引用本文： 何明欣, 張華, 周向東, 尤列·皮爾曼, 維克多·科羅索夫, 李琪. 白細胞介素-1受體相關激酶通過TLR-4/MyD88信號通路調控內毒素誘導的氣道黏液高分泌. 中國呼吸與危重監護雜志, 2022, 21(1): 50-54. doi: 10.7507/1671-6205.202002114 復制
正常生理狀態下，呼吸道上皮表面覆蓋著一層分泌黏液，成分有蛋白、水、電解質等，其中具有最重要生理學意義的成分是黏蛋白（mucin，MUC）。正常生理量的黏液數量較少，維持著正常黏液的粘彈性和黏液纖毛清除功能。而在諸多氣道慢性炎癥性疾病下，黏液過度分泌不僅加重氣道阻塞，影響氣體交換，同時也延緩氣道內病原體的清除[1]。黏蛋白5 AC（mucin 5 AC，MUC5AC）主要由支氣管上皮的杯狀細胞合成與分泌，在慢性氣道炎癥性疾病中，大量化生的杯狀細胞分泌過多的MUC5AC是導致氣道黏液栓形成的重要因素[1-3]。細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）存在于革蘭陰性桿菌的胞壁中，多由細菌裂解后釋放，可通過氣道上皮的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR)-4相關信號通路引起氣道炎癥反應及氣道黏液高分泌[4-6]。白細胞介素-1受體相關激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK）是一類細胞內激酶，在炎癥反應的調節中發揮著重要作用[7]。研究表明，IRAK在TLR及白細胞介素（interleukin，IL）-1介導的信號通路中發揮著必不可少的調節作用[8]。作為TLR/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信號通路重要的調控因子[9]，IRAK是否參與介導氣道黏液高分泌仍不甚清楚。本研究擬探討IRAK在LPS誘導的氣道黏液高分泌中的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞
永生化正常人氣道上皮細胞株BEAS-2B（美國ATCC公司）。
1.1.2 主要試劑
胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）高糖細胞培養液（美國GIBCO公司）；LPS（Invitrogen）、脂質體轉染試劑Lipofectamine?RNAi MAX Transfection Reagent（Invitrogen）均購自美國Life Technologies公司；總RNA抽提試劑Trizol（美國Thermo Scientific公司）；逆轉錄（reverse transcription，RT）試劑盒PrimeScript RT reagent Kit、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase酶（大連寶生物公司）；人MUC5AC RT-PCR引物及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（上海生工生物工程技術服務有限公司合成包裝）。人TLR-4特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、人IRAK特異性siRNA及對照siRNA（美國Life Technologies公司）；IRAK激酶抑制劑CAS509093-47-4（德國Merck Millipore公司）；小鼠抗人MUC5AC單克隆抗體、兔抗人IRAK多克隆抗體、兔抗人IRAK磷酸化（T209）多克隆抗體、兔抗人核因子（nuclear factor，NF）-κB多克隆抗體（美國Abcam公司）；小鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）抗體、兔抗人增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體及實驗中使用的二抗，包括辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、HRP-羊抗兔IgG（均購于北京中杉金橋）；細胞膜/胞漿蛋白提取試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒（購于上海生工生物工程技術服務有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
在無菌一次性塑料培養瓶中培養BEAS-2B細胞，放置于37 ℃、5% CO2培養中，細胞生長匯合至70%～80%時常規傳代。傳至8～12代時按5×106個/孔接種于6孔板上，繼續培養貼壁，并使用無血清DMEM高糖培養液（每孔3 mL）繼續培養8 h后分組。
1.2.2 細胞分組
A組：陰性對照組，使用無血清DMEM高糖培養液培養；B組：LPS組，3 mL無血清DMEM高糖培養液中加入總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h后，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；C1組：TLR-4特異性siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染TLR-4特異性siRNA，給予總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h后，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；C2組：TLR-4對照siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染TLR-4對照siRNA，余同C1；D組：IRAK激酶抑制劑+LPS組，BEAS-2B細胞使用600 nmol/L的CAS509093-47-4預處理20 min后，給予總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；E1組：IRAK特異性siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染IRAK特異性siRNA，給予總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h后，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；E2組：IRAK對照siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染IRAK對照siRNA，余同E1。每組6個復孔，重復3次試驗。
1.2.3 細胞轉染
輕柔吸出6孔板中的培養液，用無雙抗無血清的DMEM高糖培養液輕輕洗滌3次，吸棄后加入2 mL無雙抗無血清的DMEM高糖培養液。按Invitrogen公司Lipofectamine?RNAi MAX Transfection Reagent說明書，配置A液：240 μL DMEM高糖培養液，10 μL Lipofectamine 2000；B液：240 μL RPMI1640培養液，10 μL目的siRNA質粒或對照siRNA質粒。將A、B液混合室溫靜置20 min后加入6孔板，每孔加混合液500 μL。輕輕搖動6孔板后于37 ℃，5%的CO2下孵育4 h。用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）輕柔洗滌2次后加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液3 mL培養過夜。
1.2.4 MUC5AC mRNA轉錄水平檢測
采用半定量RT-PCR。應用Trizol法提取細胞內總RNA，紫外分光光度儀測得OD260/OD280為1.90，濃度為1.73 μg/μL。按Takara PrimeScript RT reagent Kit試劑盒說明書將總mRNA逆轉錄成cDNA。再參照Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase說明進行PCR。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。MUC5AC上游引物為5’-TCAACGGAGACTBCGAGTACAC-3’，下游引物為5’-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3’，擴增片段長度為220 bp。內參GAPDH上游引物為5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物為5’-GTCCTGGGATGGAAATTGTGA-3’，擴增片段長度為660 bp。反應條件：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s（PCR內參體系延伸時間為40 s），30個循環后72 ℃最后延伸10 min。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Bio-Rad凝膠圖像分析系統對擴增條帶進行灰度掃描和分析，并以與GAPDH條帶的比值作為MUC5AC mRNA的相對含量。
1.2.5 TLR-4、IRAK、NF-κB p65蛋白水平及IRAK磷酸化水平檢測
采用蛋白印跡法（Western blot）。將各組培養細胞棄上清，用預冷PBS洗滌3次后，按細胞膜/胞漿蛋白提取試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒說明書分別提取膜漿蛋白及核蛋白。雙金雞納酸測定法標化各組蛋白濃度。總蛋白提取物經十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳、切膠、轉膜后，使用含5%牛血清白蛋白的含吐溫20的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液封閉l h，分別與一抗（1∶1000兔抗人IRAK多克隆抗體，1∶300兔抗人IRAK磷酸化多克隆抗體，1∶2000兔抗人NF-κB多克隆抗體），二抗（1∶3000）孵育，用化學發光法進行分析。胞漿蛋白中的NF-κB p65以β-actin為內參，胞核蛋白中的NF-κB p65以PCNA為內參，取相對灰度值作為NF-κB p65的相對含量。
1.2.6 細胞上清液內分泌蛋白MUC5AC水平檢測
采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。取各組細胞培養上清液50 μL，于40 ℃包被96孔酶標反應板，干燥后使用PBS清洗酶標板3次，2%小牛血清室溫封閉1 h；再次PBS清洗3次，按1∶100加入小鼠抗人MUC5AC單克隆抗體孵育1 h后使用PBS洗板3次，加入辣根過氧化物酶溶液顯色，終止反應后在波長450 nm處測各孔吸光度值（A），與標準品比較而得到MUC5AC的相對值計算濃度。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件。所有數據采用均數±標準差（
±s）表示，多組間差異顯著性分析采用多組間單因素方差分析，差異有統計學意義再行兩組間SNK-q檢驗，兩組間單因素分析采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 特異性siRNA轉染效果
經Western blot鑒定，采用TLR-4特異性siRNA轉染、IRAK特異性siRNA轉染，在BEAS-2B細胞株中分別達到下調TLR-4（93.7±6.2）%，下調IRAK（94.2±5.1）%的表達水平（圖1）。
圖1
特異性siRNA轉染BEAS-2B細胞株對TLR-4（a）和IRAK（b）表達的影響
特異性siRNA轉染后BEAS-2B細胞株中TLR-4和IRAK表達水平均明顯下調。B：LPS組；C2：TLR-4對照siRNA+LPS組；C1：TLR-4特異性siRNA+LPS組；E2：IRAK對照siRNA+LPS組；E1：IRAK特異性siRNA+LPS組。
2.2 IRAK蛋白磷酸化水平的鑒定
Western blot結果顯示，經LPS刺激后可顯著提高BEAS-2B細胞內IRAK蛋白的磷酸化水平（P<0.05），而通過轉染TLR-4特異性siRNA的細胞對LPS刺激不敏感，其IRAK蛋白磷酸化水平顯著低于野生型BEAS-2B細胞（P<0.05）（圖2）。
圖2
特異性siRNA轉染對IRAK磷酸化水平的影響
特異性siRNA轉染BEAS-2B細胞株的IRAK磷酸化表達水平明顯低于野生型BEAS-2B細胞。A：陰性對照組；B：LPS組；C1：TLR-4特異性siRNA+LPS組；C2：TLR-4對照siRNA+LPS組。
2.3 Western blot 法鑒定NF-κB p65核轉位情況
Western blot結果顯示，陰性對照組NF-κB p65蛋白絕大部分位于胞漿中，經LPS刺激后，NF-κB p65核內部分增多（P<0.05）；而TLR-4特異性siRNA轉染或IRAK特異性siRNA轉染的細胞，經LPS刺激后，NF-κB p65的轉位入核的部分顯著少于野生型BEAS-2B細胞（P<0.05）；使用IRAK激酶抑制劑預處理，也能得到類似的效果（圖3）。
圖3
Western blot法鑒定NF-κB p65核轉位情況
a. 胞膜及胞漿蛋白提取物；b. 胞核蛋白提取物。LPS刺激后BEAS-2B細胞株的NF-κB p65核內部分增多，特異性siRNA轉染和IRAK激酶抑制劑預處理均可顯著減少NF-κB p65轉位入核。A：陰性對照組；B：LPS組；C1：TLR-4特異性siRNA+LPS組；C2：TLR-4對照siRNA+LPS組；E1：IRAK特異性siRNA+LPS組；C2：IRAK對照siRNA+LPS組；D：IRAK激酶抑制劑+LPS組。
2.4 IRAK在LPS誘導的MUC5AC合成增加中的作用
經LPS刺激后，野生型BEAS-2B細胞株MUC5AC mRNA轉錄水平顯著高于陰性對照組（0.82±0.09比0.22±0.03，P<0.05）；而TLR-4特異性siRNA轉染組（0.36±0.05）、IRAK特異性siRNA轉染組（0.48±0.05）、IRAK激酶抑制劑預處理組（0.57±0.07）MUC5AC mRNA轉錄水平均顯著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B細胞組（均P<0.05）。經ELISA鑒定分析，經LPS刺激后野生型BEAS-2B細胞株MUC5AC蛋白分泌量［（0.76±0.09）μg/L］顯著高于陰性對照組［（0.19±0.02）μg/L］，TLR-4特異性siRNA轉染組［（0.33±0.04）μg/L］、IRAK特異性siRNA轉染組［（0.42±0.05）μg/L］、IRAK激酶抑制劑預處理組［（0.51±0.06）μg/L］MUC5AC分泌量均顯著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B細胞組（均P<0.05）。結果見表1。
表1
MUC5AC轉錄與分泌水平的鑒定（
）
3 討論
TLR-4是革蘭陰性細菌細胞壁成分LPS主要識別受體。脂多糖結合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）與LPS相互結合，形成LPS-LBP復合物，此復合物與可溶性CD14相結合共同構成復合物后錨定于由TLR-4和MyD88構成的受體復合物，從而激活TLR-4激發下游胞內的信號通路[10]。IRAK是近年來研究較多的胞內激酶，在腫瘤與炎癥反應中都發揮了重要的作用[8]。研究發現IRAK在白細胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）及TLR介導的信號通路中發揮重要的調節作用。TLR和IL-1R家族成員均為跨膜蛋白，其胞內段都含有共同大約200個氨基酸組成的保守的TLR/IL-1R同源結構域。在TLR/IL-1R介導的NF-κB激活中，IRAK起著不可或缺的激酶作用[11]。當TLR/IL-1R與配體結合后作為最主要的銜接蛋白，MyD88迅速被募集到受體上，同時與IRAK相互作用形成受體復合物。通過一系列的相互作用，IRAK實現磷酸化激活，從MyD88及受體復合物上釋放，這個過程在信號級聯反應中發揮重要作用。而脫離后激活的IRAK可進一步通過與腫瘤壞死因子受體相關因子6的結合與相互作用，最終激活NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶家族，產生促炎癥因子、趨化因子釋放等其他終端效應[12]。
本研究通過siRNA干擾技術，實現了在人氣道上皮細胞株中下調TLR-4的表達，證實了TLR-4在LPS誘導MUC5AC高分泌中的作用，與以往研究結果相一致[4]。同時本研究結果表明，LPS刺激可顯著提高IRAK磷酸化水平，但不提高細胞內IRAK蛋白總量，表明了IRAK磷酸化調控可能參與了LPS誘導MUC5AC高分泌的信號通路。進一步我們通過構建IRAK特異性siRNA，轉染BEAS-2B細胞株并進行研究發現，下調IRAK水平或使用IRAK激酶抑制劑CAS509093-47-4預處理，可部分抑制LPS刺激所誘導的NF-κB p65核轉位。同時，我們也相應發現IRAK缺陷細胞株對于LPS刺激誘導所產生的MUC5AC轉錄與蛋白分泌水平，均低于野生型BEAS-2B細胞株。使用IRAK激酶抑制劑預處理，也能得到類似的結果。
本研究證實了IRAK作為TLR-4通路中的重要調控因子，在基于TLR的炎癥反應中的重要作用，揭示了IRAK作為TLR受體依賴信號通路上游的重要調控蛋白，在LPS誘導的氣道重要黏蛋白MUC5AC高分泌中的重要作用。在氣道炎癥反應及黏液高分泌方面，基于IRAK調控蛋白的理論研究，也可為臨床治療提供新的靶向思路。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
正常生理狀態下，呼吸道上皮表面覆蓋著一層分泌黏液，成分有蛋白、水、電解質等，其中具有最重要生理學意義的成分是黏蛋白（mucin，MUC）。正常生理量的黏液數量較少，維持著正常黏液的粘彈性和黏液纖毛清除功能。而在諸多氣道慢性炎癥性疾病下，黏液過度分泌不僅加重氣道阻塞，影響氣體交換，同時也延緩氣道內病原體的清除[1]。黏蛋白5 AC（mucin 5 AC，MUC5AC）主要由支氣管上皮的杯狀細胞合成與分泌，在慢性氣道炎癥性疾病中，大量化生的杯狀細胞分泌過多的MUC5AC是導致氣道黏液栓形成的重要因素[1-3]。細菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）存在于革蘭陰性桿菌的胞壁中，多由細菌裂解后釋放，可通過氣道上皮的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR)-4相關信號通路引起氣道炎癥反應及氣道黏液高分泌[4-6]。白細胞介素-1受體相關激酶（interleukin-1 receptor associated kinase，IRAK）是一類細胞內激酶，在炎癥反應的調節中發揮著重要作用[7]。研究表明，IRAK在TLR及白細胞介素（interleukin，IL）-1介導的信號通路中發揮著必不可少的調節作用[8]。作為TLR/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信號通路重要的調控因子[9]，IRAK是否參與介導氣道黏液高分泌仍不甚清楚。本研究擬探討IRAK在LPS誘導的氣道黏液高分泌中的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞
永生化正常人氣道上皮細胞株BEAS-2B（美國ATCC公司）。
1.1.2 主要試劑
胎牛血清、Dulbecco改良Eagle培養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）高糖細胞培養液（美國GIBCO公司）；LPS（Invitrogen）、脂質體轉染試劑Lipofectamine?RNAi MAX Transfection Reagent（Invitrogen）均購自美國Life Technologies公司；總RNA抽提試劑Trizol（美國Thermo Scientific公司）；逆轉錄（reverse transcription，RT）試劑盒PrimeScript RT reagent Kit、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase酶（大連寶生物公司）；人MUC5AC RT-PCR引物及內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物（上海生工生物工程技術服務有限公司合成包裝）。人TLR-4特異性小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）、人IRAK特異性siRNA及對照siRNA（美國Life Technologies公司）；IRAK激酶抑制劑CAS509093-47-4（德國Merck Millipore公司）；小鼠抗人MUC5AC單克隆抗體、兔抗人IRAK多克隆抗體、兔抗人IRAK磷酸化（T209）多克隆抗體、兔抗人核因子（nuclear factor，NF）-κB多克隆抗體（美國Abcam公司）；小鼠抗人β-肌動蛋白（β-actin）抗體、兔抗人增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體及實驗中使用的二抗，包括辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗小鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G、HRP-羊抗兔IgG（均購于北京中杉金橋）；細胞膜/胞漿蛋白提取試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒（購于上海生工生物工程技術服務有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
在無菌一次性塑料培養瓶中培養BEAS-2B細胞，放置于37 ℃、5% CO2培養中，細胞生長匯合至70%～80%時常規傳代。傳至8～12代時按5×106個/孔接種于6孔板上，繼續培養貼壁，并使用無血清DMEM高糖培養液（每孔3 mL）繼續培養8 h后分組。
1.2.2 細胞分組
A組：陰性對照組，使用無血清DMEM高糖培養液培養；B組：LPS組，3 mL無血清DMEM高糖培養液中加入總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h后，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；C1組：TLR-4特異性siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染TLR-4特異性siRNA，給予總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h后，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；C2組：TLR-4對照siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染TLR-4對照siRNA，余同C1；D組：IRAK激酶抑制劑+LPS組，BEAS-2B細胞使用600 nmol/L的CAS509093-47-4預處理20 min后，給予總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；E1組：IRAK特異性siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染IRAK特異性siRNA，給予總濃度為1 μg/mL LPS刺激12 h后，換用無血清DMEM高糖培養液繼續培養；E2組：IRAK對照siRNA+LPS組，BEAS-2B細胞轉染IRAK對照siRNA，余同E1。每組6個復孔，重復3次試驗。
1.2.3 細胞轉染
輕柔吸出6孔板中的培養液，用無雙抗無血清的DMEM高糖培養液輕輕洗滌3次，吸棄后加入2 mL無雙抗無血清的DMEM高糖培養液。按Invitrogen公司Lipofectamine?RNAi MAX Transfection Reagent說明書，配置A液：240 μL DMEM高糖培養液，10 μL Lipofectamine 2000；B液：240 μL RPMI1640培養液，10 μL目的siRNA質粒或對照siRNA質粒。將A、B液混合室溫靜置20 min后加入6孔板，每孔加混合液500 μL。輕輕搖動6孔板后于37 ℃，5%的CO2下孵育4 h。用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）輕柔洗滌2次后加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液3 mL培養過夜。
1.2.4 MUC5AC mRNA轉錄水平檢測
采用半定量RT-PCR。應用Trizol法提取細胞內總RNA，紫外分光光度儀測得OD260/OD280為1.90，濃度為1.73 μg/μL。按Takara PrimeScript RT reagent Kit試劑盒說明書將總mRNA逆轉錄成cDNA。再參照Tarkra PrimeSTARTM DNA Polymerase說明進行PCR。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。MUC5AC上游引物為5’-TCAACGGAGACTBCGAGTACAC-3’，下游引物為5’-TCTTGATGGCCTTGGAGCA-3’，擴增片段長度為220 bp。內參GAPDH上游引物為5’-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3’，下游引物為5’-GTCCTGGGATGGAAATTGTGA-3’，擴增片段長度為660 bp。反應條件：94 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s（PCR內參體系延伸時間為40 s），30個循環后72 ℃最后延伸10 min。擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用Bio-Rad凝膠圖像分析系統對擴增條帶進行灰度掃描和分析，并以與GAPDH條帶的比值作為MUC5AC mRNA的相對含量。
1.2.5 TLR-4、IRAK、NF-κB p65蛋白水平及IRAK磷酸化水平檢測
采用蛋白印跡法（Western blot）。將各組培養細胞棄上清，用預冷PBS洗滌3次后，按細胞膜/胞漿蛋白提取試劑盒、細胞核蛋白提取試劑盒說明書分別提取膜漿蛋白及核蛋白。雙金雞納酸測定法標化各組蛋白濃度。總蛋白提取物經十二烷基硫酸鈉–聚丙烯酰胺凝膠電泳、切膠、轉膜后，使用含5%牛血清白蛋白的含吐溫20的三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液封閉l h，分別與一抗（1∶1000兔抗人IRAK多克隆抗體，1∶300兔抗人IRAK磷酸化多克隆抗體，1∶2000兔抗人NF-κB多克隆抗體），二抗（1∶3000）孵育，用化學發光法進行分析。胞漿蛋白中的NF-κB p65以β-actin為內參，胞核蛋白中的NF-κB p65以PCNA為內參，取相對灰度值作為NF-κB p65的相對含量。
1.2.6 細胞上清液內分泌蛋白MUC5AC水平檢測
采用酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。取各組細胞培養上清液50 μL，于40 ℃包被96孔酶標反應板，干燥后使用PBS清洗酶標板3次，2%小牛血清室溫封閉1 h；再次PBS清洗3次，按1∶100加入小鼠抗人MUC5AC單克隆抗體孵育1 h后使用PBS洗板3次，加入辣根過氧化物酶溶液顯色，終止反應后在波長450 nm處測各孔吸光度值（A），與標準品比較而得到MUC5AC的相對值計算濃度。
1.3 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件。所有數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間差異顯著性分析采用多組間單因素方差分析，差異有統計學意義再行兩組間SNK-q檢驗，兩組間單因素分析采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 特異性siRNA轉染效果
經Western blot鑒定，采用TLR-4特異性siRNA轉染、IRAK特異性siRNA轉染，在BEAS-2B細胞株中分別達到下調TLR-4（93.7±6.2）%，下調IRAK（94.2±5.1）%的表達水平（圖1）。
圖1
特異性siRNA轉染BEAS-2B細胞株對TLR-4（a）和IRAK（b）表達的影響
特異性siRNA轉染后BEAS-2B細胞株中TLR-4和IRAK表達水平均明顯下調。B：LPS組；C2：TLR-4對照siRNA+LPS組；C1：TLR-4特異性siRNA+LPS組；E2：IRAK對照siRNA+LPS組；E1：IRAK特異性siRNA+LPS組。
2.2 IRAK蛋白磷酸化水平的鑒定
Western blot結果顯示，經LPS刺激后可顯著提高BEAS-2B細胞內IRAK蛋白的磷酸化水平（P<0.05），而通過轉染TLR-4特異性siRNA的細胞對LPS刺激不敏感，其IRAK蛋白磷酸化水平顯著低于野生型BEAS-2B細胞（P<0.05）（圖2）。
圖2
特異性siRNA轉染對IRAK磷酸化水平的影響
特異性siRNA轉染BEAS-2B細胞株的IRAK磷酸化表達水平明顯低于野生型BEAS-2B細胞。A：陰性對照組；B：LPS組；C1：TLR-4特異性siRNA+LPS組；C2：TLR-4對照siRNA+LPS組。
2.3 Western blot 法鑒定NF-κB p65核轉位情況
Western blot結果顯示，陰性對照組NF-κB p65蛋白絕大部分位于胞漿中，經LPS刺激后，NF-κB p65核內部分增多（P<0.05）；而TLR-4特異性siRNA轉染或IRAK特異性siRNA轉染的細胞，經LPS刺激后，NF-κB p65的轉位入核的部分顯著少于野生型BEAS-2B細胞（P<0.05）；使用IRAK激酶抑制劑預處理，也能得到類似的效果（圖3）。
圖3
Western blot法鑒定NF-κB p65核轉位情況
a. 胞膜及胞漿蛋白提取物；b. 胞核蛋白提取物。LPS刺激后BEAS-2B細胞株的NF-κB p65核內部分增多，特異性siRNA轉染和IRAK激酶抑制劑預處理均可顯著減少NF-κB p65轉位入核。A：陰性對照組；B：LPS組；C1：TLR-4特異性siRNA+LPS組；C2：TLR-4對照siRNA+LPS組；E1：IRAK特異性siRNA+LPS組；C2：IRAK對照siRNA+LPS組；D：IRAK激酶抑制劑+LPS組。
2.4 IRAK在LPS誘導的MUC5AC合成增加中的作用
經LPS刺激后，野生型BEAS-2B細胞株MUC5AC mRNA轉錄水平顯著高于陰性對照組（0.82±0.09比0.22±0.03，P<0.05）；而TLR-4特異性siRNA轉染組（0.36±0.05）、IRAK特異性siRNA轉染組（0.48±0.05）、IRAK激酶抑制劑預處理組（0.57±0.07）MUC5AC mRNA轉錄水平均顯著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B細胞組（均P<0.05）。經ELISA鑒定分析，經LPS刺激后野生型BEAS-2B細胞株MUC5AC蛋白分泌量［（0.76±0.09）μg/L］顯著高于陰性對照組［（0.19±0.02）μg/L］，TLR-4特異性siRNA轉染組［（0.33±0.04）μg/L］、IRAK特異性siRNA轉染組［（0.42±0.05）μg/L］、IRAK激酶抑制劑預處理組［（0.51±0.06）μg/L］MUC5AC分泌量均顯著低于LPS刺激的野生型BEAS-2B細胞組（均P<0.05）。結果見表1。
表1
MUC5AC轉錄與分泌水平的鑒定（）
3 討論
TLR-4是革蘭陰性細菌細胞壁成分LPS主要識別受體。脂多糖結合蛋白（lipopolysaccharide binding protein，LBP）與LPS相互結合，形成LPS-LBP復合物，此復合物與可溶性CD14相結合共同構成復合物后錨定于由TLR-4和MyD88構成的受體復合物，從而激活TLR-4激發下游胞內的信號通路[10]。IRAK是近年來研究較多的胞內激酶，在腫瘤與炎癥反應中都發揮了重要的作用[8]。研究發現IRAK在白細胞介素-1受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）及TLR介導的信號通路中發揮重要的調節作用。TLR和IL-1R家族成員均為跨膜蛋白，其胞內段都含有共同大約200個氨基酸組成的保守的TLR/IL-1R同源結構域。在TLR/IL-1R介導的NF-κB激活中，IRAK起著不可或缺的激酶作用[11]。當TLR/IL-1R與配體結合后作為最主要的銜接蛋白，MyD88迅速被募集到受體上，同時與IRAK相互作用形成受體復合物。通過一系列的相互作用，IRAK實現磷酸化激活，從MyD88及受體復合物上釋放，這個過程在信號級聯反應中發揮重要作用。而脫離后激活的IRAK可進一步通過與腫瘤壞死因子受體相關因子6的結合與相互作用，最終激活NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶家族，產生促炎癥因子、趨化因子釋放等其他終端效應[12]。
本研究通過siRNA干擾技術，實現了在人氣道上皮細胞株中下調TLR-4的表達，證實了TLR-4在LPS誘導MUC5AC高分泌中的作用，與以往研究結果相一致[4]。同時本研究結果表明，LPS刺激可顯著提高IRAK磷酸化水平，但不提高細胞內IRAK蛋白總量，表明了IRAK磷酸化調控可能參與了LPS誘導MUC5AC高分泌的信號通路。進一步我們通過構建IRAK特異性siRNA，轉染BEAS-2B細胞株并進行研究發現，下調IRAK水平或使用IRAK激酶抑制劑CAS509093-47-4預處理，可部分抑制LPS刺激所誘導的NF-κB p65核轉位。同時，我們也相應發現IRAK缺陷細胞株對于LPS刺激誘導所產生的MUC5AC轉錄與蛋白分泌水平，均低于野生型BEAS-2B細胞株。使用IRAK激酶抑制劑預處理，也能得到類似的結果。
本研究證實了IRAK作為TLR-4通路中的重要調控因子，在基于TLR的炎癥反應中的重要作用，揭示了IRAK作為TLR受體依賴信號通路上游的重要調控蛋白，在LPS誘導的氣道重要黏蛋白MUC5AC高分泌中的重要作用。在氣道炎癥反應及黏液高分泌方面，基于IRAK調控蛋白的理論研究，也可為臨床治療提供新的靶向思路。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
