引用本文： 陳沛銳, 呂靜, 曾春芳, 何小艷, 刁明強. 敲低雌激素受體 α 基因抑制 A549 細胞的增殖、遷移及裸鼠移植瘤的形成. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(9): 649-655. doi: 10.7507/1671-6205.202006060 復制
非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的 80%，包括腺癌、鱗癌、低分化癌和大細胞肺癌，是全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。在過去的 20 年里，女性 NSCLC 的發病率明顯上升，這可能與女性吸煙率增加有關[2]。但是，大約 20% 的女性肺癌患者從未吸煙，這表明性別依賴性因素可能參與 NSCLC 的發生和發展[3-4]，因而引發國內外學者對雌激素是否與肺癌的生物學特性及發病機制相關的研究。雌激素主要通過雌激素受體（ER）發揮作用。雌激素受體包括雌激素受體 α（ERα）和雌激素受體 β（ERβ），二者同屬于甾體激素核受體家族，存在于細胞核和胞漿中。ERα 是第一個被發現和克隆的 ER[5]，編碼 ERα 的基因 ESR1 位于6號染色體上[6]。近年研究發現，除了乳腺癌、子宮內膜癌等經典激素依賴性腫瘤外[7-8]，ER 也廣泛存在于肺腫瘤及正常肺組織中[9]。顏浩等[10]通過臨床樣本分析研究表明正常肺組織和肺良性腫瘤組織中無 ERα 和 ERβ 表達，NSCLC 中 ERα、ERβ 陽性表達率分別為 20.4%（11/54）、45.1%（26/54），表明 ER 在 NSCLC 的發生過程中起作用。研究已表明 ERβ 失活或下調可能具有治療肺癌的潛在作用[11]，但 ERα 對肺癌的相關研究尚未報道過。研究表明 ERα 在肺腺癌中高表達[12]，因此本研究以 A549 肺腺癌細胞系為研究對象，探究敲低 ERα 的表達對 NSCLC 細胞生存、轉移及裸鼠腫瘤生長的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
RPMI1640 和胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco；轉染試劑、TRIzol 試劑、反轉錄試劑盒購自美國 Thermo Fisher 公司；RIPA 裂解緩沖液、BCA 定量試劑盒購自上海碧云天公司；基質膠購自美國 BD Biosciences 公司；Ki-67、ERα、上皮型鈣黏蛋白（E-cad）和神經型鈣黏蛋白（N-cad）一抗購自美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶偶聯的二抗購自美國 Santa Cruz Biotechnology；4% 多聚甲醛、結晶紫購自美國 Sigma 公司。紫外分光光度計（美國 Thermo Fisher 公司），倒置顯微鏡（日本 Olympus 公司），FACScan 流式細胞儀（美國 Beckman coulter 公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
A549 細胞系購自美國典型培養物保藏中心（美國 ATCC），將細胞在含有 10% FBS、100 U/mL青霉素和 100 g/mL 鏈霉素的 RPMI1640 中于 37 °C、含 5% CO2 濕潤條件下培養。
1.2.2 細胞轉染
ERα-shRNA 及陰性對照序列由上海英駿生物技術有限公司設計合成，將 A549 細胞傳代培養于 6 孔板中，培養 24 h 后根據轉染試劑盒說明書用 Lipofectamine3000分別轉染陰性對照 shRNA-NC 和干擾序列 ERα-shRNA1 和 ERα-shRNA2，用新鮮培養基替換培養 48 h，然后按照指示處理細胞。干擾序列 ERα-shRNA1、ERα-shRNA2 及陰性對照序列 shRNA-NC 如下：ER-shRNA1：CACCGGGAAGTATGGCTATGGAATCTTCAAGAGAGATTCCATAGCCATACTTCCCTTTTTTG；ER-shRNA2：CACCGGATTTGACCCTCCATGATCATTCAAGAGATGATCATGGAGGGTCAAATCCTTTTTTG；shRNA-NC：CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG。
1.2.3 逆轉錄–聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測基因 mRNA 表達
用 Trizol 試劑從各組轉染細胞提取總 RNA，用紫外分光光度計測定 RNA 的純度和濃度。根據反轉錄試劑盒說明書操作，取等質量的總 RNA 作為模板反轉錄成 cDNA。以 cDNA 為模板，PCR 循環為：預變性 95 ℃ 3 min；變性 95 ℃ 15 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，35 個循環；終延伸 72 ℃ 5 min。
1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達
用 RIPA 裂解緩沖液提取各組轉染 A549 細胞總蛋白。BCA 測定蛋白濃度并調平，取 20 μg 蛋白在 8% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并將其轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在含 5% 脫脂牛奶的 TBST 中封閉 2 h 后，用一抗 4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃ 孵育 1 h；洗膜后 ECL 曝光成像并用 quantity one 軟件分析蛋白條帶的灰度值。
1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖
shRNA-NC 和 ERα-shRNA1 分別轉染 A549 細胞，以 1000 個/孔的細胞數在 6 孔板中培養 2 周。用 4% 多聚甲醛固定細胞 10 min，用 1% 結晶紫染色 5 min。可見克隆用倒置顯微鏡成像和手工計數，最后計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%[13]。
1.2.6 流式細胞檢測細胞凋亡
將 1.2.5 轉染各組 A549 細胞培養 48 h 后用胰蛋白酶消化，并用冷 PBS 洗滌 2 次。將細胞以 3000 r/min 的速度離心 5 min，然后棄去上清液，并將沉淀以 1.0×106 個/mL 的細胞密度重懸于 1×binding buffer 中。各取 100 μL 的樣品溶液與 5 μL FITC 偶聯的膜聯蛋白（annexin）V（Pharmingen）和 5 μL 碘化丙啶（PI。Pharmingen）在室溫下于黑暗中孵育15 min，向每個樣品管中加入400 μL 1× binding buffer，使用 FACScan 流式細胞儀進行流式分析，annexin V（+）/PI（+/–）細胞占總細胞比率為細胞凋亡率。
1.2.7 Transwell 侵襲實驗
將 Transwell 小室（孔徑為 8 μm，#3422，美國康寧公司）涂上 20 μg 基質膠，取對數生長期的對照組、shRNA-NC 組、ERα-shRNA1 組細胞，以 4.0×104 細胞數播種于上室，放入培養箱。上室采用無血清培養基，下室加入含 10% FBS 的培養基。培養 24 h 后，將膜的下側固定并用 0.1% 結晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞。在顯微鏡下隨機選擇 3 個區域對入侵的細胞進行計數，每個侵襲測定重復至少 6 次[14-15]。
1.2.8 建立裸鼠皮下移植瘤實驗
16 只無特定病原體動物級 BALB/c 小鼠，5～6 周齡，體重 18～22 g，由成都中醫藥大學提供［SCXK（川）2019-11］，飼養于成都中醫藥大學（臨床醫學院）實驗動物中心［SYXK（川）2017-179］，動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。將小鼠飼養于無菌環境中，房間溫度控制在 23～25 ℃，濕度維持在 50%～60%，光照時間 12 h，自由進食高壓滅菌水和無菌飼料，適應性喂養 7 d 后進行實驗。將小鼠隨機分為兩組（n=8），將轉染 ERα-shRNA1 序列的 A549 細胞以 2×106 細胞數皮下注射到裸鼠的側面皮下，記為 ERα-shRNA1 組；對照組皮下注射等細胞數不做轉染處理的 A549 細胞。飼養 30 d，從第 6 d 開始每 3 d 監測 1 次腫瘤體積（V），V=0.5×長度×寬度2[16]。30 d 后，通過頸脫位法處死小鼠，并通過手術切除腫瘤，拍照、稱重并進行石蠟包埋切片，留待后續實驗。
1.2.9 免疫組織化學實驗
將步驟 1.2.8 保存的腫瘤組織石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復，滴加一抗至切片 4 ℃ 孵育過夜，二抗 37 ℃ 1 h，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶蛋白親和素，37 ℃ 作用 40 min，洗滌后避光顯色并用蘇木素復染細胞核。封片后使用光學顯微鏡觀察 Ki-67 和 N-cad 陽性細胞。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件。呈正態分布的計量數據用均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Student t 檢驗用于評估兩組之間的差異。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 利用 shRNA 成功干擾 A549 細胞 ERα 的表達
如圖 1所示，與對照組相比，shRNA NC 組中 ERα 表達量沒有顯著變化；ERα-shRNA1 組和 ERα-shRNA2 組中 ERα 的 mRNA 表達水平分別為 0.11±0.06 和 0.72±0.08，蛋白表達水平分別為 0.02±0.01 和 0.13±0.05，表明 ERα 的表達顯著下調（P <0.05），且轉染 ERα-shRNA1 的干擾效率比 ERα-shRNA2 更高，采用 ERα-shRNA1 進行后續實驗。
圖1
RT-PCR 和 Western blot 驗證 shRNA 的敲低效率（n=6，
）
a．RT-PCR 檢測 ERα 的 mRNA 轉錄水平；b．Western blot 檢測 ERα 的蛋白表達：shRNA 干擾效率越高，ERα 的蛋白相對表達量越低。與對照組比較，*
2.2 敲低 ERα 抑制 A549 細胞的生長
如圖 2a所示，與對照組相比，ERα-shRNA1 組 A549 細胞克隆形成率明顯降低（P<0.05），且 A549 細胞中 Ki-67 和 PCNA 的表達量顯著下調（P<0.05，圖 2c），表明敲低 ERα 抑制了 A549 細胞的增殖；如圖 2b所示，與對照組相比，ERα-shRNA1 組細胞凋亡比率顯著增加（P<0.05），提示敲低 ERα 促進細胞凋亡。
圖2
敲低 ERα 對 A549 細胞生長的影響（n=6，
）
a．克隆形成實驗檢測細胞增殖，shRNA-NC 組與對照組比較，差異無統計學意義，ERα-shRNA1 組克隆形成率顯著低于對照組；b．流式細胞檢測細胞凋亡，與對照組相比，ERα-shRNA1 組細胞凋亡比率顯著增加；c．RT-PCR 檢測 Ki-67 和 PCNA 的表達量，與對照組相比，ERα-shRNA1 組 A549 細胞中 Ki-67 和 PCNA 的表達量顯著下調。與對照組比較，*
2.3 敲低 ERα 抑制 A549 細胞的運動能力
與對照組相比，敲低 ERα 可以顯著降低 A549 細胞的體外侵襲（31±11 比 82±14，P<0.05，圖 3a），并顯著上調上皮細胞標志物 E-cad 的表達（P<0.05），下調間充質標志物 N-cad 的表達（P<0.05，圖 3b），提示敲低 ERα 抑制了 A549 細胞的侵襲能力。
圖3
敲低 ERα 對 A549 細胞運動能力的影響（n=6，
）
a． Transwell 實驗檢測 A549 細胞侵襲能力：shRNA-NC 組與對照組無顯著性差異，ERα-shRNA1 組侵襲細胞數目顯著少于對照組；b． Western blot 檢測侵襲相關蛋白 E-cad 和 N-cad 蛋白表達。與對照組比較，*
2.4 敲低 ERα 能夠抑制體內移植瘤的生長
如圖 4所示，在 30 d 時，對照組腫瘤重量為（0.41±0.08）g，ERα-shRNA1 組腫瘤重量為（0.14±0.06）g，相比之下 ERα-shRNA1 組腫瘤重量顯著降低（P<0.05）；ERα-shRNA1 組腫瘤體積（約 800 mm3）與對照組（約 1800 mm3）相比顯著減小（P <0.05），因此敲低 ERα 阻止了移植瘤的發展進程。
圖4
裸鼠成瘤實驗（n=6，
）
a．對照組和轉染 ERα-shRNA1 的 A549 細胞皮下注射裸鼠后形成的腫瘤團塊；b．腫瘤重量統計圖：ERα-shRNA1 組腫瘤重量顯著低于對照組；c．30 d 內每隔 3 d 測量的腫瘤體積曲線圖：ERα-shRNA1 組腫瘤體積顯著小于對照組。與對照組比較，*
2.5 敲低 ERα 抑制移植瘤組織中 Ki-67 和 N-cad 的表達
如圖 5所示，與對照組相比，ERα-shRNA1 組 Ki-67 陽性細胞與 N-cad 陽性細胞數目均顯著減少（P<0.05）。
圖5
免疫組織化學檢測 Ki-67 和 N-cad 陽性細胞（×400，n=6，
）
a．Ki-67 陽性細胞呈棕色；b．N-cad 陽性細胞呈棕色。與對照組相比較，*
3 討論
ERα 在細胞中廣泛表達，在激素依賴性和非激素依賴性癌癥中都起著關鍵作用。在激素相關的癌癥（例如乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌）中，ERα 表達主要通過調節 PI3K/AKT 信號通路來促進疾病進展[17-18]。最近研究表明雌激素與 NSCLC 細胞系 H23 共同培養，癌細胞的增殖明顯受到促進，使用抗雌激素藥物后，癌細胞的增殖明顯受到阻礙[19]。本研究結果表明敲低 ERα 后，細胞克隆形成率明顯降低，凋亡比率顯著增加，并且細胞增殖相關蛋白 Ki-67、PCNA 的表達量顯著下調。PNCA 是一種促進 DNA 延伸的核蛋白，Ki-67 是一種增殖細胞核抗原，其表達與細胞分裂有密切關系，因此 Ki-67 是細胞增殖的理想標志物[20]。因此，敲低 ERα 可抑制 A549 細胞的增殖，促進凋亡，從而發揮抑癌作用。
研究表明 ERα 在腫瘤細胞的轉移及侵襲過程中發揮著重要作用。Zhang 等[21]研究發現降低乳腺癌細胞中 ER-α36 的表達可抑制細胞的增殖、轉移及侵襲能力。Zhang 等[22]應用免疫組織化學檢測發現，ERα 的表達水平與肺腺癌的淋巴結轉移呈正相關性。上皮–間質轉化（EMT）是促進腫瘤侵襲，轉移的主要機制之一，當上皮細胞標志物 E-cad 的表達下降，間充質標志物 N-cad 表達升高時，腫瘤細胞骨架系統排列發生變化細胞生物學性狀改變，粘附功能下降易于脫離原發灶，向周圍組織侵襲或轉移[23]。本研究結果表明敲低 ERα 后，侵襲細胞數明顯減少，E-cad 表達顯著上調，N-cad 表達明顯下調，表明 A549 細胞體外侵襲能力顯著降低，因此敲低 ERα 可通過抑制 A549 細胞的侵襲阻止腫瘤惡性發展。
研究表明 ERα 可能以 E2 依賴的方式促進子宮內膜癌的發生、發展[24]。本研究將對照和轉染 ERα-shRNA1 的 A549 細胞分別注射到裸鼠皮下，結果發現 ERα-shRNA1 組腫瘤重量和體積明顯低于對照組。本研究進一步從組織學層面探討 ERα 與 A549 細胞增殖與遷移的關系，結果表明敲低 ERα 顯著下調 Ki-67 和 N-cad 陽性細胞比率，敲低 ERα 能夠顯著抑制移植瘤的生長，因此敲低 ERα 可有效阻止 A549 細胞的惡性生物學行為。
綜上所述，本研究表明敲低 ERα 的表達能夠抑制 A549 細胞的生長、侵襲及轉移，減緩體內 A549 細胞移植瘤的生長。目前 ERα 拮抗劑（如 TAM）已廣泛應用于臨床，通過與雌激素受體的作用來抑制腫瘤的進展和轉移[25-26]。因此，失活或敲低 ERα 的表達有望成為治療 NSCLC 的新方法，不僅能減少腫瘤患者在手術治療和放化療過程中的痛苦，而且能盡量延長患者的生存期。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的 80%，包括腺癌、鱗癌、低分化癌和大細胞肺癌，是全球癌癥死亡的主要原因之一[1]。在過去的 20 年里，女性 NSCLC 的發病率明顯上升，這可能與女性吸煙率增加有關[2]。但是，大約 20% 的女性肺癌患者從未吸煙，這表明性別依賴性因素可能參與 NSCLC 的發生和發展[3-4]，因而引發國內外學者對雌激素是否與肺癌的生物學特性及發病機制相關的研究。雌激素主要通過雌激素受體（ER）發揮作用。雌激素受體包括雌激素受體 α（ERα）和雌激素受體 β（ERβ），二者同屬于甾體激素核受體家族，存在于細胞核和胞漿中。ERα 是第一個被發現和克隆的 ER[5]，編碼 ERα 的基因 ESR1 位于6號染色體上[6]。近年研究發現，除了乳腺癌、子宮內膜癌等經典激素依賴性腫瘤外[7-8]，ER 也廣泛存在于肺腫瘤及正常肺組織中[9]。顏浩等[10]通過臨床樣本分析研究表明正常肺組織和肺良性腫瘤組織中無 ERα 和 ERβ 表達，NSCLC 中 ERα、ERβ 陽性表達率分別為 20.4%（11/54）、45.1%（26/54），表明 ER 在 NSCLC 的發生過程中起作用。研究已表明 ERβ 失活或下調可能具有治療肺癌的潛在作用[11]，但 ERα 對肺癌的相關研究尚未報道過。研究表明 ERα 在肺腺癌中高表達[12]，因此本研究以 A549 肺腺癌細胞系為研究對象，探究敲低 ERα 的表達對 NSCLC 細胞生存、轉移及裸鼠腫瘤生長的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑和儀器
RPMI1640 和胎牛血清（FBS）購自美國 Gibco；轉染試劑、TRIzol 試劑、反轉錄試劑盒購自美國 Thermo Fisher 公司；RIPA 裂解緩沖液、BCA 定量試劑盒購自上海碧云天公司；基質膠購自美國 BD Biosciences 公司；Ki-67、ERα、上皮型鈣黏蛋白（E-cad）和神經型鈣黏蛋白（N-cad）一抗購自美國 Cell Signaling Technology 公司；辣根過氧化物酶偶聯的二抗購自美國 Santa Cruz Biotechnology；4% 多聚甲醛、結晶紫購自美國 Sigma 公司。紫外分光光度計（美國 Thermo Fisher 公司），倒置顯微鏡（日本 Olympus 公司），FACScan 流式細胞儀（美國 Beckman coulter 公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
A549 細胞系購自美國典型培養物保藏中心（美國 ATCC），將細胞在含有 10% FBS、100 U/mL青霉素和 100 g/mL 鏈霉素的 RPMI1640 中于 37 °C、含 5% CO2 濕潤條件下培養。
1.2.2 細胞轉染
ERα-shRNA 及陰性對照序列由上海英駿生物技術有限公司設計合成，將 A549 細胞傳代培養于 6 孔板中，培養 24 h 后根據轉染試劑盒說明書用 Lipofectamine3000分別轉染陰性對照 shRNA-NC 和干擾序列 ERα-shRNA1 和 ERα-shRNA2，用新鮮培養基替換培養 48 h，然后按照指示處理細胞。干擾序列 ERα-shRNA1、ERα-shRNA2 及陰性對照序列 shRNA-NC 如下：ER-shRNA1：CACCGGGAAGTATGGCTATGGAATCTTCAAGAGAGATTCCATAGCCATACTTCCCTTTTTTG；ER-shRNA2：CACCGGATTTGACCCTCCATGATCATTCAAGAGATGATCATGGAGGGTCAAATCCTTTTTTG；shRNA-NC：CACCGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTTG。
1.2.3 逆轉錄–聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測基因 mRNA 表達
用 Trizol 試劑從各組轉染細胞提取總 RNA，用紫外分光光度計測定 RNA 的純度和濃度。根據反轉錄試劑盒說明書操作，取等質量的總 RNA 作為模板反轉錄成 cDNA。以 cDNA 為模板，PCR 循環為：預變性 95 ℃ 3 min；變性 95 ℃ 15 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，35 個循環；終延伸 72 ℃ 5 min。
1.2.4 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達
用 RIPA 裂解緩沖液提取各組轉染 A549 細胞總蛋白。BCA 測定蛋白濃度并調平，取 20 μg 蛋白在 8% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，并將其轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。在含 5% 脫脂牛奶的 TBST 中封閉 2 h 后，用一抗 4 ℃ 孵育過夜，TBST 洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，37 ℃ 孵育 1 h；洗膜后 ECL 曝光成像并用 quantity one 軟件分析蛋白條帶的灰度值。
1.2.5 克隆形成實驗檢測細胞增殖
shRNA-NC 和 ERα-shRNA1 分別轉染 A549 細胞，以 1000 個/孔的細胞數在 6 孔板中培養 2 周。用 4% 多聚甲醛固定細胞 10 min，用 1% 結晶紫染色 5 min。可見克隆用倒置顯微鏡成像和手工計數，最后計算克隆形成率，克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%[13]。
1.2.6 流式細胞檢測細胞凋亡
將 1.2.5 轉染各組 A549 細胞培養 48 h 后用胰蛋白酶消化，并用冷 PBS 洗滌 2 次。將細胞以 3000 r/min 的速度離心 5 min，然后棄去上清液，并將沉淀以 1.0×106 個/mL 的細胞密度重懸于 1×binding buffer 中。各取 100 μL 的樣品溶液與 5 μL FITC 偶聯的膜聯蛋白（annexin）V（Pharmingen）和 5 μL 碘化丙啶（PI。Pharmingen）在室溫下于黑暗中孵育15 min，向每個樣品管中加入400 μL 1× binding buffer，使用 FACScan 流式細胞儀進行流式分析，annexin V（+）/PI（+/–）細胞占總細胞比率為細胞凋亡率。
1.2.7 Transwell 侵襲實驗
將 Transwell 小室（孔徑為 8 μm，#3422，美國康寧公司）涂上 20 μg 基質膠，取對數生長期的對照組、shRNA-NC 組、ERα-shRNA1 組細胞，以 4.0×104 細胞數播種于上室，放入培養箱。上室采用無血清培養基，下室加入含 10% FBS 的培養基。培養 24 h 后，將膜的下側固定并用 0.1% 結晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞。在顯微鏡下隨機選擇 3 個區域對入侵的細胞進行計數，每個侵襲測定重復至少 6 次[14-15]。
1.2.8 建立裸鼠皮下移植瘤實驗
16 只無特定病原體動物級 BALB/c 小鼠，5～6 周齡，體重 18～22 g，由成都中醫藥大學提供［SCXK（川）2019-11］，飼養于成都中醫藥大學（臨床醫學院）實驗動物中心［SYXK（川）2017-179］，動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。將小鼠飼養于無菌環境中，房間溫度控制在 23～25 ℃，濕度維持在 50%～60%，光照時間 12 h，自由進食高壓滅菌水和無菌飼料，適應性喂養 7 d 后進行實驗。將小鼠隨機分為兩組（n=8），將轉染 ERα-shRNA1 序列的 A549 細胞以 2×106 細胞數皮下注射到裸鼠的側面皮下，記為 ERα-shRNA1 組；對照組皮下注射等細胞數不做轉染處理的 A549 細胞。飼養 30 d，從第 6 d 開始每 3 d 監測 1 次腫瘤體積（V），V=0.5×長度×寬度2[16]。30 d 后，通過頸脫位法處死小鼠，并通過手術切除腫瘤，拍照、稱重并進行石蠟包埋切片，留待后續實驗。
1.2.9 免疫組織化學實驗
將步驟 1.2.8 保存的腫瘤組織石蠟切片脫蠟，檸檬酸鈉緩沖液修復，滴加一抗至切片 4 ℃ 孵育過夜，二抗 37 ℃ 1 h，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈酶蛋白親和素，37 ℃ 作用 40 min，洗滌后避光顯色并用蘇木素復染細胞核。封片后使用光學顯微鏡觀察 Ki-67 和 N-cad 陽性細胞。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件。呈正態分布的計量數據用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），Student t 檢驗用于評估兩組之間的差異。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 利用 shRNA 成功干擾 A549 細胞 ERα 的表達
如圖 1所示，與對照組相比，shRNA NC 組中 ERα 表達量沒有顯著變化；ERα-shRNA1 組和 ERα-shRNA2 組中 ERα 的 mRNA 表達水平分別為 0.11±0.06 和 0.72±0.08，蛋白表達水平分別為 0.02±0.01 和 0.13±0.05，表明 ERα 的表達顯著下調（P <0.05），且轉染 ERα-shRNA1 的干擾效率比 ERα-shRNA2 更高，采用 ERα-shRNA1 進行后續實驗。
圖1
RT-PCR 和 Western blot 驗證 shRNA 的敲低效率（n=6，）
a．RT-PCR 檢測 ERα 的 mRNA 轉錄水平；b．Western blot 檢測 ERα 的蛋白表達：shRNA 干擾效率越高，ERα 的蛋白相對表達量越低。與對照組比較，*
2.2 敲低 ERα 抑制 A549 細胞的生長
如圖 2a所示，與對照組相比，ERα-shRNA1 組 A549 細胞克隆形成率明顯降低（P<0.05），且 A549 細胞中 Ki-67 和 PCNA 的表達量顯著下調（P<0.05，圖 2c），表明敲低 ERα 抑制了 A549 細胞的增殖；如圖 2b所示，與對照組相比，ERα-shRNA1 組細胞凋亡比率顯著增加（P<0.05），提示敲低 ERα 促進細胞凋亡。
圖2
敲低 ERα 對 A549 細胞生長的影響（n=6，）
a．克隆形成實驗檢測細胞增殖，shRNA-NC 組與對照組比較，差異無統計學意義，ERα-shRNA1 組克隆形成率顯著低于對照組；b．流式細胞檢測細胞凋亡，與對照組相比，ERα-shRNA1 組細胞凋亡比率顯著增加；c．RT-PCR 檢測 Ki-67 和 PCNA 的表達量，與對照組相比，ERα-shRNA1 組 A549 細胞中 Ki-67 和 PCNA 的表達量顯著下調。與對照組比較，*
2.3 敲低 ERα 抑制 A549 細胞的運動能力
與對照組相比，敲低 ERα 可以顯著降低 A549 細胞的體外侵襲（31±11 比 82±14，P<0.05，圖 3a），并顯著上調上皮細胞標志物 E-cad 的表達（P<0.05），下調間充質標志物 N-cad 的表達（P<0.05，圖 3b），提示敲低 ERα 抑制了 A549 細胞的侵襲能力。
圖3
敲低 ERα 對 A549 細胞運動能力的影響（n=6，）
a． Transwell 實驗檢測 A549 細胞侵襲能力：shRNA-NC 組與對照組無顯著性差異，ERα-shRNA1 組侵襲細胞數目顯著少于對照組；b． Western blot 檢測侵襲相關蛋白 E-cad 和 N-cad 蛋白表達。與對照組比較，*
2.4 敲低 ERα 能夠抑制體內移植瘤的生長
如圖 4所示，在 30 d 時，對照組腫瘤重量為（0.41±0.08）g，ERα-shRNA1 組腫瘤重量為（0.14±0.06）g，相比之下 ERα-shRNA1 組腫瘤重量顯著降低（P<0.05）；ERα-shRNA1 組腫瘤體積（約 800 mm3）與對照組（約 1800 mm3）相比顯著減小（P <0.05），因此敲低 ERα 阻止了移植瘤的發展進程。
圖4
裸鼠成瘤實驗（n=6，）
a．對照組和轉染 ERα-shRNA1 的 A549 細胞皮下注射裸鼠后形成的腫瘤團塊；b．腫瘤重量統計圖：ERα-shRNA1 組腫瘤重量顯著低于對照組；c．30 d 內每隔 3 d 測量的腫瘤體積曲線圖：ERα-shRNA1 組腫瘤體積顯著小于對照組。與對照組比較，*
2.5 敲低 ERα 抑制移植瘤組織中 Ki-67 和 N-cad 的表達
如圖 5所示，與對照組相比，ERα-shRNA1 組 Ki-67 陽性細胞與 N-cad 陽性細胞數目均顯著減少（P<0.05）。
圖5
免疫組織化學檢測 Ki-67 和 N-cad 陽性細胞（×400，n=6，）
a．Ki-67 陽性細胞呈棕色；b．N-cad 陽性細胞呈棕色。與對照組相比較，*
3 討論
ERα 在細胞中廣泛表達，在激素依賴性和非激素依賴性癌癥中都起著關鍵作用。在激素相關的癌癥（例如乳腺癌、子宮內膜癌和卵巢癌）中，ERα 表達主要通過調節 PI3K/AKT 信號通路來促進疾病進展[17-18]。最近研究表明雌激素與 NSCLC 細胞系 H23 共同培養，癌細胞的增殖明顯受到促進，使用抗雌激素藥物后，癌細胞的增殖明顯受到阻礙[19]。本研究結果表明敲低 ERα 后，細胞克隆形成率明顯降低，凋亡比率顯著增加，并且細胞增殖相關蛋白 Ki-67、PCNA 的表達量顯著下調。PNCA 是一種促進 DNA 延伸的核蛋白，Ki-67 是一種增殖細胞核抗原，其表達與細胞分裂有密切關系，因此 Ki-67 是細胞增殖的理想標志物[20]。因此，敲低 ERα 可抑制 A549 細胞的增殖，促進凋亡，從而發揮抑癌作用。
研究表明 ERα 在腫瘤細胞的轉移及侵襲過程中發揮著重要作用。Zhang 等[21]研究發現降低乳腺癌細胞中 ER-α36 的表達可抑制細胞的增殖、轉移及侵襲能力。Zhang 等[22]應用免疫組織化學檢測發現，ERα 的表達水平與肺腺癌的淋巴結轉移呈正相關性。上皮–間質轉化（EMT）是促進腫瘤侵襲，轉移的主要機制之一，當上皮細胞標志物 E-cad 的表達下降，間充質標志物 N-cad 表達升高時，腫瘤細胞骨架系統排列發生變化細胞生物學性狀改變，粘附功能下降易于脫離原發灶，向周圍組織侵襲或轉移[23]。本研究結果表明敲低 ERα 后，侵襲細胞數明顯減少，E-cad 表達顯著上調，N-cad 表達明顯下調，表明 A549 細胞體外侵襲能力顯著降低，因此敲低 ERα 可通過抑制 A549 細胞的侵襲阻止腫瘤惡性發展。
研究表明 ERα 可能以 E2 依賴的方式促進子宮內膜癌的發生、發展[24]。本研究將對照和轉染 ERα-shRNA1 的 A549 細胞分別注射到裸鼠皮下，結果發現 ERα-shRNA1 組腫瘤重量和體積明顯低于對照組。本研究進一步從組織學層面探討 ERα 與 A549 細胞增殖與遷移的關系，結果表明敲低 ERα 顯著下調 Ki-67 和 N-cad 陽性細胞比率，敲低 ERα 能夠顯著抑制移植瘤的生長，因此敲低 ERα 可有效阻止 A549 細胞的惡性生物學行為。
綜上所述，本研究表明敲低 ERα 的表達能夠抑制 A549 細胞的生長、侵襲及轉移，減緩體內 A549 細胞移植瘤的生長。目前 ERα 拮抗劑（如 TAM）已廣泛應用于臨床，通過與雌激素受體的作用來抑制腫瘤的進展和轉移[25-26]。因此，失活或敲低 ERα 的表達有望成為治療 NSCLC 的新方法，不僅能減少腫瘤患者在手術治療和放化療過程中的痛苦，而且能盡量延長患者的生存期。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
