引用本文： 王云, 袁樂永, 王梅芳, 孟忠吉, 段敬柱, 杜士明, 唐以軍. IRGM 基因多態性與塵肺易感性研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(4): 366-370. doi: 10.7507/1671-6205.201907029 復制
塵肺是在生產過程中由于長時間吸入工作環境中的粉塵顆粒而引起的一種危害嚴重的職業病，表現為肺間質中成纖維細胞大量增殖以及細胞外基質膠原蛋白成分異常聚集[1-2]。免疫相關鳥苷三磷酸酶 M（immunity related GTPase M，IRGM）基因通過誘導細胞自噬調節機體免疫功能，可作為觸發器啟動連鎖免疫反應，進而吞噬、消化外來有害物質，在細胞自噬性程序性死亡過程中起重要作用[3]。IRGM 基因多態性可能會影響自噬相關蛋白的表達，從而影響細胞自噬的反應性，而自噬和肺部纖維化的發生發展過程有密切關系。目前國內外對 IRGM 基因多態性位點與結核病、克羅恩病關系均有相關的研究，但關于 IRGM 基因多態性是否與塵肺有關尚未見報道。因此，探索自噬相關基因 IRGM 基因多態性是否與塵肺發病過程有關將有助于闡明塵肺的發病機制，為塵肺的防治提供新的策略。
1 資料與方法
1.1 一般資料
研究對象分別來自 2016 年 6 月到 2018 年 12 月在湖北醫藥學院附屬太和醫院、十堰市職業病防治院就診的鄂西北地區金礦、鐵礦、煤礦的接塵工人，均為無血緣關系的漢族人。本次研究符合道德倫理并經湖北醫藥學院附屬太和醫院倫理委員會同意，全部研究對象簽訂知情同意書。病例組：根據我國最新塵肺病診斷標準（GBZ70-2015），確診的塵肺患者作為病例組，一共有 248 例；對照組：以同性別、同民族、同一礦區、開始接塵時間和累積接塵工齡相近經證實未患塵肺的接塵工人為對照組，共 275 例。
1.2 方法
1.2.1 一般情況調查
采用自行設計的塵肺調查表對病例組和對照組進行調查，收集調查對象的基本資料，包括個人一般情況、疾病史、職業暴露史、吸煙史，以及塵肺患病情況等。按照世界衛生組織標準，連續或累積吸煙 6 個月或以上者為吸煙。
1.2.2 單核苷酸多態性位點的選擇
利用 Haploview（version 4.0）軟件，根據標簽單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）的挑選標準，采用 Tagger 軟件選擇 MAF≥0.05 的 SNP 位點；從 NCBI 及 HapMap 數據庫中查找中國人群 IRGM 啟動子區 SNP 及相關信息，并利用 Genetool 工具在 IRGM 基因上定位，篩選出中國人群 IRGM 啟動子區 SNP。
1.2.3 基因型檢測
采集靜脈血 2 mL，采用 DNA 提取試劑盒提取 DNA，采用 TAKARA 公司 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 試劑盒對提取的 DNA 進行 PCR 擴增，對所有 PCR 產物純化并進行 Sanger 測序對所有 PCR 產物進行純化并測序，測序引物為 PCR 擴增上游引物，測序結果與 GeneBank 進行比對。
1.3 統計學方法
用 Excel 建立數據庫，采用 SPSS 18.0 統計軟件。連續變量的比較用 t 檢驗，分類變量用 χ2 檢驗。對照組基因型用 χ2 擬合優度檢驗判斷其是否符合 Hardy-Weinberg 平衡。不同基因型在兩組人群及各亞組中的比較用 χ 2 檢驗。應用 SNPstats 軟件分析單個 SNP 和塵肺的相關性，應用在線軟件 SHEsis 進行各個位點的連鎖不平衡分析和單體型分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病例組和對照組一般情況
病例組和對照組之間年齡、性別、工齡及吸煙史分布均衡，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
研究對象的一般情況
2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗
應用 Hardy-Weinberg 遺傳平衡吻合度檢驗方法，分析對照組人群 IRGM 基因型遺傳平衡情況，結果表明各位點的對照組數據差異無統計學意義（均 P>0.05），說明此次研究所選的樣本具有較好的人群代表性。結果見表 2。
表2
IRGM 三個多態位點 Hardy-Weinberg 平衡檢驗結果
2.3 病例組與對照組 IRGM 基因型及等位基因分布情況
IRGM 基因 rs4958842、rs4958843、rs4958846 三個位點的測序圖譜見圖 1。表 3 展示了 IRGM 各位點基因型的分布情況。其中，rs4958842 位點的 AA、AG、GG 三種基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布差異均無統計學意義（P>0.05）；rs4958843 位點的 CC、CT、TT 三種基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布差異也無統計學意義（P>0.05）；rs4958846 位點的 TT、TC、CC 三種基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布差異有統計學意義（P<0.001），病例組中 TT 基因型的頻率為 76.6%，顯著高于對照組的 41.7%，而 TC、CC 基因型在對照組的頻率分別為 41.8%、17.5%，顯著高于病例組的 17.7%、5.6%。rs4958846 位點等位基因 T 和 C 在病例組的分布頻率分別為 85.5%、14.5%，在對照組的分布頻率為 61.6%、38.4%，差異有統計學意義（表 4）。
圖1
各位點不同基因型測序圖
表3
塵肺組與對照組 IRGM 各位點基因型分布比較
表4
塵肺組與對照組 IRGM 各位點等位基因分布比較
2.4 連鎖不平衡和單體型分析
利用在線軟件 SHEsis 分析基因之間的連鎖不平衡 D'值和 r2 值，分析結果表明，IRGM 的三個基因位點 rs4958842、rs4958843、rs4958846 兩兩之間均存在連鎖不平衡（D'>0.7，r2>0.3），說明三個位點遺傳有關聯性。結果見表 5。
表5
IRGM 基因位點之間連鎖不平衡的 D'和 r2 值
采用軟件 SHEsis 進一步分析單體型，IRGM 基因位點構建 4 個單體型，各個單體型在病例組和對照組的分布情況見表 6。結果顯示 4 種單體型中，ACT 單體型在病例組頻率分布明顯高于對照組，而 ACC 單體型在病例組的頻率分布明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），所構建的其他單體型在病例組和對照組中的分布差異無統計學意義（P>0.05）。
表6
IRGM 的 4 種單體型在病例組和對照組的分布頻率
3 討論
塵肺的發生是環境因素與個體因素綜合作用的結果，因此即使在相同的暴露情況下，不同個體的反應也會有很大不同，有些人發病，有些人不發病。即使同為塵肺患者也會存在嚴重程度的差異，除了年齡、性別、營養狀況、生化代謝差異以及是否患有結核和其他呼吸道疾病等因素對粉塵易感性存在影響外，遺傳因素特別是基因的變異可能是造成個體對粉塵易感性差異的重要因素之一[4-5]。因此探討塵肺的易感基因，篩選易感的高危人群，對塵肺的防治具有重要意義。
自噬在清除外來物質、自身細胞碎片、細胞器方面有重要作用[6]。有研究表明，塵粒沉積可引起巨噬細胞的自噬功能增強[7]。自噬對沉積物的清除功能漸漸受到關注，研究發現不同期別煤工塵肺患者的自噬活動強弱不同[8-9]，提示在游離 SiO2 粉塵刺激下，細胞除了經典的細胞凋亡反應之外，自噬和肺部纖維化的發生發展過程有密切聯系。IRGM 基因通過調節自噬來清除胞內病原體，從而在自身免疫反應中起重要作用[10-11]。IRGM 基因多態性可能會影響自噬相關蛋白的表達，從而影響細胞自噬的反應性。伊朗學者發現 IRGM 啟動子區–1161T/C 與–947T/C 位點與結核病易感性有關[12]；還有學者發現 IRGM 基因的 rs13361189、rs4958847 位點與歐美白種人的克羅恩病易感性有顯著相關[13-14]。目前關于 IRGM 基因多態性是否與塵肺發生有關尚未見報道。此次研究我們選擇 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位點，分別研究三個位點與塵肺易感性的關系，對三個位點進行連鎖不平衡分析并構建單體型，探討所構單體型與塵肺易感性的關系。
本研究入選了 248 例塵肺患者為病例組，未患塵肺的 275 例接塵工人為對照組。兩組在年齡、性別、吸煙情況、累計接塵工齡的差異均沒有統計學意義，說明入組樣本均衡可比。并且 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位點在對照組的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，進一步說明所選樣本具有較好的群體代表性。目前在中國人群中對 IRGM 基因多態性的探索只有來自中國北京學者的研究，他們發現 IRGM 的 rs4958842 位點與結核病易感性有關[15]。本次研究發現 IRGM 的 rs4958846 位點與塵肺的易感性相關，而 rs4958842、rs4958843 位點與塵肺的易感性沒有關聯。我們推測可能是由于 rs4958846 位點的突變，導致 IRGM 蛋白水平的降低，影響了 IRGM 對細胞自噬的調節，使機體對沉積物的清除能力減弱，所以此種人群更容易發生塵肺。rs4958846 基因位點 TT 基因型在塵肺組的頻率高于對照組，而 TC 和 CC 基因型在對照組中的頻率高于病例組，等位基因 T 和 C 在病例組和對照組的頻率分布也有差異。以上結果說明 T 等位基因可能是塵肺的危險因素，而 C 等位基因可能是塵肺的保護因素。
我們分析了 IRGM 三個位點的連鎖不平衡狀態，結果顯示 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位點兩兩之間均存在連鎖不平衡，提示三個位點遺傳有關聯性，因此進一步構建單體型進行分析，發現 ACT 和 ACC 單體型在塵肺組和對照組的差異有統計學意義，提示 ACT 單體型可能與塵肺的發病風險增高有關，而 ACC 單體型則可能與塵肺的發病風險降低有關。這與中國北京學者 Che 等[15]的研究結果一致，他們發現 IRGM ACC 單體型與結核病的發病風險降低相關。
綜上所述，本研究提示 IRGM 基因 rs4958846 位點 T 等位基因和 ACT 單體型可能與塵肺的易感性相關。但 IRGM 基因與塵肺之間的相關性探討還需要對不同民族、種族、地區的人群進行分析，建立不同地區多態基因譜，擴大樣本量進行驗證，同時多態位點的更多生物學功能還可以在蛋白水平上進行深層探究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
塵肺是在生產過程中由于長時間吸入工作環境中的粉塵顆粒而引起的一種危害嚴重的職業病，表現為肺間質中成纖維細胞大量增殖以及細胞外基質膠原蛋白成分異常聚集[1-2]。免疫相關鳥苷三磷酸酶 M（immunity related GTPase M，IRGM）基因通過誘導細胞自噬調節機體免疫功能，可作為觸發器啟動連鎖免疫反應，進而吞噬、消化外來有害物質，在細胞自噬性程序性死亡過程中起重要作用[3]。IRGM 基因多態性可能會影響自噬相關蛋白的表達，從而影響細胞自噬的反應性，而自噬和肺部纖維化的發生發展過程有密切關系。目前國內外對 IRGM 基因多態性位點與結核病、克羅恩病關系均有相關的研究，但關于 IRGM 基因多態性是否與塵肺有關尚未見報道。因此，探索自噬相關基因 IRGM 基因多態性是否與塵肺發病過程有關將有助于闡明塵肺的發病機制，為塵肺的防治提供新的策略。
1 資料與方法
1.1 一般資料
研究對象分別來自 2016 年 6 月到 2018 年 12 月在湖北醫藥學院附屬太和醫院、十堰市職業病防治院就診的鄂西北地區金礦、鐵礦、煤礦的接塵工人，均為無血緣關系的漢族人。本次研究符合道德倫理并經湖北醫藥學院附屬太和醫院倫理委員會同意，全部研究對象簽訂知情同意書。病例組：根據我國最新塵肺病診斷標準（GBZ70-2015），確診的塵肺患者作為病例組，一共有 248 例；對照組：以同性別、同民族、同一礦區、開始接塵時間和累積接塵工齡相近經證實未患塵肺的接塵工人為對照組，共 275 例。
1.2 方法
1.2.1 一般情況調查
采用自行設計的塵肺調查表對病例組和對照組進行調查，收集調查對象的基本資料，包括個人一般情況、疾病史、職業暴露史、吸煙史，以及塵肺患病情況等。按照世界衛生組織標準，連續或累積吸煙 6 個月或以上者為吸煙。
1.2.2 單核苷酸多態性位點的選擇
利用 Haploview（version 4.0）軟件，根據標簽單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）的挑選標準，采用 Tagger 軟件選擇 MAF≥0.05 的 SNP 位點；從 NCBI 及 HapMap 數據庫中查找中國人群 IRGM 啟動子區 SNP 及相關信息，并利用 Genetool 工具在 IRGM 基因上定位，篩選出中國人群 IRGM 啟動子區 SNP。
1.2.3 基因型檢測
采集靜脈血 2 mL，采用 DNA 提取試劑盒提取 DNA，采用 TAKARA 公司 PrimeSTAR Max DNA Polymerase 試劑盒對提取的 DNA 進行 PCR 擴增，對所有 PCR 產物純化并進行 Sanger 測序對所有 PCR 產物進行純化并測序，測序引物為 PCR 擴增上游引物，測序結果與 GeneBank 進行比對。
1.3 統計學方法
用 Excel 建立數據庫，采用 SPSS 18.0 統計軟件。連續變量的比較用 t 檢驗，分類變量用 χ2 檢驗。對照組基因型用 χ2 擬合優度檢驗判斷其是否符合 Hardy-Weinberg 平衡。不同基因型在兩組人群及各亞組中的比較用 χ 2 檢驗。應用 SNPstats 軟件分析單個 SNP 和塵肺的相關性，應用在線軟件 SHEsis 進行各個位點的連鎖不平衡分析和單體型分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 病例組和對照組一般情況
病例組和對照組之間年齡、性別、工齡及吸煙史分布均衡，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
研究對象的一般情況
2.2 Hardy-Weinberg 平衡檢驗
應用 Hardy-Weinberg 遺傳平衡吻合度檢驗方法，分析對照組人群 IRGM 基因型遺傳平衡情況，結果表明各位點的對照組數據差異無統計學意義（均 P>0.05），說明此次研究所選的樣本具有較好的人群代表性。結果見表 2。
表2
IRGM 三個多態位點 Hardy-Weinberg 平衡檢驗結果
2.3 病例組與對照組 IRGM 基因型及等位基因分布情況
IRGM 基因 rs4958842、rs4958843、rs4958846 三個位點的測序圖譜見圖 1。表 3 展示了 IRGM 各位點基因型的分布情況。其中，rs4958842 位點的 AA、AG、GG 三種基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布差異均無統計學意義（P>0.05）；rs4958843 位點的 CC、CT、TT 三種基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布差異也無統計學意義（P>0.05）；rs4958846 位點的 TT、TC、CC 三種基因型和等位基因在病例組和對照組中的分布差異有統計學意義（P<0.001），病例組中 TT 基因型的頻率為 76.6%，顯著高于對照組的 41.7%，而 TC、CC 基因型在對照組的頻率分別為 41.8%、17.5%，顯著高于病例組的 17.7%、5.6%。rs4958846 位點等位基因 T 和 C 在病例組的分布頻率分別為 85.5%、14.5%，在對照組的分布頻率為 61.6%、38.4%，差異有統計學意義（表 4）。
圖1
各位點不同基因型測序圖
表3
塵肺組與對照組 IRGM 各位點基因型分布比較
表4
塵肺組與對照組 IRGM 各位點等位基因分布比較
2.4 連鎖不平衡和單體型分析
利用在線軟件 SHEsis 分析基因之間的連鎖不平衡 D'值和 r2 值，分析結果表明，IRGM 的三個基因位點 rs4958842、rs4958843、rs4958846 兩兩之間均存在連鎖不平衡（D'>0.7，r2>0.3），說明三個位點遺傳有關聯性。結果見表 5。
表5
IRGM 基因位點之間連鎖不平衡的 D'和 r2 值
采用軟件 SHEsis 進一步分析單體型，IRGM 基因位點構建 4 個單體型，各個單體型在病例組和對照組的分布情況見表 6。結果顯示 4 種單體型中，ACT 單體型在病例組頻率分布明顯高于對照組，而 ACC 單體型在病例組的頻率分布明顯低于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05），所構建的其他單體型在病例組和對照組中的分布差異無統計學意義（P>0.05）。
表6
IRGM 的 4 種單體型在病例組和對照組的分布頻率
3 討論
塵肺的發生是環境因素與個體因素綜合作用的結果，因此即使在相同的暴露情況下，不同個體的反應也會有很大不同，有些人發病，有些人不發病。即使同為塵肺患者也會存在嚴重程度的差異，除了年齡、性別、營養狀況、生化代謝差異以及是否患有結核和其他呼吸道疾病等因素對粉塵易感性存在影響外，遺傳因素特別是基因的變異可能是造成個體對粉塵易感性差異的重要因素之一[4-5]。因此探討塵肺的易感基因，篩選易感的高危人群，對塵肺的防治具有重要意義。
自噬在清除外來物質、自身細胞碎片、細胞器方面有重要作用[6]。有研究表明，塵粒沉積可引起巨噬細胞的自噬功能增強[7]。自噬對沉積物的清除功能漸漸受到關注，研究發現不同期別煤工塵肺患者的自噬活動強弱不同[8-9]，提示在游離 SiO2 粉塵刺激下，細胞除了經典的細胞凋亡反應之外，自噬和肺部纖維化的發生發展過程有密切聯系。IRGM 基因通過調節自噬來清除胞內病原體，從而在自身免疫反應中起重要作用[10-11]。IRGM 基因多態性可能會影響自噬相關蛋白的表達，從而影響細胞自噬的反應性。伊朗學者發現 IRGM 啟動子區–1161T/C 與–947T/C 位點與結核病易感性有關[12]；還有學者發現 IRGM 基因的 rs13361189、rs4958847 位點與歐美白種人的克羅恩病易感性有顯著相關[13-14]。目前關于 IRGM 基因多態性是否與塵肺發生有關尚未見報道。此次研究我們選擇 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位點，分別研究三個位點與塵肺易感性的關系，對三個位點進行連鎖不平衡分析并構建單體型，探討所構單體型與塵肺易感性的關系。
本研究入選了 248 例塵肺患者為病例組，未患塵肺的 275 例接塵工人為對照組。兩組在年齡、性別、吸煙情況、累計接塵工齡的差異均沒有統計學意義，說明入組樣本均衡可比。并且 IRGM 基因的 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位點在對照組的基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，進一步說明所選樣本具有較好的群體代表性。目前在中國人群中對 IRGM 基因多態性的探索只有來自中國北京學者的研究，他們發現 IRGM 的 rs4958842 位點與結核病易感性有關[15]。本次研究發現 IRGM 的 rs4958846 位點與塵肺的易感性相關，而 rs4958842、rs4958843 位點與塵肺的易感性沒有關聯。我們推測可能是由于 rs4958846 位點的突變，導致 IRGM 蛋白水平的降低，影響了 IRGM 對細胞自噬的調節，使機體對沉積物的清除能力減弱，所以此種人群更容易發生塵肺。rs4958846 基因位點 TT 基因型在塵肺組的頻率高于對照組，而 TC 和 CC 基因型在對照組中的頻率高于病例組，等位基因 T 和 C 在病例組和對照組的頻率分布也有差異。以上結果說明 T 等位基因可能是塵肺的危險因素，而 C 等位基因可能是塵肺的保護因素。
我們分析了 IRGM 三個位點的連鎖不平衡狀態，結果顯示 rs4958842、rs4958843、rs4958846 位點兩兩之間均存在連鎖不平衡，提示三個位點遺傳有關聯性，因此進一步構建單體型進行分析，發現 ACT 和 ACC 單體型在塵肺組和對照組的差異有統計學意義，提示 ACT 單體型可能與塵肺的發病風險增高有關，而 ACC 單體型則可能與塵肺的發病風險降低有關。這與中國北京學者 Che 等[15]的研究結果一致，他們發現 IRGM ACC 單體型與結核病的發病風險降低相關。
綜上所述，本研究提示 IRGM 基因 rs4958846 位點 T 等位基因和 ACT 單體型可能與塵肺的易感性相關。但 IRGM 基因與塵肺之間的相關性探討還需要對不同民族、種族、地區的人群進行分析，建立不同地區多態基因譜，擴大樣本量進行驗證，同時多態位點的更多生物學功能還可以在蛋白水平上進行深層探究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
