引用本文： 曾曼, 李琪, 周向東, 維克多·科羅索夫, 尤立·皮爾曼, 安德列·斯帕科. 冷刺激對細顆粒物致氣道上皮炎癥反應的增敏效應及冷誘導 RNA 結合蛋白的轉錄后調控機制. 中國呼吸與危重監護雜志, 2021, 20(3): 195-202. doi: 10.7507/1671-6205.202001023 復制
大量的流行病學研究證實，冷空氣、大氣污染物細顆粒物（PM2.5）與呼吸道炎癥的發生、發展有著密切相關性[1-2]。在寒冷的北方地區，人體呼吸道對于 PM2.5 等不良刺激的侵襲均呈現易激惹狀態，在短時間內常出現痰液大量分泌、氣道炎癥反應加重等病理生理改變[3]，從而導致呼吸道炎癥急性發作的發病率均高于溫暖地區，但其確切機制尚不明確。冷誘導 RNA 結合蛋白（CIRP）是一種冷應激反應蛋白，當機體受到冷空氣、氧化應激及細菌病毒感染等各種環境刺激時，可通過一系列轉錄后調控機制調節機體的病理生理應激功能[4-6]。因此，我們推測 CIRP 是介導低溫環境下 PM2.5 致氣道炎性介質大規模釋放的核心調節因素。本研究擬通過構建冷刺激及 PM2.5 染毒動物及細胞模型，探索 CIRP 參與的調控機制，以期為寒冷地區防治 PM2.5 污染導致的呼吸道炎癥提供可能的干預靶點。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
大容量大氣總顆粒物采樣器（TH-150C 型，Andersen 公司，美國）；石英纖維濾膜（Whatman 公司，美國）；Wistar 大鼠，SPF 級，雌雄不限，4～6 周齡，體重（200±20）g［重慶醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（渝）2017-0002］；人支氣管上皮細胞 16HBE（重慶醫科大學基礎醫學研究所提供）；青–鏈霉素 100X、胎牛血清、RPMI1640 培養液（Hyclone，美國）；檸檬酸抗原修復液、DAB 顯色液、二甲苯（賽維爾生物有限公司，武漢）；兔抗鼠 CIRP 單克隆抗體（Abcam，英國），兔抗鼠 β 肌球蛋白（β-actin）單克隆抗體（碧云天，上海），全蛋白提取試劑盒（索萊寶，北京），RNA 提取試劑盒（百泰克，北京），按 MMLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒（Thermo，美國），實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒（TaKaRa，日本），山羊血清封閉液（蒙博，重慶），羊抗兔 FITC 標記的熒光素 IgG（興悠，上海），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（R&D Systems，美國）。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 細胞的培養與實驗分組
人支氣管上皮細胞株 16HBE 用含 1% 青–鏈霉素 100X 和 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養液常規培養，置于含有 5% CO2 和 37 ℃ 培養箱內培養 48 h 后換液，待細胞融合至 70%～80% 時進行實驗處理。把細胞培養瓶分別放置不同溫度梯度的孵箱中（37 ℃、30 ℃、24 ℃、18 ℃、12 ℃）培養 24 h，根據 CIRP 蛋白表達量確定最適刺激溫度（18 ℃）。設置不同的 PM2.5 終濃度梯度（對照組、0.1 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，PM2.5 顆粒的采集與懸濁液的制備方法參考文獻[7]），分別給予不同終濃度的 PM2.5 懸濁液刺激 30 min 后放置培養箱孵育 24 h。根據 CIRP 蛋白表達量確定最適刺激濃度（5 mg/L）。再把細胞分成 4 組：空白對照組（無胎牛血清無雙抗的培養液，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃ 組（無胎牛血清無雙抗的培養液，18 ℃ 孵育 24 h），PM2.5 組（無胎牛血清無雙抗的培養液，先滴加終濃度為 5 mg/L 的 PM2.5 懸濁液刺激細胞 30 min，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃+PM2.5 組（無胎牛血清無雙抗的培養液，先滴加終濃度為 5 mg/L 的 PM2.5 懸濁液刺激 30 min，18 ℃ 孵育 24 h）。冷刺激后放入 37 ℃ 孵箱中復溫 2 h，提取 16HBE 細胞培養上清液、總蛋白及總 RNA 繼續后續實驗。
1.2.2 動物實驗的分組與染毒
鑒于冷空氣從鼻孔吸入到終末細支氣管其溫度系呈梯度上升的，并非是統一的固定溫度[8-10]，我們用纖維支氣管鏡將微型溫度感受器放置于動物（犬）主支氣管末端，并調整環境溫度，發現即使是環境溫度在 5 ℃ 時，大氣道末端通常仍不低于 18 ℃，而細胞實驗也證實 18 ℃ 系體外上皮細胞培養正常存活的必要溫度，因此我們將動物模型的刺激溫度定為 5 ℃，以保證大支氣管末端溫度達 18 ℃ 左右。PM2.5 懸濁液刺激濃度參考文獻[7]設定為 40 mg/L）。實驗隨機分為 4 組（n=8），即空白對照組（37 ℃ 培養箱霧化吸入 6 mL 生理鹽水），冷刺激組（5 ℃ 培養箱霧化吸入 6 mL 生理鹽水），PM2.5 組（37 ℃ 培養箱超聲霧化吸入 6 mL 終濃度為 40 mg/L 的 PM2.5 懸濁液，約 30 min/次，1 次/d，染毒時間持續 4 周），冷刺激+PM2.5 組（5 ℃ 培養箱超聲霧化吸入 6 mL 終濃度為 40 mg/L 的 PM2.5 懸濁液，約 30 min/次，1 次/d，染毒時間持續 4 周）。第 28 天處死大鼠，剪開頸部皮膚，暴露氣管，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），剝離收集氣管和肺臟，于–80 ℃ 凍存備用。
1.2.3 ELISA 檢測大鼠 BALF 及細胞上清液白細胞介素-6 和腫瘤壞死因子-α 的含量
等量稀釋標準蛋白樣品后，在 96 孔板每孔加各組待測樣品 100 μL，每個樣品孔設 1 個空白對照組（只加 100 μL PBS 緩沖液）和 3 個復孔，分別吸取 BALF 上清液 0.1 mL 包被酶標板 4 ℃ 孵育 10～12 h，含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（PBST）清洗，加入 2% 牛血清蛋白（BSA），37 ℃ 室溫封閉 1 h，而后在 37 ℃ 中孵育白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）一抗 2 h，PBST 清洗后繼續室溫孵生物素–過氧化物酶（HRP）標記的二抗 1 h，洗板，加 TMB 避光顯色 5～10 min 后加入 2 mol/L 硫酸溶液終止反應，在波長 450 nm 處測吸光度值，并與標準品比較計算目的蛋白的相對含量。
1.2.4 qPCR 法檢測大鼠支氣管/肺組織及細胞的 IL-6、TNF-α mRNA 的表達水平
相關引物見表 1。用 TRIzol 分別提取組織及 16HBE 細胞總 RNA，按 MMLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒和 qPCR 試劑盒說明書進行逆轉錄擴增，在 CFX96 Real-Time PCR Detection System 上進行 PCR 定量。參數設置：預變 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s（循環40 次），95 ℃ 10 s，熔解曲線 65 ℃→95 ℃，每 5 s 升溫 0.5 ℃。采用 2–ΔΔCt方法分析目的基因 mRNA 相對表達量。Ct 是熒光達到熒光閾值的循環數，ΔΔCt=實驗組（Ct目的基因–CtGAPDH）–對照組（Ct目的基因–CtGAPDH）。
表1
qPCR 的基因引物序列
1.2.5 蛋白印跡法檢測大鼠肺/支氣管組織及細胞各組 CIRP 蛋白表達水平
提取組織蛋白，將肺組織剪碎，加入 1 mL RIPA 裂解液（含 PMSF 和磷酸酶抑制劑），放于渦旋器振蕩混勻，放置于冰上 10 min，4 ℃ 下 13000 r/min 離心 15 min。取含上清液轉移至冷的新 EP 管，蛋白定量檢測，加入標準上樣緩沖液稀釋至相同濃度，煮沸 10 min，–20 ℃ 保存備用。提取細胞蛋白，在細胞中加入冷裂解液（1 mL 裂解液配有 PMSF、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑各 10 μL），刮匙刮離細胞裂解液移入 EP 管，冰上裂解 30 min。4 ℃ 12000 g 離心 30 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。100 ℃ 煮沸 10 min 備用。于恒壓 80 V 進行蛋白分離電泳，繼而切膠，在電壓 160 V，250 mA 恒流進行轉膜 1 h。用 5% 脫脂奶粉封閉液搖床上封閉目的蛋白 2 h，然后與兔抗鼠 CIRP 單克隆抗體（1∶1000）以及兔抗鼠 β-actin 單克隆抗體（1∶1000）4 ℃ 孵育過夜，接著與相應二抗（1∶5000）室溫孵育 6 min，漂洗后用 ECL 顯色液進行顯色，采集圖像，用 Image lab 5.2.1 進行條帶灰度值分析，并與內參 β-actin 條帶的比值作為相對含量。
1.2.6 細胞免疫熒光法觀察胞內 CIRP 分布的時相動力學規律
利用培養氣道上皮細胞制爬片（具體操作方法參考文獻[11]），實驗分組同步驟 1.2.1，PBS 清洗，4% 多聚甲醛固定液固定 15 min，清洗，0.1% Triton-X100 室溫破膜 30 min，清洗，山羊血清封閉液封閉 1 h，清洗，濕敷 CIRP 一抗（1∶1 000）過夜，清洗，在搖床上避光孵育羊抗兔 FITC（1∶100）標記的熒光素 IgG 1 h，清洗，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。
1.2.7 正常大鼠、冷刺激狀態及 PM2.5 染毒大鼠支氣管/肺組織的 CIRP 定位和表達情況
將四組石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ 15 min，二甲苯Ⅱ 15 min，二甲苯Ⅲ 15 min，無水乙醇Ⅰ 5 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，85% 酒精 5 min，75% 酒精 5 min，脫蠟至水。然后將組織切片置于檸檬酸抗原修復液（pH 6.0）中于微波爐內進行抗原修復，而后把切片放入 3% 雙氧水溶液，室溫避光孵育 25 min，在組化標本內滴加 3% BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉 30 min，4 °C 濕孵一抗過夜，接著室溫孵育 HRP 標記二抗，滴加 DAB 顯色液，脫水封片，最后顯微鏡鏡檢，采集圖像。
1.2.8 人體支氣管/肺組織 CIRP 定位和表達情況
為檢驗 CIRP 在人體肺是否相應存在并發揮可能的作用，我們也觀察了人體支氣管/肺組織 CIRP 的定位和表達情況。24 例標本來自 2018 年 1 月至 2018 年 3 月在廣州中山腫瘤醫院因早期肺癌行切除術的患者，選取癌旁組織（距癌灶>5 cm），慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）為 14 例，對照組（非慢阻肺組）10 例。本研究所用組織標本已由責任醫師取得患方同意并簽署處理組織標本知情同意書。免疫組織化學實驗同步驟 1.2.7，陰性對照組為非免疫源性兔 IgG 代替一抗。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件，服從正態分布的計量資料數據以均數±標準差（
±s）表示，行單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同溫度梯度及不同 PM2.5 濃度梯度下 CIRP 蛋白在 16HBE 細胞中的表達水平及其最適條件
CIRP 的表達量在 30 ℃/0.1 mg/L PM2.5 刺激下相較于對照組有增多趨勢，在 24 ℃/1 mg/L PM2.5 刺激下相較于對照組明顯增多，在 18 ℃/5 mg/L PM2.5 刺激下相較于對照組 CIRP 表達量增多最為顯著，而 12 ℃/10 mg/L PM2.5 刺激下 CIRP 表達量呈下降趨勢，故 18 ℃/5 mg/L PM2.5 分別為最適刺激溫度和濃度。結果見圖 1。
圖1
不同溫度及濃度刺激下 16HBE 細胞內 CIRP 蛋白的表達量
CIRP（溫度）：1. 對照組；2. 30 ℃ 組；3. 24 ℃ 組；4. 18 ℃ 組；5. 12 ℃ 組；CIRP（濃度）：1. 對照組；2. 0.1 mg/L 組；3. 1 mg/L 組；4. 5 mg/L 組；5. 10 mg/L 組。
2.2 各組大鼠支氣管/肺組織、細胞的細胞炎癥因子分泌水平以及 CIRP mRNA 和蛋白表達水平
相較于對照組，5 ℃/18 ℃ 組和 PM2.5 組的 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表達量均有增加，而 5 ℃/18 ℃+PM2.5 組 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表達量更為顯著。結果見表 2 和圖 2。
表2
在體和離體實驗各組炎性因子與 CIRP mRNA 及相關蛋白的表達水平（n=8，
）
圖2
蛋白印跡法檢測在體和離體實驗各組 CIRP 蛋白的表達量
1. 對照組；2. 5 ℃/18 ℃ 組；3. PM2.5 組；4. 5 ℃/18 ℃+ PM2.5 組
2.3 細胞免疫熒光技術觀察不同條件下 CIRP 胞內分布的時相動力學規律
在對照組中，CIRP 的主要大量表達于胞核內（圖 3a），在實驗組中給予 24 h 18 ℃ 冷空氣刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度變亮，胞漿中的 CIRP 表達量有增多趨勢（圖 3b）。單獨給予 PM2.5 刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度相較于對照組也明顯增強，胞漿中的 CIRP 蛋白表達量有增多趨勢（圖 3c）。而后給予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激細胞時，胞核中的 CIRP 蛋白表達量明顯增多，胞漿中的 CIRP 表達量也明顯增多，胞核位移現象更為顯著（圖 3d）。
圖3
不同條件下 CIRP 分布的時相動力學規律（FITC 熒光染色×400）
a. 對照組；b. 18 ℃ 組；c. PM2.5 組；d. 18 ℃+ PM2.5 組。在對照組中，CIRP 的主要大量表達于胞核內，在實驗組中給予 24 h 18 ℃ 冷空氣刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度變亮，胞漿中的 CIRP 表達量有增多趨勢。單獨給予 PM2.5 刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度相較于對照組也明顯增強，胞漿中的 CIRP 蛋白表達量有增多趨勢。而后給予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激細胞時，胞核中的 CIRP 蛋白表達量明顯增多，胞漿中的 CIRP 表達量也明顯增多，胞核位移現象更為顯著。
2.4 各組大鼠支氣管/肺組織中 CIRP 定位及蛋白表達情況
CIRP 在大鼠支氣管/肺組織上皮黏膜中均有表達，且主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內，冷刺激后，CIRP 蛋白的表達水平（圖 4b）顯著高于對照組（圖 4a），在 PM2.5 的單獨刺激下，CIRP 表達（圖 4c）相較于對照組也明顯增加，而在冷刺激的基礎上給予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表達量（圖 4d）變化最為顯著。陰性對照組為非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可見無明顯棕黃色顆粒沉積（圖 4e）。
圖4
各組大鼠支氣管/肺組織 CIRP 的定位及表達情況（免疫組織化學×400）
a. 對照組；b. 5 ℃ 組；c. PM2.5 組；d. 5 ℃+ PM2.5 組；e. 陰性對照組。各組大鼠支氣管/肺組織上皮黏膜中均有表達，且主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內，冷刺激后，CIRP 蛋白的表達水平顯著高于對照組，在冷刺激的基礎上給予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表達量變化最為顯著。陰性對照組無明顯棕黃色顆粒沉積。
2.5 CIRP 在正常人群及慢阻肺患者氣道黏膜上皮中的定位及蛋白表達情況
CIRP 在正常人群和慢阻肺患者支氣管上皮黏膜中均有表達（圖 5a、b），有棕黃色顆粒染色的細胞為 CIRP 陽性表達，其主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內。慢阻肺組（圖 5b）中的氣道上皮細胞的 CIRP 的表達量較正常對照組（圖 5a）明顯增加。陰性對照組為非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可見無棕黃色顆粒沉積（圖 5c）。
圖5
在正常人群及慢阻肺患者中比較 CIRP 在氣道黏膜上皮的定位及表達情況（免疫組織化學×400）
a. 對照組；b. 慢阻肺組；c. 陰性對照組。慢阻肺組的氣道上皮細胞的 CIRP 的表達量較正常對照組明顯增加，陰性對照組無棕黃色顆粒沉積。
3 討論
持續性的冷空氣刺激能引起氣道巨噬細胞活化、中性粒細胞募集、炎性因子增多等一系列病理生理改變[12-13]。而與此同時大氣中不同粒徑大小的顆粒物也可以對機體健康產生影響，尤其 PM2.5，其比表面積大易于富集空氣中的有毒物質，并隨呼吸進入細支氣管和肺泡，對氣道上皮產生有害影響[14-15]。CIRP 是一種冷誘導 RNA 結合蛋白[16]，當機體受缺氧、冷刺激、有毒物質、紫外線照射等損害時 CIRP 可參與發生多種生理病理反應[4，17-19]。CIRP 常伴隨冷應激過程大量表達，并通過剪切 mRNA、終止翻譯、出核、胞內位移和調節穩定性等轉錄后調控機制影響細胞生理應激功能[5，20-21]。已有較多學者致力于 CIRP 介導的冷應激研究，但是在低溫環境背景下，機體為何呈現易激惹狀態，對于外界污染物 PM2.5 的再次侵襲會即刻出現泄洪式的炎性反應？冷空氣和大氣細顆粒物兩因素在時空分布上的重疊是如何使人類呼吸道呈高度敏感狀態？對這些問題目前并無確切的解釋。
本實驗通過構建寒冷刺激和 PM2.5 染毒動物及細胞模型，以冷誘導蛋白 CIRP 以及相關炎癥因子 IL-6、TNF-α 為靶向目標進行研究。首先，本研究通過設計不同的溫度梯度以及不同的 PM2.5 懸濁液濃度梯度的實驗，明確了細胞模型的最適刺激溫度為 18 ℃，其最適 PM2.5 懸濁液刺激濃度為 5 mg/L。此外，由于我們曾用纖維支氣管鏡將微型溫度感受儀放置于動物（犬）的主支氣管末端，并嘗試調整環境溫度，發現即使是環境溫度在 5 ℃ 時，大氣道末端通常仍不低于 18 ℃。而且已有研究證實氣道具有加溫加濕的作用，從鼻孔中吸入冷空氣到終末細支氣管其空氣溫度系呈梯度上升的，并非是統一的固定溫度[8-10]。而我們的細胞實驗證實 18 ℃ 系體外上皮細胞培養正常存活的必要溫度，因此我們將動物實驗的刺激溫度定為 5 ℃，以保證大支氣管末端溫度達 18 ℃ 左右。以冷刺激和 PM2.5 為誘導因素，本實驗采用蛋白印跡法明確了動物及細胞實驗中兩組誘導因素的疊加作用使得 CIRP 的表達量相較于對照組、冷刺激組、PM2.5 組均有顯著升高，再次提示 CIRP 參與了冷刺激對 PM2.5 所致氣道上皮炎癥反應有增敏效應的調控。接著，以 IL-6、TNF-α 作為炎癥反應強度的觀察的指標，以 qPCR、ELISA 檢測動物及細胞炎癥因子轉錄水平及相關蛋白表達量，結果顯示暴露于冷刺激以及 PM2.5 污染環境均會導致機體炎癥因子表達增多，而機體在冷空氣的刺激后再次受到空氣污染物 PM2.5 的侵襲時炎性因子的轉錄水平以及翻譯效率大大提升。由此提示在冷空氣下，CIRP 可對 IL-6、TNF-α 等炎性因子以及自身的 mRNA 進行剪切，暫時終止翻譯，并通過多種信號蛋白的幫助運輸到胞漿中儲存；當機體再次受到空氣污染物 PM2.5 的侵襲時，存儲于胞漿中的炎性因子 mRNA 可直接轉錄或翻譯，從而使機體出現泄洪式炎癥反應，進一步提高了其應激反應的效率。
其次，本實驗以細胞免疫熒光法觀察各組細胞胞內 CIRP 分布的時相動力學規律，發現 CIRP 主要定位于胞核內，18 ℃ 組和 PM2.5 組單獨受刺激后細胞 CIRP 蛋白有出核至胞漿的趨勢，而 18 ℃+PM2.5 組 CIRP 蛋白移位現象更為顯著。這提示真核細胞受到冷空氣刺激，部分 CIRP 從胞核轉移至胞漿，并介導相關炎癥因子以 mRNA 的形式儲存于胞漿中；當機體再次受到大氣污染物 PM2.5 的侵襲時，位于胞漿中的 CIRP 能誘導炎性因子 mRNA 迅速進入翻譯狀態，從而在短時間內出現痰液大量分泌和炎性介質大量浸潤，引起氣道上皮的炎性損傷，進一步擴大不良刺激及致病因素致呼吸道損害的效應。
最后，本研究利用免疫組織化學方法檢測了各組大鼠支氣管/肺組織中 CIRP 的定位以及表達水平，結果顯示 CIRP 在大鼠支氣管/肺組織上皮黏膜中均有表達，且主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內；5 ℃ 組以及 PM2.5 染毒組的單獨刺激均使得 CIRP 的表達水平有增高趨勢；而在持續地冷刺激后再給予大鼠 PM2.5 侵襲時，支氣管/肺組織內 CIRP 的表達量大幅度增加，這提示了冷空氣持續地刺激下 CIRP 表達量增多，維持機體呼吸道的敏感狀態，使其能夠對 PM2.5 等突襲而來的傷害性刺激作出快速應答反應，從而起到儲備性自主防御的作用。此外，為了驗證 CIRP 在人體肺組織也相應存在并發揮可能的作用，我們還對正常人群以及慢阻肺患者進行標本采集，觀察了人體支氣管/肺組織 CIRP 的定位和表達情況。當然，由于人體研究的倫理要求，無法做到細胞和動物實驗相應的分組和干預條件，只是就簡單區分的目標人群進行了觀察。研究證實了 CIRP 蛋白在人支氣管氣道上皮有所表達，主要富集于支氣管管腔；同時發現相較于正常人群，罹患慢性呼吸道炎癥的患者其 CIRP 的表達量明顯增多，提示 CIRP 與組織感染、黏液分泌等一系列炎性反應癥狀的進展和預后有密切關系。
綜上，本研究證實了在低溫環境下 CIRP 的時相變化是真核生物應對嚴峻環境脅迫時自主呈現的一種重要的轉錄后細胞保護機制，明確 CIRP 參與了冷刺激對 PM2.5 致氣道上皮炎癥反應的增敏效應。這不僅對闡明機體的轉錄后調控機制具有重要研究意義及臨床價值，亦有助于進一步詮釋大氣污染對氣道的健康效應，且能為寒冷地區空氣污染導致呼吸道炎癥的防控提供理論依據。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
大量的流行病學研究證實，冷空氣、大氣污染物細顆粒物（PM2.5）與呼吸道炎癥的發生、發展有著密切相關性[1-2]。在寒冷的北方地區，人體呼吸道對于 PM2.5 等不良刺激的侵襲均呈現易激惹狀態，在短時間內常出現痰液大量分泌、氣道炎癥反應加重等病理生理改變[3]，從而導致呼吸道炎癥急性發作的發病率均高于溫暖地區，但其確切機制尚不明確。冷誘導 RNA 結合蛋白（CIRP）是一種冷應激反應蛋白，當機體受到冷空氣、氧化應激及細菌病毒感染等各種環境刺激時，可通過一系列轉錄后調控機制調節機體的病理生理應激功能[4-6]。因此，我們推測 CIRP 是介導低溫環境下 PM2.5 致氣道炎性介質大規模釋放的核心調節因素。本研究擬通過構建冷刺激及 PM2.5 染毒動物及細胞模型，探索 CIRP 參與的調控機制，以期為寒冷地區防治 PM2.5 污染導致的呼吸道炎癥提供可能的干預靶點。
1 材料與方法
1.1 主要材料與試劑
大容量大氣總顆粒物采樣器（TH-150C 型，Andersen 公司，美國）；石英纖維濾膜（Whatman 公司，美國）；Wistar 大鼠，SPF 級，雌雄不限，4～6 周齡，體重（200±20）g［重慶醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（渝）2017-0002］；人支氣管上皮細胞 16HBE（重慶醫科大學基礎醫學研究所提供）；青–鏈霉素 100X、胎牛血清、RPMI1640 培養液（Hyclone，美國）；檸檬酸抗原修復液、DAB 顯色液、二甲苯（賽維爾生物有限公司，武漢）；兔抗鼠 CIRP 單克隆抗體（Abcam，英國），兔抗鼠 β 肌球蛋白（β-actin）單克隆抗體（碧云天，上海），全蛋白提取試劑盒（索萊寶，北京），RNA 提取試劑盒（百泰克，北京），按 MMLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒（Thermo，美國），實時熒光定量聚合酶鏈反應（qPCR）試劑盒（TaKaRa，日本），山羊血清封閉液（蒙博，重慶），羊抗兔 FITC 標記的熒光素 IgG（興悠，上海），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（R&D Systems，美國）。所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 細胞的培養與實驗分組
人支氣管上皮細胞株 16HBE 用含 1% 青–鏈霉素 100X 和 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養液常規培養，置于含有 5% CO2 和 37 ℃ 培養箱內培養 48 h 后換液，待細胞融合至 70%～80% 時進行實驗處理。把細胞培養瓶分別放置不同溫度梯度的孵箱中（37 ℃、30 ℃、24 ℃、18 ℃、12 ℃）培養 24 h，根據 CIRP 蛋白表達量確定最適刺激溫度（18 ℃）。設置不同的 PM2.5 終濃度梯度（對照組、0.1 mg/L、1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L，PM2.5 顆粒的采集與懸濁液的制備方法參考文獻[7]），分別給予不同終濃度的 PM2.5 懸濁液刺激 30 min 后放置培養箱孵育 24 h。根據 CIRP 蛋白表達量確定最適刺激濃度（5 mg/L）。再把細胞分成 4 組：空白對照組（無胎牛血清無雙抗的培養液，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃ 組（無胎牛血清無雙抗的培養液，18 ℃ 孵育 24 h），PM2.5 組（無胎牛血清無雙抗的培養液，先滴加終濃度為 5 mg/L 的 PM2.5 懸濁液刺激細胞 30 min，37 ℃ 孵育 24 h），18 ℃+PM2.5 組（無胎牛血清無雙抗的培養液，先滴加終濃度為 5 mg/L 的 PM2.5 懸濁液刺激 30 min，18 ℃ 孵育 24 h）。冷刺激后放入 37 ℃ 孵箱中復溫 2 h，提取 16HBE 細胞培養上清液、總蛋白及總 RNA 繼續后續實驗。
1.2.2 動物實驗的分組與染毒
鑒于冷空氣從鼻孔吸入到終末細支氣管其溫度系呈梯度上升的，并非是統一的固定溫度[8-10]，我們用纖維支氣管鏡將微型溫度感受器放置于動物（犬）主支氣管末端，并調整環境溫度，發現即使是環境溫度在 5 ℃ 時，大氣道末端通常仍不低于 18 ℃，而細胞實驗也證實 18 ℃ 系體外上皮細胞培養正常存活的必要溫度，因此我們將動物模型的刺激溫度定為 5 ℃，以保證大支氣管末端溫度達 18 ℃ 左右。PM2.5 懸濁液刺激濃度參考文獻[7]設定為 40 mg/L）。實驗隨機分為 4 組（n=8），即空白對照組（37 ℃ 培養箱霧化吸入 6 mL 生理鹽水），冷刺激組（5 ℃ 培養箱霧化吸入 6 mL 生理鹽水），PM2.5 組（37 ℃ 培養箱超聲霧化吸入 6 mL 終濃度為 40 mg/L 的 PM2.5 懸濁液，約 30 min/次，1 次/d，染毒時間持續 4 周），冷刺激+PM2.5 組（5 ℃ 培養箱超聲霧化吸入 6 mL 終濃度為 40 mg/L 的 PM2.5 懸濁液，約 30 min/次，1 次/d，染毒時間持續 4 周）。第 28 天處死大鼠，剪開頸部皮膚，暴露氣管，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），剝離收集氣管和肺臟，于–80 ℃ 凍存備用。
1.2.3 ELISA 檢測大鼠 BALF 及細胞上清液白細胞介素-6 和腫瘤壞死因子-α 的含量
等量稀釋標準蛋白樣品后，在 96 孔板每孔加各組待測樣品 100 μL，每個樣品孔設 1 個空白對照組（只加 100 μL PBS 緩沖液）和 3 個復孔，分別吸取 BALF 上清液 0.1 mL 包被酶標板 4 ℃ 孵育 10～12 h，含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（PBST）清洗，加入 2% 牛血清蛋白（BSA），37 ℃ 室溫封閉 1 h，而后在 37 ℃ 中孵育白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）一抗 2 h，PBST 清洗后繼續室溫孵生物素–過氧化物酶（HRP）標記的二抗 1 h，洗板，加 TMB 避光顯色 5～10 min 后加入 2 mol/L 硫酸溶液終止反應，在波長 450 nm 處測吸光度值，并與標準品比較計算目的蛋白的相對含量。
1.2.4 qPCR 法檢測大鼠支氣管/肺組織及細胞的 IL-6、TNF-α mRNA 的表達水平
相關引物見表 1。用 TRIzol 分別提取組織及 16HBE 細胞總 RNA，按 MMLV 第一鏈 cDNA 合成試劑盒和 qPCR 試劑盒說明書進行逆轉錄擴增，在 CFX96 Real-Time PCR Detection System 上進行 PCR 定量。參數設置：預變 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s→95 ℃ 5 s（循環40 次），95 ℃ 10 s，熔解曲線 65 ℃→95 ℃，每 5 s 升溫 0.5 ℃。采用 2–ΔΔCt方法分析目的基因 mRNA 相對表達量。Ct 是熒光達到熒光閾值的循環數，ΔΔCt=實驗組（Ct目的基因–CtGAPDH）–對照組（Ct目的基因–CtGAPDH）。
表1
qPCR 的基因引物序列
1.2.5 蛋白印跡法檢測大鼠肺/支氣管組織及細胞各組 CIRP 蛋白表達水平
提取組織蛋白，將肺組織剪碎，加入 1 mL RIPA 裂解液（含 PMSF 和磷酸酶抑制劑），放于渦旋器振蕩混勻，放置于冰上 10 min，4 ℃ 下 13000 r/min 離心 15 min。取含上清液轉移至冷的新 EP 管，蛋白定量檢測，加入標準上樣緩沖液稀釋至相同濃度，煮沸 10 min，–20 ℃ 保存備用。提取細胞蛋白，在細胞中加入冷裂解液（1 mL 裂解液配有 PMSF、磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑各 10 μL），刮匙刮離細胞裂解液移入 EP 管，冰上裂解 30 min。4 ℃ 12000 g 離心 30 min，取上清液，BCA 法測定蛋白濃度。100 ℃ 煮沸 10 min 備用。于恒壓 80 V 進行蛋白分離電泳，繼而切膠，在電壓 160 V，250 mA 恒流進行轉膜 1 h。用 5% 脫脂奶粉封閉液搖床上封閉目的蛋白 2 h，然后與兔抗鼠 CIRP 單克隆抗體（1∶1000）以及兔抗鼠 β-actin 單克隆抗體（1∶1000）4 ℃ 孵育過夜，接著與相應二抗（1∶5000）室溫孵育 6 min，漂洗后用 ECL 顯色液進行顯色，采集圖像，用 Image lab 5.2.1 進行條帶灰度值分析，并與內參 β-actin 條帶的比值作為相對含量。
1.2.6 細胞免疫熒光法觀察胞內 CIRP 分布的時相動力學規律
利用培養氣道上皮細胞制爬片（具體操作方法參考文獻[11]），實驗分組同步驟 1.2.1，PBS 清洗，4% 多聚甲醛固定液固定 15 min，清洗，0.1% Triton-X100 室溫破膜 30 min，清洗，山羊血清封閉液封閉 1 h，清洗，濕敷 CIRP 一抗（1∶1 000）過夜，清洗，在搖床上避光孵育羊抗兔 FITC（1∶100）標記的熒光素 IgG 1 h，清洗，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。
1.2.7 正常大鼠、冷刺激狀態及 PM2.5 染毒大鼠支氣管/肺組織的 CIRP 定位和表達情況
將四組石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ 15 min，二甲苯Ⅱ 15 min，二甲苯Ⅲ 15 min，無水乙醇Ⅰ 5 min，無水乙醇Ⅱ 5 min，85% 酒精 5 min，75% 酒精 5 min，脫蠟至水。然后將組織切片置于檸檬酸抗原修復液（pH 6.0）中于微波爐內進行抗原修復，而后把切片放入 3% 雙氧水溶液，室溫避光孵育 25 min，在組化標本內滴加 3% BSA 均勻覆蓋組織，室溫封閉 30 min，4 °C 濕孵一抗過夜，接著室溫孵育 HRP 標記二抗，滴加 DAB 顯色液，脫水封片，最后顯微鏡鏡檢，采集圖像。
1.2.8 人體支氣管/肺組織 CIRP 定位和表達情況
為檢驗 CIRP 在人體肺是否相應存在并發揮可能的作用，我們也觀察了人體支氣管/肺組織 CIRP 的定位和表達情況。24 例標本來自 2018 年 1 月至 2018 年 3 月在廣州中山腫瘤醫院因早期肺癌行切除術的患者，選取癌旁組織（距癌灶>5 cm），慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）為 14 例，對照組（非慢阻肺組）10 例。本研究所用組織標本已由責任醫師取得患方同意并簽署處理組織標本知情同意書。免疫組織化學實驗同步驟 1.2.7，陰性對照組為非免疫源性兔 IgG 代替一抗。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件，服從正態分布的計量資料數據以均數±標準差（±s）表示，行單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同溫度梯度及不同 PM2.5 濃度梯度下 CIRP 蛋白在 16HBE 細胞中的表達水平及其最適條件
CIRP 的表達量在 30 ℃/0.1 mg/L PM2.5 刺激下相較于對照組有增多趨勢，在 24 ℃/1 mg/L PM2.5 刺激下相較于對照組明顯增多，在 18 ℃/5 mg/L PM2.5 刺激下相較于對照組 CIRP 表達量增多最為顯著，而 12 ℃/10 mg/L PM2.5 刺激下 CIRP 表達量呈下降趨勢，故 18 ℃/5 mg/L PM2.5 分別為最適刺激溫度和濃度。結果見圖 1。
圖1
不同溫度及濃度刺激下 16HBE 細胞內 CIRP 蛋白的表達量
CIRP（溫度）：1. 對照組；2. 30 ℃ 組；3. 24 ℃ 組；4. 18 ℃ 組；5. 12 ℃ 組；CIRP（濃度）：1. 對照組；2. 0.1 mg/L 組；3. 1 mg/L 組；4. 5 mg/L 組；5. 10 mg/L 組。
2.2 各組大鼠支氣管/肺組織、細胞的細胞炎癥因子分泌水平以及 CIRP mRNA 和蛋白表達水平
相較于對照組，5 ℃/18 ℃ 組和 PM2.5 組的 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表達量均有增加，而 5 ℃/18 ℃+PM2.5 組 CIRP、IL-6、TNF-α mRNA 及蛋白表達量更為顯著。結果見表 2 和圖 2。
表2
在體和離體實驗各組炎性因子與 CIRP mRNA 及相關蛋白的表達水平（n=8，）
圖2
蛋白印跡法檢測在體和離體實驗各組 CIRP 蛋白的表達量
1. 對照組；2. 5 ℃/18 ℃ 組；3. PM2.5 組；4. 5 ℃/18 ℃+ PM2.5 組
2.3 細胞免疫熒光技術觀察不同條件下 CIRP 胞內分布的時相動力學規律
在對照組中，CIRP 的主要大量表達于胞核內（圖 3a），在實驗組中給予 24 h 18 ℃ 冷空氣刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度變亮，胞漿中的 CIRP 表達量有增多趨勢（圖 3b）。單獨給予 PM2.5 刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度相較于對照組也明顯增強，胞漿中的 CIRP 蛋白表達量有增多趨勢（圖 3c）。而后給予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激細胞時，胞核中的 CIRP 蛋白表達量明顯增多，胞漿中的 CIRP 表達量也明顯增多，胞核位移現象更為顯著（圖 3d）。
圖3
不同條件下 CIRP 分布的時相動力學規律（FITC 熒光染色×400）
a. 對照組；b. 18 ℃ 組；c. PM2.5 組；d. 18 ℃+ PM2.5 組。在對照組中，CIRP 的主要大量表達于胞核內，在實驗組中給予 24 h 18 ℃ 冷空氣刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度變亮，胞漿中的 CIRP 表達量有增多趨勢。單獨給予 PM2.5 刺激時，胞核內的 CIRP 熒光強度相較于對照組也明顯增強，胞漿中的 CIRP 蛋白表達量有增多趨勢。而后給予 24 h 18 ℃+PM2.5 刺激細胞時，胞核中的 CIRP 蛋白表達量明顯增多，胞漿中的 CIRP 表達量也明顯增多，胞核位移現象更為顯著。
2.4 各組大鼠支氣管/肺組織中 CIRP 定位及蛋白表達情況
CIRP 在大鼠支氣管/肺組織上皮黏膜中均有表達，且主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內，冷刺激后，CIRP 蛋白的表達水平（圖 4b）顯著高于對照組（圖 4a），在 PM2.5 的單獨刺激下，CIRP 表達（圖 4c）相較于對照組也明顯增加，而在冷刺激的基礎上給予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表達量（圖 4d）變化最為顯著。陰性對照組為非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可見無明顯棕黃色顆粒沉積（圖 4e）。
圖4
各組大鼠支氣管/肺組織 CIRP 的定位及表達情況（免疫組織化學×400）
a. 對照組；b. 5 ℃ 組；c. PM2.5 組；d. 5 ℃+ PM2.5 組；e. 陰性對照組。各組大鼠支氣管/肺組織上皮黏膜中均有表達，且主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內，冷刺激后，CIRP 蛋白的表達水平顯著高于對照組，在冷刺激的基礎上給予 PM2.5 染毒使得 CIRP 的表達量變化最為顯著。陰性對照組無明顯棕黃色顆粒沉積。
2.5 CIRP 在正常人群及慢阻肺患者氣道黏膜上皮中的定位及蛋白表達情況
CIRP 在正常人群和慢阻肺患者支氣管上皮黏膜中均有表達（圖 5a、b），有棕黃色顆粒染色的細胞為 CIRP 陽性表達，其主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內。慢阻肺組（圖 5b）中的氣道上皮細胞的 CIRP 的表達量較正常對照組（圖 5a）明顯增加。陰性對照組為非免疫源性兔 IgG 代替 CIRP 一抗，可見無棕黃色顆粒沉積（圖 5c）。
圖5
在正常人群及慢阻肺患者中比較 CIRP 在氣道黏膜上皮的定位及表達情況（免疫組織化學×400）
a. 對照組；b. 慢阻肺組；c. 陰性對照組。慢阻肺組的氣道上皮細胞的 CIRP 的表達量較正常對照組明顯增加，陰性對照組無棕黃色顆粒沉積。
3 討論
持續性的冷空氣刺激能引起氣道巨噬細胞活化、中性粒細胞募集、炎性因子增多等一系列病理生理改變[12-13]。而與此同時大氣中不同粒徑大小的顆粒物也可以對機體健康產生影響，尤其 PM2.5，其比表面積大易于富集空氣中的有毒物質，并隨呼吸進入細支氣管和肺泡，對氣道上皮產生有害影響[14-15]。CIRP 是一種冷誘導 RNA 結合蛋白[16]，當機體受缺氧、冷刺激、有毒物質、紫外線照射等損害時 CIRP 可參與發生多種生理病理反應[4，17-19]。CIRP 常伴隨冷應激過程大量表達，并通過剪切 mRNA、終止翻譯、出核、胞內位移和調節穩定性等轉錄后調控機制影響細胞生理應激功能[5，20-21]。已有較多學者致力于 CIRP 介導的冷應激研究，但是在低溫環境背景下，機體為何呈現易激惹狀態，對于外界污染物 PM2.5 的再次侵襲會即刻出現泄洪式的炎性反應？冷空氣和大氣細顆粒物兩因素在時空分布上的重疊是如何使人類呼吸道呈高度敏感狀態？對這些問題目前并無確切的解釋。
本實驗通過構建寒冷刺激和 PM2.5 染毒動物及細胞模型，以冷誘導蛋白 CIRP 以及相關炎癥因子 IL-6、TNF-α 為靶向目標進行研究。首先，本研究通過設計不同的溫度梯度以及不同的 PM2.5 懸濁液濃度梯度的實驗，明確了細胞模型的最適刺激溫度為 18 ℃，其最適 PM2.5 懸濁液刺激濃度為 5 mg/L。此外，由于我們曾用纖維支氣管鏡將微型溫度感受儀放置于動物（犬）的主支氣管末端，并嘗試調整環境溫度，發現即使是環境溫度在 5 ℃ 時，大氣道末端通常仍不低于 18 ℃。而且已有研究證實氣道具有加溫加濕的作用，從鼻孔中吸入冷空氣到終末細支氣管其空氣溫度系呈梯度上升的，并非是統一的固定溫度[8-10]。而我們的細胞實驗證實 18 ℃ 系體外上皮細胞培養正常存活的必要溫度，因此我們將動物實驗的刺激溫度定為 5 ℃，以保證大支氣管末端溫度達 18 ℃ 左右。以冷刺激和 PM2.5 為誘導因素，本實驗采用蛋白印跡法明確了動物及細胞實驗中兩組誘導因素的疊加作用使得 CIRP 的表達量相較于對照組、冷刺激組、PM2.5 組均有顯著升高，再次提示 CIRP 參與了冷刺激對 PM2.5 所致氣道上皮炎癥反應有增敏效應的調控。接著，以 IL-6、TNF-α 作為炎癥反應強度的觀察的指標，以 qPCR、ELISA 檢測動物及細胞炎癥因子轉錄水平及相關蛋白表達量，結果顯示暴露于冷刺激以及 PM2.5 污染環境均會導致機體炎癥因子表達增多，而機體在冷空氣的刺激后再次受到空氣污染物 PM2.5 的侵襲時炎性因子的轉錄水平以及翻譯效率大大提升。由此提示在冷空氣下，CIRP 可對 IL-6、TNF-α 等炎性因子以及自身的 mRNA 進行剪切，暫時終止翻譯，并通過多種信號蛋白的幫助運輸到胞漿中儲存；當機體再次受到空氣污染物 PM2.5 的侵襲時，存儲于胞漿中的炎性因子 mRNA 可直接轉錄或翻譯，從而使機體出現泄洪式炎癥反應，進一步提高了其應激反應的效率。
其次，本實驗以細胞免疫熒光法觀察各組細胞胞內 CIRP 分布的時相動力學規律，發現 CIRP 主要定位于胞核內，18 ℃ 組和 PM2.5 組單獨受刺激后細胞 CIRP 蛋白有出核至胞漿的趨勢，而 18 ℃+PM2.5 組 CIRP 蛋白移位現象更為顯著。這提示真核細胞受到冷空氣刺激，部分 CIRP 從胞核轉移至胞漿，并介導相關炎癥因子以 mRNA 的形式儲存于胞漿中；當機體再次受到大氣污染物 PM2.5 的侵襲時，位于胞漿中的 CIRP 能誘導炎性因子 mRNA 迅速進入翻譯狀態，從而在短時間內出現痰液大量分泌和炎性介質大量浸潤，引起氣道上皮的炎性損傷，進一步擴大不良刺激及致病因素致呼吸道損害的效應。
最后，本研究利用免疫組織化學方法檢測了各組大鼠支氣管/肺組織中 CIRP 的定位以及表達水平，結果顯示 CIRP 在大鼠支氣管/肺組織上皮黏膜中均有表達，且主要位于氣道黏膜上皮細胞胞核內；5 ℃ 組以及 PM2.5 染毒組的單獨刺激均使得 CIRP 的表達水平有增高趨勢；而在持續地冷刺激后再給予大鼠 PM2.5 侵襲時，支氣管/肺組織內 CIRP 的表達量大幅度增加，這提示了冷空氣持續地刺激下 CIRP 表達量增多，維持機體呼吸道的敏感狀態，使其能夠對 PM2.5 等突襲而來的傷害性刺激作出快速應答反應，從而起到儲備性自主防御的作用。此外，為了驗證 CIRP 在人體肺組織也相應存在并發揮可能的作用，我們還對正常人群以及慢阻肺患者進行標本采集，觀察了人體支氣管/肺組織 CIRP 的定位和表達情況。當然，由于人體研究的倫理要求，無法做到細胞和動物實驗相應的分組和干預條件，只是就簡單區分的目標人群進行了觀察。研究證實了 CIRP 蛋白在人支氣管氣道上皮有所表達，主要富集于支氣管管腔；同時發現相較于正常人群，罹患慢性呼吸道炎癥的患者其 CIRP 的表達量明顯增多，提示 CIRP 與組織感染、黏液分泌等一系列炎性反應癥狀的進展和預后有密切關系。
綜上，本研究證實了在低溫環境下 CIRP 的時相變化是真核生物應對嚴峻環境脅迫時自主呈現的一種重要的轉錄后細胞保護機制，明確 CIRP 參與了冷刺激對 PM2.5 致氣道上皮炎癥反應的增敏效應。這不僅對闡明機體的轉錄后調控機制具有重要研究意義及臨床價值，亦有助于進一步詮釋大氣污染對氣道的健康效應，且能為寒冷地區空氣污染導致呼吸道炎癥的防控提供理論依據。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
