引用本文： 齊玉晶, 王哲, 孫雪皎, 賓雁飛, 李穎華, 何志義. 基于 16S rRNA 基因高通量測序分析慢性阻塞性肺疾病急性加重患者的誘導痰微生態多樣性. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(4): 359-365. doi: 10.7507/1671-6205.201909075 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種以慢性進行性的不可逆氣流受限為特點的阻塞性氣道疾病[1]。慢阻肺患者因呼吸道癥狀的突然加重而導致需要額外的治療，稱為慢阻肺急性加重[2]。慢阻肺急性加重可促進肺功能進行性惡化，是患者生活質量下降以及高死亡率主要原因[3]。慢阻肺急性加重發病的主要原因是細菌或病毒感染，50% 以上的慢阻肺急性加重是由于細菌或病毒感染引起的[4]。細菌感染或細菌長期定植在慢阻肺急性加重的發生中發揮著重要的作用[5]。既往研究慢阻肺急性加重的致病菌一般依靠細菌培養的方法，因此人們對于病原菌的認識通常局限在常見病原體上[6]。隨著高通量測序等生物信息學技術的發展，人們可以從整體水平認識氣道微生態的特點。本研究通過橫斷面調查住院患者慢阻肺急性加重的誘導痰，使用 16S rRNA 高通量測序技術測定誘導痰的微生態多樣性，分析慢阻肺急性加重患者微生態的特點，為慢阻肺急性加重的早期診療及預后判斷提供新的理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
橫斷面選取從 2017 年 1 月至 2017 年 12 月在廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科住院的慢阻肺急性加重患者共 142 例，其中 34 例不同意入組，18 例患者在住院時死亡，22 例患者合并其他慢性肺部疾病，13 例患者無法完成誘導痰檢查，最后入組患者為 55 例，歸為慢阻肺急性加重組。對照組為同期在門診就診的穩定期慢阻肺患者 115 例，其中 21 例不同意入組，19 例合并其他慢性肺部疾病，13 例患者無法完成誘導痰檢查，最終入組 45 例，歸為慢阻肺穩定期組。入組患者納入標準：均符合慢阻肺的診斷標準[7]；慢阻肺急性加重定義為慢阻肺患者發生急性加重需要改變原有治療方案；所有患者的第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）/用力肺活量（FVC）<70%。排除標準：排除急性肺水腫、急性肺栓塞、急性心力衰竭、心律不齊等心肺疾病；排除合并腫瘤、自身免疫性疾病等；排除合并支氣管哮喘、肺結核、間質性肺病等慢性肺部疾病者。所有患者均簽署知情同意書。本研究已經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理審查委員會審查批準［倫理審批編號：2017（KY-E-024）］。
1.2 方法
1.2.1 誘導痰采集與制備
慢阻肺急性加重組患者在住院的第 1 天獲取誘導痰，慢阻肺穩定期組患者囑其在門診隨診時獲取誘導痰。誘導痰的方法是根據 Pin 等[8]的改良方法，使用 3%～5% 的氯化鈉霧化液氧氣驅動霧化進行誘導痰處理，霧化時調整氧流量為 6～8 L/min，霧化時間約 10～15 min。誘導痰前讓患者使用生理鹽水徹底漱口，并吞咽適量生理鹽水，清除口鼻腔分泌物。霧化結束后，使用無菌容器收集誘導痰，并在 1 h 內迅速置于–80 ℃ 冰箱中備用。取其中一部分痰液做痰涂片鏡檢，并使用吉姆薩染色。觀察每低倍鏡視野鱗狀上皮細胞數目，若鱗狀上皮細胞>20% 則視為不合格標本。最后標本統一送至北京百邁客公司進行誘導痰 16S rRNA 檢測。
1.2.2 誘導痰 DNA 提取、文庫構建及測序分析
首先根據 DNA 操作手冊步驟使用 DNA Isolation Kit（美國 Mobio 公司）提取誘導痰樣本 DNA。然后使用 PCR 擴增試劑盒（TOYOBO 公司）結合引物 338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'來擴增 16S rDNA 基因 V3-V4 特異性基因片段。隨后使用 1.8% 瓊脂糖凝膠對 PCR 產物片段進行篩選。檢測合格的產物在 Hiseq 2500 平臺（美國 Illumina 公司）上進行文庫構建及基因測序。測序得到的下機數（Raw Data）用于生物信息學分析。利用 FLASH 軟件（version 1.2.11）對原始數據進行拼接，將拼接得到的序列用 Trimmomatic 軟件（version 0.33）進行質量過濾，然后使用 UCHIME 軟件（version8.1）去嵌合體，得到高質量的序列標簽。隨后使用 USEARCH 軟件（version 10.0）將上述序列標簽在相似性 97% 的水平上對有效序列進行聚類，得到一個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。最后使用核糖體數據庫項目軟件（RDP 軟件，version2.2）將 OTU 的代表序列比對到細菌 Silva 數據庫[9]，通過比對，獲得門、綱、目、科、屬、種不同水平的樣本分類信息。通過 alpha 多樣性分析、beta 多樣性分析和 LefSe 差異分析揭示慢阻肺急性加重患者誘導痰的微生態特點。
1.2.3 觀察資料
包括一般臨床資料如性別，年齡，吸煙史，既往史，應用藥物史，身高、體重［用于計算體重指數（body mass index，BMI）=體重/身高2（kg/m2）］。另外，所有受試者均于清晨 7 點至 9 點抽取外周血，一部分送至本院檢驗科完成血常規及超敏 C 反應蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP）檢查；另一部分在廣西醫科大學科研中心使用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定炎癥介質：白細胞介素-8（interleukin，IL-8）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），ELISA 試劑盒由武漢華美公司提供。所有慢阻肺急性加重患者的肺功能均在患者處于穩定期時檢查。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 軟件對數據進行基本統計學分析，采用 GraphPad Prism6 和 R 語言軟件包進行圖表的制作。首先對計量資料，若資料符合正態分布且方差齊時，兩組間比較采用獨立樣本采用 t 檢驗，方差不齊時采用 t’檢驗；若不符合正態分布，則采用獨立樣本的 Mann-Whitney U 秩和檢驗。計數資料組間比較采用 Pearson χ2 檢驗。相關性分析采用 Spearman 秩相關系數進行。P<0.05 為差異有統計學意義。生物信息學分析采用 R 語言包進行分析。使用廣義 UniFrac 距離進行微生物群落結構分析，多變量方差分析（PERMANOVA，函數 adonis）進行比較。應用主坐標分析（PCoA）圖來顯示組間的 Unifrac 距離，距離算法采用 binary-jaccard 算法。使用 LEfSe 獲得組間的差異性物種。在本研究中，使用的 LDA 評分閾值> 4.0。
2 結果
2.1 一般臨床資料
慢阻肺急性加重組共 55 例，男 41 例，女 14 例，平均年齡（69.8±5.5）歲；穩定期慢阻肺組共 45 例，男 37 例，女 8 例，平均年齡（67.4±7.4）歲。兩組在年齡、性別、BMI、肺功能、慢性阻塞性肺疾病全球創議（GOLD）分級、長期家庭氧療和合并癥等方面差異無統計學意義（均 P>0.05）。慢阻肺急性加重組的白細胞計數、中性粒細胞百分比較慢阻肺穩定期組高，差異有統計學意義（均 P<0.001）。結果見表 1。
表1
入組患者的一般臨床特征［例（%）］
2.2 Alpha 多樣性分析
慢阻肺急性加重組誘導痰 Shannon 指數低于慢阻肺穩定期組（2.27±0.66 比 2.88±0.72，P<0.001），提示慢阻肺急性加重組誘導痰微生態多樣性小于慢阻肺穩定期組（圖 1a）。慢阻肺急性加重組誘導痰 Ace 指數高于慢阻肺穩定期組（222.66±59.49 比 196.60±54.18，P=0.024），提示慢阻肺急性加重組菌群豐度高于慢阻肺穩定期組（圖 1b）。
圖1
慢阻肺急性加重組與慢阻肺穩定期組 Alpha 多樣性指數比較
a.Shannon 指數比較；b.Ace 指數比較
2.3 Beta 多樣性分析
PCoA 分析提示慢阻肺急性加重組的誘導痰菌群結構與穩定期慢阻肺組存在差異（PERMANOVA，R2=0.15，P=0.001），PC1 貢獻率為 22.12%，PC2 貢獻率為 11.93%。結果見圖 2。
圖2
兩組基于未加權 UniFrac 距離的 PcoA 分析
PC1 貢獻率為 22.12%，PC2 貢獻率為 11.93%
2.4 誘導痰菌群構成
所有患者排在前 5 位的菌門為：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和梭桿菌門（Fusobacteria）。慢阻肺急性加重組變形菌門構成比較慢阻肺穩定期組高，差異有統計學意義（t=4.46，P<0.001）；慢阻肺穩定期組的擬桿菌門構成比較慢阻肺急性加重組高，但差異無統計學意義（t=–1.77，P=0.079），結果見圖 3a。在菌屬水平上，慢阻肺急性加重組的 Streptococcus 和 Prevotella_7 構成比較慢阻肺穩定期組低，而 Nesisseria 和 Staphylococcus 構成比較慢阻肺穩定期組增高，差異有統計學意義（P<0.05），結果見圖 3b。
圖3
兩組誘導痰微生態物種分布柱狀圖
a.門水平物種分布柱狀圖；b.屬水平物種分布柱狀圖
2.5 LefSe 差異性分析
通過 LefSe 差異性分析共分析出 20 種不同分類水平的細菌。其中在門水平，慢阻肺急性加重組變形菌門相對豐度升高；在屬水平，慢阻肺急性加重組 Lautropia 相對豐度與慢阻肺穩定期組相比升高，而 Streptococcus、Capnocytophaga、Prevotella-7 和 Alloprevotella 的相對豐度與慢阻肺穩定期組相比降低（圖 4a）。圖 4b 為進化分支圖，其中以不同顏色顯示了兩組間生物標志物的豐度差異。
圖4
兩組 LefSe 差異性分析圖
a.兩組顯著差異物種柱狀圖；b. 兩組顯著差異物種進化分支圖
2.6 慢阻肺急性加重組 Alpha 多樣性指數與臨床相關指標的關系
慢阻肺急性加重組患者誘導痰的 Shannon 指數與 hs-CRP、IL-8、TNF-α、GOLD 分級呈負相關（r 值分別為–0.31、0.29、–0.30、–0.44，均 P<0.05），提示誘導痰微生態多樣性與炎癥因子水平及病情分級呈負相關。Ace 指數與上述指標無相關性，提示菌群豐度與炎癥因子及病情分級無明顯相關性。但是，Alpha 多樣性指數與慢阻肺急性加重患者年齡、肺功能和 BMI 無明顯相關。結果見表 2。
表2
Alpha 多樣性指數與臨床相關指標的關系
3 討論
本研究通過橫斷面觀察，使用 16S rRNA 高通量測序方法分析了慢阻肺急性加重患者與慢阻肺穩定期患者誘導痰微生態的特點，同時分析了慢阻肺急性加重患者誘導痰微生態多樣性與相關臨床指標及炎癥因子的關系。研究發現慢阻肺急性加重患者誘導痰的微生態多樣性較慢阻肺穩定期患者降低，且與血清炎癥因子水平及 GOLD 分級呈負相關。另外，慢阻肺急性加重患者誘導痰的菌群構成與慢阻肺穩定期患者相比也存在差異，提示慢阻肺急性加重患者的氣道微生態紊亂。
微生物組由 Lederberg[10]提出，指在人體內特定微環境中共生、共棲、致病的微生物遺傳信息的總和。人類微生物組作為人類基因的一部分，可以為人類宿主細胞提供獨特的代謝功能，并能夠提供刺激人類細胞代謝的微環境[11]。基于傳統標準培養技術的研究認為健康人下呼吸道是無菌的，直到 Hilty 等[12]通過基因測序技術才證實下呼吸道也存在細菌微生態。氣道微生態在局部氣道環境的免疫、黏膜屏障功能修復等方面也發揮著重要的作用[13-14]。慢阻肺的主要病理特征是慢性氣道炎癥，而氣道微生態的長期定植與反復感染是氣道結構重塑與免疫失調的主要機制[15-16]，因此迫切需要了解慢阻肺急性加重患者氣道微生態的特點，從而為臨床診療及病情判斷提供理論依據。
慢阻肺患者的氣道微生態受病情嚴重程度、吸煙狀態、用藥、宿主異質性、局部微環境、解剖結構、標本來源等多方面的影響[17]。盡管目前認為肺組織是研究氣道微生態的首選標本，但由于肺組織標本難以獲取，而且還有研究發現下呼吸道菌群結構是上呼吸道菌群的一種延續，兩者的差異在生物量上、而菌群構成大體一致[18]，因此選擇誘導痰作為研究樣本。本研究發現與慢阻肺穩定期組患者相比，慢阻肺急性加重組患者的氣道微生態多樣性明顯下降，這與外國學者的研究結果類似[19-20]。另外，我們分析了慢阻肺急性加重組患者氣道微生態多樣性與相關臨床指標及炎癥因子的關系，慢阻肺急性加重患者氣道微生態多樣性下降與病情分級及炎癥因子呈負相關。Galiana 等[21]發現與輕中度慢阻肺相比，重度慢阻肺的痰微生態多樣性下降。Pragman 等[22]認為上呼吸道菌群微生態多樣性的下降容易導致慢阻肺急性加重。因此，微生態多樣性可能是慢阻肺患者病情加重的生物學指標。
Millares 等[15]基于傳統培養方法發現慢阻肺穩定期下呼吸道存在常見定植菌包括流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌等。由于傳統培養方法技術的局限性，因此我們無法了解慢阻肺患者氣道內的絕大多數微生態的特點，而高通量測序技術可以觀察氣道微生態全部菌群的變化特點。本研究發現常見的菌門包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門，這與國外的研究一致[1, 21-22]。同時，我們發現變形菌門的比例在慢阻肺急性加重組明顯升高。Wang 等[19]也發現慢阻肺急性加重時，變形菌門所占比例上升。還有學者發現哮喘患者與非哮喘人群相比也伴隨變形菌門構成及豐度的明顯升高[12, 23]。這可能與變形菌門中包含流感嗜血桿菌屬、卡他莫拉菌屬、銅綠假單胞菌屬等常見致病菌有關。
另外，我們發現慢阻肺急性加重組氣道微生態的菌群豐度較慢阻肺穩定期組相比升高。菌群豐度代表菌群細菌的拷貝數量，提示慢阻肺急性加重時伴隨著菌群的明顯富集。但也有報道未發現慢阻肺急性加重時與穩定時間菌群豐度的變化。Huang 等[24]縱向觀察了慢阻肺患者急性發作前后的氣道微生態，發現穩定期慢阻肺患者中微生物組基本保持穩定，隨著慢阻肺急性加重的進展，菌群豐富度、均勻度和多樣性沒有變化，而隨著變形菌門的增加和放線菌門、梭菌綱和擬桿菌門的減少，分類組成發生了顯著變化；變形菌門中流感嗜血桿菌屬隨著病情加重逐漸增加，與之在系統發育樹中密切相關的細菌菌落也得到了豐富，在系統發育樹中遙遠的分類群下降，這表明微生物組動態和與主要病原體密切相關的分類群的富集可能導致惡化發病機制。本研究通過 LefSe 差異性分析，發現慢阻肺急性加重組中相對富集的菌門為變形菌門、菌屬為 Lautropia。不同研究存在的菌群種類的差異可能與標本來源、種族異質性等相關。
綜上所述，氣道微生態在慢阻肺急性加重的發生發展中發揮重要的作用。慢阻肺急性加重患者的氣道微生態伴隨著多樣性下降以及菌群豐度的升高，其中氣道微生態多樣性還與臨床 GOLD 分級及炎癥介質密切相關。本研究還有需要改進的地方，首先標本可以選擇更符合氣道環境的標本；其次，我們只是對比了橫向的微生態的特點，以后可以動態觀察整個病程中微生態的變化特點；第三，由于 16S rRNA 技術只能精確到屬水平，若了解種水平菌群的變化，可以考慮使用宏基因組學方法。因此，臨床中急需大樣本、多中心的相關臨床研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種以慢性進行性的不可逆氣流受限為特點的阻塞性氣道疾病[1]。慢阻肺患者因呼吸道癥狀的突然加重而導致需要額外的治療，稱為慢阻肺急性加重[2]。慢阻肺急性加重可促進肺功能進行性惡化，是患者生活質量下降以及高死亡率主要原因[3]。慢阻肺急性加重發病的主要原因是細菌或病毒感染，50% 以上的慢阻肺急性加重是由于細菌或病毒感染引起的[4]。細菌感染或細菌長期定植在慢阻肺急性加重的發生中發揮著重要的作用[5]。既往研究慢阻肺急性加重的致病菌一般依靠細菌培養的方法，因此人們對于病原菌的認識通常局限在常見病原體上[6]。隨著高通量測序等生物信息學技術的發展，人們可以從整體水平認識氣道微生態的特點。本研究通過橫斷面調查住院患者慢阻肺急性加重的誘導痰，使用 16S rRNA 高通量測序技術測定誘導痰的微生態多樣性，分析慢阻肺急性加重患者微生態的特點，為慢阻肺急性加重的早期診療及預后判斷提供新的理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
橫斷面選取從 2017 年 1 月至 2017 年 12 月在廣西醫科大學第一附屬醫院呼吸與危重癥醫學科住院的慢阻肺急性加重患者共 142 例，其中 34 例不同意入組，18 例患者在住院時死亡，22 例患者合并其他慢性肺部疾病，13 例患者無法完成誘導痰檢查，最后入組患者為 55 例，歸為慢阻肺急性加重組。對照組為同期在門診就診的穩定期慢阻肺患者 115 例，其中 21 例不同意入組，19 例合并其他慢性肺部疾病，13 例患者無法完成誘導痰檢查，最終入組 45 例，歸為慢阻肺穩定期組。入組患者納入標準：均符合慢阻肺的診斷標準[7]；慢阻肺急性加重定義為慢阻肺患者發生急性加重需要改變原有治療方案；所有患者的第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）/用力肺活量（FVC）<70%。排除標準：排除急性肺水腫、急性肺栓塞、急性心力衰竭、心律不齊等心肺疾病；排除合并腫瘤、自身免疫性疾病等；排除合并支氣管哮喘、肺結核、間質性肺病等慢性肺部疾病者。所有患者均簽署知情同意書。本研究已經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理審查委員會審查批準［倫理審批編號：2017（KY-E-024）］。
1.2 方法
1.2.1 誘導痰采集與制備
慢阻肺急性加重組患者在住院的第 1 天獲取誘導痰，慢阻肺穩定期組患者囑其在門診隨診時獲取誘導痰。誘導痰的方法是根據 Pin 等[8]的改良方法，使用 3%～5% 的氯化鈉霧化液氧氣驅動霧化進行誘導痰處理，霧化時調整氧流量為 6～8 L/min，霧化時間約 10～15 min。誘導痰前讓患者使用生理鹽水徹底漱口，并吞咽適量生理鹽水，清除口鼻腔分泌物。霧化結束后，使用無菌容器收集誘導痰，并在 1 h 內迅速置于–80 ℃ 冰箱中備用。取其中一部分痰液做痰涂片鏡檢，并使用吉姆薩染色。觀察每低倍鏡視野鱗狀上皮細胞數目，若鱗狀上皮細胞>20% 則視為不合格標本。最后標本統一送至北京百邁客公司進行誘導痰 16S rRNA 檢測。
1.2.2 誘導痰 DNA 提取、文庫構建及測序分析
首先根據 DNA 操作手冊步驟使用 DNA Isolation Kit（美國 Mobio 公司）提取誘導痰樣本 DNA。然后使用 PCR 擴增試劑盒（TOYOBO 公司）結合引物 338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'來擴增 16S rDNA 基因 V3-V4 特異性基因片段。隨后使用 1.8% 瓊脂糖凝膠對 PCR 產物片段進行篩選。檢測合格的產物在 Hiseq 2500 平臺（美國 Illumina 公司）上進行文庫構建及基因測序。測序得到的下機數（Raw Data）用于生物信息學分析。利用 FLASH 軟件（version 1.2.11）對原始數據進行拼接，將拼接得到的序列用 Trimmomatic 軟件（version 0.33）進行質量過濾，然后使用 UCHIME 軟件（version8.1）去嵌合體，得到高質量的序列標簽。隨后使用 USEARCH 軟件（version 10.0）將上述序列標簽在相似性 97% 的水平上對有效序列進行聚類，得到一個操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。最后使用核糖體數據庫項目軟件（RDP 軟件，version2.2）將 OTU 的代表序列比對到細菌 Silva 數據庫[9]，通過比對，獲得門、綱、目、科、屬、種不同水平的樣本分類信息。通過 alpha 多樣性分析、beta 多樣性分析和 LefSe 差異分析揭示慢阻肺急性加重患者誘導痰的微生態特點。
1.2.3 觀察資料
包括一般臨床資料如性別，年齡，吸煙史，既往史，應用藥物史，身高、體重［用于計算體重指數（body mass index，BMI）=體重/身高2（kg/m2）］。另外，所有受試者均于清晨 7 點至 9 點抽取外周血，一部分送至本院檢驗科完成血常規及超敏 C 反應蛋白（hypersensitive C reactive protein，hs-CRP）檢查；另一部分在廣西醫科大學科研中心使用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定炎癥介質：白細胞介素-8（interleukin，IL-8）及腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），ELISA 試劑盒由武漢華美公司提供。所有慢阻肺急性加重患者的肺功能均在患者處于穩定期時檢查。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 軟件對數據進行基本統計學分析，采用 GraphPad Prism6 和 R 語言軟件包進行圖表的制作。首先對計量資料，若資料符合正態分布且方差齊時，兩組間比較采用獨立樣本采用 t 檢驗，方差不齊時采用 t’檢驗；若不符合正態分布，則采用獨立樣本的 Mann-Whitney U 秩和檢驗。計數資料組間比較采用 Pearson χ2 檢驗。相關性分析采用 Spearman 秩相關系數進行。P<0.05 為差異有統計學意義。生物信息學分析采用 R 語言包進行分析。使用廣義 UniFrac 距離進行微生物群落結構分析，多變量方差分析（PERMANOVA，函數 adonis）進行比較。應用主坐標分析（PCoA）圖來顯示組間的 Unifrac 距離，距離算法采用 binary-jaccard 算法。使用 LEfSe 獲得組間的差異性物種。在本研究中，使用的 LDA 評分閾值> 4.0。
2 結果
2.1 一般臨床資料
慢阻肺急性加重組共 55 例，男 41 例，女 14 例，平均年齡（69.8±5.5）歲；穩定期慢阻肺組共 45 例，男 37 例，女 8 例，平均年齡（67.4±7.4）歲。兩組在年齡、性別、BMI、肺功能、慢性阻塞性肺疾病全球創議（GOLD）分級、長期家庭氧療和合并癥等方面差異無統計學意義（均 P>0.05）。慢阻肺急性加重組的白細胞計數、中性粒細胞百分比較慢阻肺穩定期組高，差異有統計學意義（均 P<0.001）。結果見表 1。
表1
入組患者的一般臨床特征［例（%）］
2.2 Alpha 多樣性分析
慢阻肺急性加重組誘導痰 Shannon 指數低于慢阻肺穩定期組（2.27±0.66 比 2.88±0.72，P<0.001），提示慢阻肺急性加重組誘導痰微生態多樣性小于慢阻肺穩定期組（圖 1a）。慢阻肺急性加重組誘導痰 Ace 指數高于慢阻肺穩定期組（222.66±59.49 比 196.60±54.18，P=0.024），提示慢阻肺急性加重組菌群豐度高于慢阻肺穩定期組（圖 1b）。
圖1
慢阻肺急性加重組與慢阻肺穩定期組 Alpha 多樣性指數比較
a.Shannon 指數比較；b.Ace 指數比較
2.3 Beta 多樣性分析
PCoA 分析提示慢阻肺急性加重組的誘導痰菌群結構與穩定期慢阻肺組存在差異（PERMANOVA，R2=0.15，P=0.001），PC1 貢獻率為 22.12%，PC2 貢獻率為 11.93%。結果見圖 2。
圖2
兩組基于未加權 UniFrac 距離的 PcoA 分析
PC1 貢獻率為 22.12%，PC2 貢獻率為 11.93%
2.4 誘導痰菌群構成
所有患者排在前 5 位的菌門為：厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和梭桿菌門（Fusobacteria）。慢阻肺急性加重組變形菌門構成比較慢阻肺穩定期組高，差異有統計學意義（t=4.46，P<0.001）；慢阻肺穩定期組的擬桿菌門構成比較慢阻肺急性加重組高，但差異無統計學意義（t=–1.77，P=0.079），結果見圖 3a。在菌屬水平上，慢阻肺急性加重組的 Streptococcus 和 Prevotella_7 構成比較慢阻肺穩定期組低，而 Nesisseria 和 Staphylococcus 構成比較慢阻肺穩定期組增高，差異有統計學意義（P<0.05），結果見圖 3b。
圖3
兩組誘導痰微生態物種分布柱狀圖
a.門水平物種分布柱狀圖；b.屬水平物種分布柱狀圖
2.5 LefSe 差異性分析
通過 LefSe 差異性分析共分析出 20 種不同分類水平的細菌。其中在門水平，慢阻肺急性加重組變形菌門相對豐度升高；在屬水平，慢阻肺急性加重組 Lautropia 相對豐度與慢阻肺穩定期組相比升高，而 Streptococcus、Capnocytophaga、Prevotella-7 和 Alloprevotella 的相對豐度與慢阻肺穩定期組相比降低（圖 4a）。圖 4b 為進化分支圖，其中以不同顏色顯示了兩組間生物標志物的豐度差異。
圖4
兩組 LefSe 差異性分析圖
a.兩組顯著差異物種柱狀圖；b. 兩組顯著差異物種進化分支圖
2.6 慢阻肺急性加重組 Alpha 多樣性指數與臨床相關指標的關系
慢阻肺急性加重組患者誘導痰的 Shannon 指數與 hs-CRP、IL-8、TNF-α、GOLD 分級呈負相關（r 值分別為–0.31、0.29、–0.30、–0.44，均 P<0.05），提示誘導痰微生態多樣性與炎癥因子水平及病情分級呈負相關。Ace 指數與上述指標無相關性，提示菌群豐度與炎癥因子及病情分級無明顯相關性。但是，Alpha 多樣性指數與慢阻肺急性加重患者年齡、肺功能和 BMI 無明顯相關。結果見表 2。
表2
Alpha 多樣性指數與臨床相關指標的關系
3 討論
本研究通過橫斷面觀察，使用 16S rRNA 高通量測序方法分析了慢阻肺急性加重患者與慢阻肺穩定期患者誘導痰微生態的特點，同時分析了慢阻肺急性加重患者誘導痰微生態多樣性與相關臨床指標及炎癥因子的關系。研究發現慢阻肺急性加重患者誘導痰的微生態多樣性較慢阻肺穩定期患者降低，且與血清炎癥因子水平及 GOLD 分級呈負相關。另外，慢阻肺急性加重患者誘導痰的菌群構成與慢阻肺穩定期患者相比也存在差異，提示慢阻肺急性加重患者的氣道微生態紊亂。
微生物組由 Lederberg[10]提出，指在人體內特定微環境中共生、共棲、致病的微生物遺傳信息的總和。人類微生物組作為人類基因的一部分，可以為人類宿主細胞提供獨特的代謝功能，并能夠提供刺激人類細胞代謝的微環境[11]。基于傳統標準培養技術的研究認為健康人下呼吸道是無菌的，直到 Hilty 等[12]通過基因測序技術才證實下呼吸道也存在細菌微生態。氣道微生態在局部氣道環境的免疫、黏膜屏障功能修復等方面也發揮著重要的作用[13-14]。慢阻肺的主要病理特征是慢性氣道炎癥，而氣道微生態的長期定植與反復感染是氣道結構重塑與免疫失調的主要機制[15-16]，因此迫切需要了解慢阻肺急性加重患者氣道微生態的特點，從而為臨床診療及病情判斷提供理論依據。
慢阻肺患者的氣道微生態受病情嚴重程度、吸煙狀態、用藥、宿主異質性、局部微環境、解剖結構、標本來源等多方面的影響[17]。盡管目前認為肺組織是研究氣道微生態的首選標本，但由于肺組織標本難以獲取，而且還有研究發現下呼吸道菌群結構是上呼吸道菌群的一種延續，兩者的差異在生物量上、而菌群構成大體一致[18]，因此選擇誘導痰作為研究樣本。本研究發現與慢阻肺穩定期組患者相比，慢阻肺急性加重組患者的氣道微生態多樣性明顯下降，這與外國學者的研究結果類似[19-20]。另外，我們分析了慢阻肺急性加重組患者氣道微生態多樣性與相關臨床指標及炎癥因子的關系，慢阻肺急性加重患者氣道微生態多樣性下降與病情分級及炎癥因子呈負相關。Galiana 等[21]發現與輕中度慢阻肺相比，重度慢阻肺的痰微生態多樣性下降。Pragman 等[22]認為上呼吸道菌群微生態多樣性的下降容易導致慢阻肺急性加重。因此，微生態多樣性可能是慢阻肺患者病情加重的生物學指標。
Millares 等[15]基于傳統培養方法發現慢阻肺穩定期下呼吸道存在常見定植菌包括流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、肺炎鏈球菌和銅綠假單胞菌等。由于傳統培養方法技術的局限性，因此我們無法了解慢阻肺患者氣道內的絕大多數微生態的特點，而高通量測序技術可以觀察氣道微生態全部菌群的變化特點。本研究發現常見的菌門包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門和梭桿菌門，這與國外的研究一致[1, 21-22]。同時，我們發現變形菌門的比例在慢阻肺急性加重組明顯升高。Wang 等[19]也發現慢阻肺急性加重時，變形菌門所占比例上升。還有學者發現哮喘患者與非哮喘人群相比也伴隨變形菌門構成及豐度的明顯升高[12, 23]。這可能與變形菌門中包含流感嗜血桿菌屬、卡他莫拉菌屬、銅綠假單胞菌屬等常見致病菌有關。
另外，我們發現慢阻肺急性加重組氣道微生態的菌群豐度較慢阻肺穩定期組相比升高。菌群豐度代表菌群細菌的拷貝數量，提示慢阻肺急性加重時伴隨著菌群的明顯富集。但也有報道未發現慢阻肺急性加重時與穩定時間菌群豐度的變化。Huang 等[24]縱向觀察了慢阻肺患者急性發作前后的氣道微生態，發現穩定期慢阻肺患者中微生物組基本保持穩定，隨著慢阻肺急性加重的進展，菌群豐富度、均勻度和多樣性沒有變化，而隨著變形菌門的增加和放線菌門、梭菌綱和擬桿菌門的減少，分類組成發生了顯著變化；變形菌門中流感嗜血桿菌屬隨著病情加重逐漸增加，與之在系統發育樹中密切相關的細菌菌落也得到了豐富，在系統發育樹中遙遠的分類群下降，這表明微生物組動態和與主要病原體密切相關的分類群的富集可能導致惡化發病機制。本研究通過 LefSe 差異性分析，發現慢阻肺急性加重組中相對富集的菌門為變形菌門、菌屬為 Lautropia。不同研究存在的菌群種類的差異可能與標本來源、種族異質性等相關。
綜上所述，氣道微生態在慢阻肺急性加重的發生發展中發揮重要的作用。慢阻肺急性加重患者的氣道微生態伴隨著多樣性下降以及菌群豐度的升高，其中氣道微生態多樣性還與臨床 GOLD 分級及炎癥介質密切相關。本研究還有需要改進的地方，首先標本可以選擇更符合氣道環境的標本；其次，我們只是對比了橫向的微生態的特點，以后可以動態觀察整個病程中微生態的變化特點；第三，由于 16S rRNA 技術只能精確到屬水平，若了解種水平菌群的變化，可以考慮使用宏基因組學方法。因此，臨床中急需大樣本、多中心的相關臨床研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
