自身可以合成的非必須氨基酸（谷氨酸、甘氨酸等）。本研究發現慢阻肺患者較正常對照組而言，亮氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、纈氨酸等必需氨基酸水平明顯降低（均 P<0.05），說明慢阻肺患者氨基酸攝入不足或供需平衡失調。這為慢阻肺患者加強營養支持治療進而促進骨骼肌功能恢復提供了方向。
支鏈氨基酸（BCAAs）是一種包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在內的必需的氨基酸，在肌肉蛋白質中占必需氨基酸總量的 35%。同時，BCAAs 可以作為能量底物、糖異生底物對肌肉蛋白質代謝具有調節作用[16]。BCAAs 中最重要的是亮氨酸，它可以通過促進肌肉蛋白質多肽鏈的合成來促進蛋白質的生成，還可作為底物合成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又能促進肌肉增長，有助于蛋白質的合成[17]。因此 BCAAs 是參與肌肉蛋白質生成的重要底物。本研究發現慢阻肺患者的亮氨酸、纈氨酸水平降低（P<0.05），說明慢阻肺患者存在肌肉蛋白質營養不良。也有學者認為慢阻肺患者 BCAAs 濃度降低主要是由于病情加重和呼吸肌無力引起的高代謝所致[18]，補充 BCAAs 可以促進慢阻肺老年患者的蛋白質合成[19]。
血清中的谷氨酰胺和精氨酸等幾種氨基酸可作為蛋白質降解的標志物，它們被鑒定出來并用于慢阻肺的定量代謝組學診斷[9, 11]。人體中 90% 的谷氨酰胺是由骨骼肌產生的，BCAAs 和谷氨酰胺之間的代謝平衡是調節去脂體重、肌肉蛋白質代謝的核心。然而在應激條件下肺也可以釋放谷氨酰胺，這表明肺組織對谷氨酰胺的利用增加[20]。在本研究中，慢阻肺患者的谷氨酰胺增高，尤其是在 GOLD Ⅳ級中明顯，說明谷氨酰胺含量增加可能預示著病情的惡化或加重，這與 Ubhi 等[13]的研究結果一致。因此，慢阻肺患者的谷氨酰胺水平升高，可能與骨骼肌蛋白代謝異常及氧化應激有關。慢阻肺患者的精氨酸含量也增加，表明慢阻肺患者肌肉蛋白質代謝增強。精氨酸在慢阻肺中的代謝機制尚不明確，但精氨酸與賴氨酸均為堿性氨基酸，不同堿性氨基酸間存在轉運載體競爭機制（堿性氨基酸轉運載體），以精氨酸與賴氨酸之間的拮抗作用最為顯著[21]，這也可能是導致慢阻肺患者纈氨酸降低及精氨酸升高的原因之一。我們推測精氨酸和谷氨酰胺的變化可能作為早期發現慢阻肺患者病情變化的一個預測指標。
酪氨酸、苯丙氨酸為芳香族氨基酸，只能由肌肉蛋白分解生成而不能被骨骼肌吸取，其含量可用于反映肌肉蛋白質的降解情況或分解程度[22]。慢阻肺患者本身存在營養不良，特別是在進食狀態較差的情況下骨骼肌的苯丙氨酸凈釋放增多，這與禁食狀態下雷帕霉素靶蛋白的激活降低有關[23]，這可能是導致慢阻肺患者苯丙氨酸增高的原因之一。在 GOLD Ⅲ/Ⅳ級慢阻肺患者中可見明顯的苯丙氨酸及酪氨酸增高，這說明病情重的慢阻肺患者肌肉蛋白分解代謝增強，也可能是導致重度慢阻肺患者呼吸肌無力并且呼吸困難加重的原因之一。在不同 GOLD 分級間苯丙氨酸和酪氨酸的含量有逐漸升高趨勢，尤其是在 GOLD Ⅳ級中升高明顯（P<0.05 且 VIP>1），提示其水平可能與慢阻肺的嚴重程度相關，這與 Ubhi 等 [11]及 Kuo 等[24]的研究結果相符。Kuo 等[24]研究發現組氨酸的含量也隨著病情的嚴重逐漸升高，本研究中組氨酸含量升高不明顯，可能與本實驗樣本含量較小有關。也有研究發現苯丙氨酸增高與全身炎癥明顯相關[25]，這也可能是引起慢阻肺患者苯丙氨酸增高的原因之一。
綜上所述，慢阻肺患者存在明顯的氨基酸代謝紊亂，包括攝入不足以及肌肉蛋白質的分解代謝增強，同時氨基酸的代謝紊亂也導致病情惡化，從而影響患者的生活質量及預后。對于慢阻肺的氨基酸代謝機制還需要進一步研究，許多混雜因素也可能會干擾對代謝的解釋，包括年齡、營養狀況、肌肉質量等。氨基酸代謝紊亂的規律還需進一步探索，這些不同代謝物還需要在大群體的研究中進行驗證。此外，這些鑒別代謝物也有望成為探索慢阻肺發病機制的標志物。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
