引用本文： 楊偉源, 李理, 鄭林鑫, 李偉峰. EGFR/Foxo3a/Snail1 通路在博來霉素肺纖維化小鼠中的作用機制探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(4): 371-378. doi: 10.7507/1671-6205.201904028 復制
特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）屬于間質性肺疾病中的一種常見疾病類型，具有極高的病死率，其發病機制尚未明確，其中肺泡上皮細胞在反復的微小損傷后的異常修復被認為是其重要機制之一[1]。研究發現，在纖維化患者及博來霉素引起的小鼠肺纖維化模型中均發現上皮細胞損傷后的修復過程中伴有上皮–間質轉分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）[2-3]。以表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）為代表的 EGF 生長因子家族及其受體 EGFR 均在肺纖維化的病程中起著重要作用[4]。叉頭盒蛋白（forkhead box protein，FOX）家族是一類轉錄因子，其 DNA 結合區具有翼狀螺旋結構，與機體發育、細胞免疫、物質代謝與癌癥等生理病理過程密切相關。有研究表明，在細胞 EMT 過程中 FOX 家族起到重要的調控作用[5]，FoxO3a 是 FOX 家族中的一員，其失活能夠促進 IPF 患者成纖維細胞增殖與膠原聚合物的增加[4]。Ishii 等[6]的研究發現 EGFR 對磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路起激活作用[7-8]，同時亦有研究發現 Foxo3a 是胰島素/磷酸肌醇-3 激酶（insulin-PI3K-Akt）通路中的重要信號分子[9]，此通路可負性調控 Foxo3a 的表達。本實驗室前期研究證實了 EGFR-TKI 明顯抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，下調 EGFR/Akt 信號通路活性，減少 EMT 間質標志物 α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達，使 Foxo3a 活化增加[10-12]，提示 Foxo3a 對小鼠肺纖維化起保護作用，但其具體的作用機制目前尚不明確。Snail1 亦參與了肺纖維化 EMT 過程的調控。Snail1 蛋白是 Snail 超家族的一員，能促使細胞上皮標志物如上皮鈣黏素（E-cadherin）等下調，間質標志物如纖連蛋白等上調，導致間充質樣細胞的產生[13]。因此，本研究建立博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型，并予以 EGFR-TKI 代表藥物吉非替尼干預，探討 Foxo3a 下游信號通路及 Foxo3a 在肺纖維化 EMT 中可能的作用機制，以尋求肺纖維化潛在的關鍵靶點，為其治療策略的制定提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF 級 C57BL/6 小鼠 30 只，雌雄各半，6 周齡，平均體重為 18.65 g。小鼠從廣東省醫學實驗動物中心（SCXK（粵）2013-0002）購買，寄養于中國人民解放軍南部戰區總醫院實驗動物中心（原廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心，資質批準號：SYXK（粵）2014-0100）。嚴格遵守《實驗動物管理條例》實施所有實驗操作與實驗流程。
1.2 主要材料
博來霉素（15 mg/支，浙江海正藥業）；吉非替尼（250 mg/片，英國阿斯利康公司）；RIPA 強裂解液（江蘇碧云天公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司）；蛋白酶抑制劑（江蘇碧云天公司）；磷酸酶抑制劑 A（江蘇碧云天公司）；α-SMA 抗體（武漢博士德公司）；E-cadherin 抗體（美國 CST 公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國 CST 公司）；FoxO3a 抗體（美國 CST 公司）；磷酸化叉頭盒蛋白 O3a（Phospho-Foxo3a，p-FoxO3a）抗體（美國 CST 公司）；叉頭盒蛋白 M1（Forkhead box M1，FoxM1）抗體（英國 biorbyt 公司）；Snail1 抗體（美國 CST 公司）；HMGB1 抗體（美國 CST 公司）；極超敏 ECL 化學發光試劑盒（江蘇碧云天公司）；Masson 三色染色試劑盒（武漢塞維爾公司）；蘇木素–伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（武漢塞維爾公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯，BX-51）；Multiskan Go 全波長酶標儀（美國 Thermo Fisher 公司）；Minichemi 化學發光儀（北京賽智創業科技有限公司）；迷你型凝膠成像儀（北京賽智創業科技有限公司）；PrimeScript RT Master Mix（寶生物工程有限公司），2×Taq Master Mix（寶生物工程有限公司）；所用引物由蘇州泓迅生物科技有限公司根據設計合成。
1.3 方法
1.3.1 小鼠肺纖維化模型的建立
30 只 C57BL/6 小鼠隨機平均分成 3 組，每組 10 只，雌雄各半，分別是對照組、博來霉素組、吉非替尼組。所采用的造模與干預試驗方法參考吉非替尼抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的實驗研究[10]。以腹腔注射 10% 水合氯醛對三組小鼠進行麻醉，麻醉成功后固定于小鼠手術操作臺，縱行切開頸前皮膚，暴露并鈍性分離氣管，朝博來霉素組與吉非替尼組小鼠向心端氣管內注入 100 μL 博來霉素溶液（3 mg/kg 溶于 100 μL 的 0.9% 氯化鈉注射液），對照組注入等體積的 0.9% 氯化鈉注射液。注射后快速地將動物頭朝上直立旋轉使藥液在肺內分布均勻；次日起即在每日同一時間段對各組小鼠進行連續 14 d 的灌胃處理，吉非替尼組小鼠每日予 100 μL 吉非替尼溶液（20 mg/kg 溶于 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液）灌胃，對照組與博來霉素組小鼠則每日予 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液灌胃，14 d 后解剖小鼠以收集肺組織標本。取其左肺組織石蠟切片行 HE 染色及 Masson 染色，右肺組織檢測各目的基因的 mRNA 及蛋白表達水平。
1.3.2 小鼠肺組織病理檢查
肺組織以 4% 多聚甲醛固定 48 h，經常規脫水、石蠟包埋、2 μm 厚度切片后，行 HE 染色和 Masson 染色。肺損傷程度評分參照 Mikawa 等[14]的方法進行，纖維化程度評分參照 Ashcroft 等[15]的方法進行。
1.3.3 逆轉錄–聚合酶鏈反應法檢測小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表達
取各組小鼠肺組織 0.1 g，放入無 RNA 酶的預冷玻璃勻漿器中，各加入 1 mL Trizol，冰上進行勻漿處理，勻漿后按照說明書提取總 RNA，超微量分光光度計測定各組小鼠肺組織所提取的 RNA 總濃度，并調整各組質量濃度為 500 ng/ μL，進行逆轉錄–聚合酶鏈反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆轉錄反應體系（10 μL）：5×RT 含酶預混液 2 μL，RNA 0.5 μg，無 RNA 酶水補足至總體系 10 μL。逆轉錄條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。PCR 反應體系（25 μL）：2×PCR 含酶預混液 12.5 μL，α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 上下游引物各 0.25 μL，逆轉錄產物模板 2 μL，滅菌超純水 10 μL。PCR 反應條件：預變性 95 ℃ 10 min，變性 95 ℃ 30 s，相應退火溫度 30 s，延伸 72 ℃ 30 s（相應循環數見表 1），末次延伸 72 ℃ 10 min。取 10 μL 相應產物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統拍照。采用 Quantity One 軟件分析電泳條帶灰度值，以 β-actin 為基準進行半定量分析。相關引物序列、退火溫度及循環次數見表 1。
表1
引物序列、退火溫度及循環次數
1.3.4 免疫印跡法檢測小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表達
取各組小鼠肺組織各 0.1 g，勻漿后分別對應加入含有適量蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的 RIPA 強裂解液，冰上裂解 50 min 后以 4 ℃、13 000 r/min 的條件離心 15 min，上清液即為總蛋白，使用 BCA 法測定各組總蛋白濃度后，50 μg/孔上樣，進行 SDS-PAGE 后將蛋白轉移至 PVDF 膜上，以 5% 脫脂奶粉 20 mL 室溫封閉 1 h。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。分別加入 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 一抗，4 ℃ 孵育過夜。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。加入 HRP 標記的二抗 37 ℃ 孵育 1 h，再使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。化學發光試劑檢測蛋白印跡條帶，采用 Quantity One 軟件分析電泳條帶灰度值，以 β-actin 為基準進行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。所有數據均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態性檢驗后以均數±標準差（
±s）表示。若計量資料符合正態分布、方差齊，則多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗法；若計量資料符合正態分布、但方差不齊，則多組間比較采用 Welch 檢驗法，兩兩比較采用 Games-Howell 檢驗法。顯著性水準 α=0.05，雙側檢驗。
2 結果
2.1 小鼠肺組織病理學改變
2.1.1 肺組織 HE 染色及炎癥損傷評分
HE 染色結果見圖 1。三組小鼠肺組織炎癥損傷評分依次為（1.8±0.8）分、（8.6±0.9）分、（2.6±0.9）分，差異具有統計學意義（F=90.087，P=0.000）。博來霉素組肺組織炎癥損傷評分較對照組升高（P<0.01），吉非替尼組肺組織炎癥損傷評分較博來霉素組下降（P<0.01），與對照組無顯著性差異（P=0.522）。
圖1
小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 對照組：肺組織的結構完整而清晰，肺泡壁較連續且薄，肺泡無明顯的炎癥細胞浸潤；b. 博來霉素組：肺組織出現彌漫性實變，肺泡壁增厚明顯，肺泡間隔破壞，肺泡中可見大量炎癥細胞浸潤，較多成纖維細胞出現在肺間質；c. 吉非替尼組：肺組織結構輕度紊亂，可見少量炎癥細胞浸潤
2.1.2 肺組織 Masson 染色及纖維化程度評分
Masson 染色結果見圖 2。三組小鼠肺組織纖維化病理評分依次為（1.4±0.5）分、（5.6±1.1）分、（2.8±0.4）分，差異具有統計學意義（F=38.111，P=0.000）。博來霉素組纖維化程度評分較對照組升高（P<0.01），吉非替尼組纖維化程度評分較博來霉素組下降（P<0.01），較對照組升高（P<0.05）。
圖2
小鼠肺組織病理檢查像（Masson×200）
a. 對照組：肺組織結構完整而清晰，未出現明顯炎癥細胞浸潤及藍色的膠原沉積；b. 博來霉素組：肺組織結構紊亂，肺間質可見炎癥細胞浸潤，上皮下的藍色膠原沉積明顯增加；c. 吉非替尼組：肺組織的肺泡壁稍增厚，有少量炎癥細胞浸潤，但結構基本完整，伴有少量藍色膠原沉積
2.2 小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 的表達
肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表達的 RT-PCR 結果見圖 3a，半定量分析結果見圖 3b及表 2。
圖3
小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表達
a. RT-PCR 結果電泳條帶圖；b. 相對表達水平。與博來霉素組比較，*
表2
小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 相對表達水平（
）
2.3 小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表達
肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表達的免疫印跡檢測結果見圖 4a 及圖 5a，半定量分析結果見圖 4b、5b 及表 3。
圖4
肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表達
a. 免疫印跡檢測電泳條帶圖；b. 相對表達水平。與博來霉素組比較，*
圖5
小鼠肺組織 p-Foxo3a 與 Foxo3a 蛋白的表達
a. 免疫印跡檢測電泳條帶圖；b. Foxo3a 蛋白磷酸化水平。與博來霉素組比較，*
表3
小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白相對表達水平及 Foxo3a 蛋白磷酸化水平（
）
3 討論
肺纖維化的病理生理過程錯綜復雜，合理運用動物模型盡可能重現其病理生理過程，是更準確有效地探究肺纖維化治療方法的重要前提。博來霉素致肺纖維化模型是公認的較成熟的模型，能夠反映人類肺纖維化的病理特點[16]。科研人員多采用單次氣管內滴入博來霉素這一經典方法來復制肺纖維化模型[17]，該方法具有給藥次數少、劑量小、造模時間短、經濟成本較低等優點[18]。在保證實驗研究科學性的基礎上，出于對經濟成本、操作簡便性以及保持與本實驗室前期研究的連貫性等方面的考慮，本次研究依然采用氣管內滴入博來霉素的經典方法來建立小鼠肺纖維化模型。本實驗所采用的造模與干預試驗方法參考吉非替尼抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的實驗研究[10]。而鑒定肺纖維化體外模型成功的金標準目前尚未明確，常用的方法有觀察細胞形態、檢測膠原含量與對 TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、α-SMA、E-cadherin 等指標的檢測，而 α-SMA 是間充質細胞表型的標志物之一，其表達對于肌成纖維細胞代謝和形態學特性維持起重要作用，其表達增加是 EMT 的標志[19]。E-cadherin 是上皮細胞黏附和表型的標志物之一，其減少和丟失是 EMT 的標志，從而形成纖維化[20]。EMT 可以由多種轉錄因子所調控，如 Snail、Slug 等，可以抑制 E-cadherin 的表達，這些分子開關都可以被 FoxM1 所調控[21]。亦有研究發現，FoxM1 是 Foxo3a 的直接轉錄靶點，PI3K-AKT-FOXO 信號通路的重要下游效應物[22]。另有研究顯示，FoxM1 是吉非替尼作用的一個下游分子靶點，在乳腺癌細胞中吉非替尼可以通過激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表達[23]。Snail1 主要表達于上皮細胞，被激活后進入胞核與 E-cadherin 啟動子中特異性 DNA 序列 E-box 元件結合后，可抑制 E-cadherin 的基因轉錄與蛋白表達，最終導致 EMT 的發生[24]。研究表明，HMGB1 參與炎癥反應，且能誘導Ⅱ型肺泡上皮細胞發生間質細胞轉分化，從上皮細胞向肌成纖維細胞轉化并且表達 α-SMA，與組織纖維化密切相關[25]。我們推測，Foxo3a 通過負調控 FoxM1 與 Snail1 來抑制肺纖維化 EMT。因此，本研究先復制博來霉素致小鼠肺纖維化模型，并予吉非替尼干預，借助 HE 染色與 Masson 染色等組織病理學方法評估各組小鼠肺組織炎癥程度與纖維化程度、RT-PCR 與免疫印跡法檢測 α-SMA、E-cadherin 表達情況以評估肺纖維化 EMT 形成與否，以 HMGB1 表達水平輔助評估肺組織炎癥程度；在成功復制模型后，再檢測 Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 的表達水平，初步探究肺纖維化中 Foxo3a 的下游通路。
由于目前還沒有一種公認的方法可以使肺纖維化在已形成后逆轉，此次研究仍然沿用傳統的干預方案，將吉非替尼的干預持續于 14 d 的整個造模過程中，即本研究所觀察到的 TKI 的數據是作用于肺泡急性損傷階段和肺纖維化兩個階段的[26]。在本研究中，HE 染色及 Masson 染色結果顯示，與對照組相比，博來霉素組小鼠的肺部炎癥損傷程度評分及纖維化程度評分上調。RT-PCR 與免疫印跡檢測結果則顯示，一方面，HMGB1 基因與蛋白水平上調，此從分子學水平上反映了小鼠肺部炎癥程度；另一方面，α-SMA 基因與蛋白表達水平上調，E-cadherin 基因與蛋白表達水平下調，提示 EMT 形成，本研究成功復制了博來霉素致肺纖維化小鼠模型。這與相關的既往研究結果相符[10-11]。本研究還發現在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中 HMGB1、α-SMA 基因與蛋白表達均上調，在吉非替尼干預后 HMGB1、α-SMA 基因與蛋白表達均下調，兩者的表達變化相一致。蔡琳等[25]的研究結果顯示 HMGB1 表達增加可以活化間質標志物 α-SMA 的表達，本研究及文獻結果均提示 α-SMA 可能受上游的 HMGB1 調控。此外，還有研究顯示 HMGB1 可以作為壞死細胞的死亡標志物，還是炎癥反應的關鍵分子[27]。因此，我們推測 HMGB1 可能通過其在 EMT 與炎癥反應兩個方面的變化影響著肺纖維化。
Foxo3a 可以被 PI3K/Akt 通路中活化的 Akt 磷酸化而失活，參與調控 EMT 的效應蛋白的基因如 Snails、Twist 等的表達[28]，表現為成纖維細胞增殖及Ⅰ型膠原的沉積[29]。在本研究中，與博來霉素組相比，吉非替尼組小鼠 p-Foxo3a 蛋白表達水平呈下降趨勢，Foxo3a 基因與蛋白表達水平皆有上升趨勢，但 Foxo3a 蛋白磷酸化水平下調，即活性增加；吉非替尼組肺組織炎癥損傷程度及纖維化程度減輕，α-SMA 基因與蛋白水平下調，此變化趨勢與 Foxo3a 活性變化相反；吉非替尼組 E-cadherin 基因與蛋白水平上調，此與 Foxo3a 活性變化相同。另有研究發現，敲低 Foxo3a 后，人腎小管上皮細胞 EMT 的關鍵指標 E-cadherin 蛋白含量明顯減少，而 α-SMA 蛋白含量與陰性對照組相比顯著增加[30]。這提示 Foxo3a 對 EMT 過程有負性調控作用。因此，我們推測吉非替尼可通過抑制 Foxo3a 磷酸化，使 Foxo3a 水平升高，活性增加，來抑制肺纖維化，這與彭婷等[12]的研究結果一致。但 Foxo3a 在肺纖維化 EMT 中的下游通路尚不清楚，且目前國內外亦鮮有對 Foxo3a 在肺纖維化中的作用機制的研究報道。
前文已提及 Snail1 與 FoxM1 可能是 Foxo3a 的下游分子。本研究發現，博來霉素組小鼠 Foxo3a 蛋白磷酸化水平上調（活性減少），Snail1 基因與蛋白水平上調，伴隨著 E-cadherin 基因與蛋白水平的下調與 α-SMA 基因與蛋白水平的上調；予以 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼后，Foxo3a 蛋白磷酸化水平下調（活性增加），Snail1 基因與蛋白水平下調，E-cadherin 基因與蛋白水平上調，α-SMA 基因與蛋白水平下調。即 Snail1 基因與蛋白水平變化與 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、α-SMA 表達水平變化互相平行，卻與 Foxo3a 活性變化、E-cadherin 表達變化相反。研究表明，Snail1 是一種含鋅指蛋白的轉錄因子，它能與 E-cadherin 或其他基因啟動子上的特異性 DNA 序列 E-box 結合，抑制基因轉錄從而誘導 EMT，是所有激活 EMT 過程的中心媒介[31]。而本研究及本實驗室前期研究[12]亦均證實了 Foxo3a 活性增加可上調 E-cadherin 表達，下調 α-SMA 表達，從而抑制肺纖維化。故我們推測，Foxo3a 通過負調控 Snail1 表達來緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。
FoxM1 屬于 Fox 家族中的一員，可以調控細胞的增殖、成熟、死亡等生理病理過程[32]。有研究提示 FoxM1 可能通過上調 Snail 來抑制 E-cadherin，從而促進非小細胞肺癌 EMT 的發生[5]。金成等[33]發現在人結腸癌組織中 FoxM1 高表達而 E-cadherin 低表達。于水等[34]發現 FoxM1 可調控 Snail1 以促進肝癌 EMT。以上研究均提示 FoxM1 與 Snail1 之間可能呈正調控關系。為了進一步探索 Foxo3a 與 Snail1 的關系，本研究檢測了各組小鼠肺組織中 FoxM1 基因與蛋白表達水平。結果顯示博來霉素組小鼠肺組織中 FoxM1 基因與蛋白表達水平呈上升趨勢，Snail1 基因與蛋白表達水平上調；予以吉非替尼干預后，吉非替尼組小鼠肺組織 FoxM1 基因與蛋白表達水平卻較博來霉素組小鼠的輕微升高，而 Snail1 基因與蛋白表達水平下調，此時 FoxM1 與 Snail1 的表達水平并非如預期一樣地呈正相關關系。同時，吉非替尼組小鼠 FoxM1 表達水平與 Foxo3a 活性變化趨勢相同，這亦與 McGovern 等[23]發現吉非替尼能通過激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表達的研究結果并不相符。為了解決這一疑惑，我們查閱相關文獻發現人類 FoxM1 的蛋白表達存在著 A、B、C 三種剪接異構體。FoxM1A 不具有轉錄活性，在細胞中表達很低；FoxM1B 和 FoxM1C 具有轉錄活性，在腫瘤組織中有高表達，但在某些方面具有不同的生物學功能[35-36]。譚擁軍等[37]在轉錄因子 FoxM1 剪接異構體在乳腺癌 EMT 過程中的研究中發現 FoxM1B 促進 EMT 的發生，FoxM1C 卻能抑制 EMT 的發生，FoxM1B 與 FoxM1C 作為 FoxM1 的剪接異構體具有完全相反的功能。本研究中吉非替尼組小鼠肺組織 FoxM1 基因與蛋白表達水平僅較對照組與博來霉素組小鼠的輕微上升，差異并無統計學意義，但其 Foxo3a 蛋白磷酸化水平卻顯著下調，即 Foxo3a 活性增加。這提示在此研究中 Foxo3a 活性的增加可能并未明顯影響 FoxM1 的基因轉錄與蛋白表達水平。因此，我們推測小鼠肺組織中 FoxM1 可能也存在剪接異構體，Foxo3a 可能通過調節 FoxM1 不同剪接異構體之間的比例來調控其下游通路，但具體的調控機制仍待進一步研究去闡明。另外，FoxM1 基因與蛋白表達水平的趨勢不明顯是否由各組實驗小鼠數目不夠多所致，有待深入研究。
本研究通過采用氣管內滴入博來霉素的經典方法來建立小鼠肺纖維化模型，首次探討了在肺纖維化中與 Foxo3a 相關的下游信號通路。本研究表明，Foxo3a 蛋白磷酸化水平以及 Snail1 基因與蛋白水平在博來霉素致肺纖維化小鼠肺組織中的表達變化與肺纖維化程度變化趨勢一致，而在 EGFR-TKI 代表藥物吉非替尼減輕博來霉素誘導的肺纖維化過程的同時，伴隨著 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、Snail1 基因與蛋白水平的下調。因此，我們推測 Foxo3a 活性增加可下調 Snail1，使得 α-SMA 表達降低、E-cadherin 表達升高，從而減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，其機制可能與 Foxo3a 通過調節 FoxM1 不同剪接異構體之間的比例來調控其下游通路有關。本研究或可撥開肺纖維化發病機制上的重重迷霧，找到肺纖維化的關鍵靶點，為該病的防治貢獻一點綿薄之力。但本研究僅為初步研究，Foxo3a 是否通過調控 FoxM1 不同剪接異構體之間比例來抑制 Snail1，后續或需通過檢測 FoxM1 不同剪接異構體的 mRNA 與蛋白表達水平等進一步研究加以求證。同時應增加各組實驗小鼠樣本量，使得目的基因的表達趨勢變化更加明顯。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）屬于間質性肺疾病中的一種常見疾病類型，具有極高的病死率，其發病機制尚未明確，其中肺泡上皮細胞在反復的微小損傷后的異常修復被認為是其重要機制之一[1]。研究發現，在纖維化患者及博來霉素引起的小鼠肺纖維化模型中均發現上皮細胞損傷后的修復過程中伴有上皮–間質轉分化（epithelial mesenchymal transition，EMT）[2-3]。以表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）為代表的 EGF 生長因子家族及其受體 EGFR 均在肺纖維化的病程中起著重要作用[4]。叉頭盒蛋白（forkhead box protein，FOX）家族是一類轉錄因子，其 DNA 結合區具有翼狀螺旋結構，與機體發育、細胞免疫、物質代謝與癌癥等生理病理過程密切相關。有研究表明，在細胞 EMT 過程中 FOX 家族起到重要的調控作用[5]，FoxO3a 是 FOX 家族中的一員，其失活能夠促進 IPF 患者成纖維細胞增殖與膠原聚合物的增加[4]。Ishii 等[6]的研究發現 EGFR 對磷酸肌醇-3 激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）通路起激活作用[7-8]，同時亦有研究發現 Foxo3a 是胰島素/磷酸肌醇-3 激酶（insulin-PI3K-Akt）通路中的重要信號分子[9]，此通路可負性調控 Foxo3a 的表達。本實驗室前期研究證實了 EGFR-TKI 明顯抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，下調 EGFR/Akt 信號通路活性，減少 EMT 間質標志物 α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達，使 Foxo3a 活化增加[10-12]，提示 Foxo3a 對小鼠肺纖維化起保護作用，但其具體的作用機制目前尚不明確。Snail1 亦參與了肺纖維化 EMT 過程的調控。Snail1 蛋白是 Snail 超家族的一員，能促使細胞上皮標志物如上皮鈣黏素（E-cadherin）等下調，間質標志物如纖連蛋白等上調，導致間充質樣細胞的產生[13]。因此，本研究建立博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型，并予以 EGFR-TKI 代表藥物吉非替尼干預，探討 Foxo3a 下游信號通路及 Foxo3a 在肺纖維化 EMT 中可能的作用機制，以尋求肺纖維化潛在的關鍵靶點，為其治療策略的制定提供新思路。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
SPF 級 C57BL/6 小鼠 30 只，雌雄各半，6 周齡，平均體重為 18.65 g。小鼠從廣東省醫學實驗動物中心（SCXK（粵）2013-0002）購買，寄養于中國人民解放軍南部戰區總醫院實驗動物中心（原廣州軍區廣州總醫院實驗動物中心，資質批準號：SYXK（粵）2014-0100）。嚴格遵守《實驗動物管理條例》實施所有實驗操作與實驗流程。
1.2 主要材料
博來霉素（15 mg/支，浙江海正藥業）；吉非替尼（250 mg/片，英國阿斯利康公司）；RIPA 強裂解液（江蘇碧云天公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（江蘇碧云天公司）；蛋白酶抑制劑（江蘇碧云天公司）；磷酸酶抑制劑 A（江蘇碧云天公司）；α-SMA 抗體（武漢博士德公司）；E-cadherin 抗體（美國 CST 公司）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（美國 CST 公司）；FoxO3a 抗體（美國 CST 公司）；磷酸化叉頭盒蛋白 O3a（Phospho-Foxo3a，p-FoxO3a）抗體（美國 CST 公司）；叉頭盒蛋白 M1（Forkhead box M1，FoxM1）抗體（英國 biorbyt 公司）；Snail1 抗體（美國 CST 公司）；HMGB1 抗體（美國 CST 公司）；極超敏 ECL 化學發光試劑盒（江蘇碧云天公司）；Masson 三色染色試劑盒（武漢塞維爾公司）；蘇木素–伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色試劑盒（武漢塞維爾公司）；光學顯微鏡（日本奧林巴斯，BX-51）；Multiskan Go 全波長酶標儀（美國 Thermo Fisher 公司）；Minichemi 化學發光儀（北京賽智創業科技有限公司）；迷你型凝膠成像儀（北京賽智創業科技有限公司）；PrimeScript RT Master Mix（寶生物工程有限公司），2×Taq Master Mix（寶生物工程有限公司）；所用引物由蘇州泓迅生物科技有限公司根據設計合成。
1.3 方法
1.3.1 小鼠肺纖維化模型的建立
30 只 C57BL/6 小鼠隨機平均分成 3 組，每組 10 只，雌雄各半，分別是對照組、博來霉素組、吉非替尼組。所采用的造模與干預試驗方法參考吉非替尼抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的實驗研究[10]。以腹腔注射 10% 水合氯醛對三組小鼠進行麻醉，麻醉成功后固定于小鼠手術操作臺，縱行切開頸前皮膚，暴露并鈍性分離氣管，朝博來霉素組與吉非替尼組小鼠向心端氣管內注入 100 μL 博來霉素溶液（3 mg/kg 溶于 100 μL 的 0.9% 氯化鈉注射液），對照組注入等體積的 0.9% 氯化鈉注射液。注射后快速地將動物頭朝上直立旋轉使藥液在肺內分布均勻；次日起即在每日同一時間段對各組小鼠進行連續 14 d 的灌胃處理，吉非替尼組小鼠每日予 100 μL 吉非替尼溶液（20 mg/kg 溶于 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液）灌胃，對照組與博來霉素組小鼠則每日予 100 μL 的 5% 葡萄糖溶液灌胃，14 d 后解剖小鼠以收集肺組織標本。取其左肺組織石蠟切片行 HE 染色及 Masson 染色，右肺組織檢測各目的基因的 mRNA 及蛋白表達水平。
1.3.2 小鼠肺組織病理檢查
肺組織以 4% 多聚甲醛固定 48 h，經常規脫水、石蠟包埋、2 μm 厚度切片后，行 HE 染色和 Masson 染色。肺損傷程度評分參照 Mikawa 等[14]的方法進行，纖維化程度評分參照 Ashcroft 等[15]的方法進行。
1.3.3 逆轉錄–聚合酶鏈反應法檢測小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表達
取各組小鼠肺組織 0.1 g，放入無 RNA 酶的預冷玻璃勻漿器中，各加入 1 mL Trizol，冰上進行勻漿處理，勻漿后按照說明書提取總 RNA，超微量分光光度計測定各組小鼠肺組織所提取的 RNA 總濃度，并調整各組質量濃度為 500 ng/ μL，進行逆轉錄–聚合酶鏈反應（reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR）。逆轉錄反應體系（10 μL）：5×RT 含酶預混液 2 μL，RNA 0.5 μg，無 RNA 酶水補足至總體系 10 μL。逆轉錄條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。PCR 反應體系（25 μL）：2×PCR 含酶預混液 12.5 μL，α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 上下游引物各 0.25 μL，逆轉錄產物模板 2 μL，滅菌超純水 10 μL。PCR 反應條件：預變性 95 ℃ 10 min，變性 95 ℃ 30 s，相應退火溫度 30 s，延伸 72 ℃ 30 s（相應循環數見表 1），末次延伸 72 ℃ 10 min。取 10 μL 相應產物進行 1.0% 瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像系統拍照。采用 Quantity One 軟件分析電泳條帶灰度值，以 β-actin 為基準進行半定量分析。相關引物序列、退火溫度及循環次數見表 1。
表1
引物序列、退火溫度及循環次數
1.3.4 免疫印跡法檢測小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表達
取各組小鼠肺組織各 0.1 g，勻漿后分別對應加入含有適量蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑的 RIPA 強裂解液，冰上裂解 50 min 后以 4 ℃、13 000 r/min 的條件離心 15 min，上清液即為總蛋白，使用 BCA 法測定各組總蛋白濃度后，50 μg/孔上樣，進行 SDS-PAGE 后將蛋白轉移至 PVDF 膜上，以 5% 脫脂奶粉 20 mL 室溫封閉 1 h。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。分別加入 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 及 β-actin 一抗，4 ℃ 孵育過夜。使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。加入 HRP 標記的二抗 37 ℃ 孵育 1 h，再使用 1×TBST 洗膜 3 次，每次 10 min。化學發光試劑檢測蛋白印跡條帶，采用 Quantity One 軟件分析電泳條帶灰度值，以 β-actin 為基準進行半定量分析。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。所有數據均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態性檢驗后以均數±標準差（±s）表示。若計量資料符合正態分布、方差齊，則多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較采用 Bonferroni 檢驗法；若計量資料符合正態分布、但方差不齊，則多組間比較采用 Welch 檢驗法，兩兩比較采用 Games-Howell 檢驗法。顯著性水準 α=0.05，雙側檢驗。
2 結果
2.1 小鼠肺組織病理學改變
2.1.1 肺組織 HE 染色及炎癥損傷評分
HE 染色結果見圖 1。三組小鼠肺組織炎癥損傷評分依次為（1.8±0.8）分、（8.6±0.9）分、（2.6±0.9）分，差異具有統計學意義（F=90.087，P=0.000）。博來霉素組肺組織炎癥損傷評分較對照組升高（P<0.01），吉非替尼組肺組織炎癥損傷評分較博來霉素組下降（P<0.01），與對照組無顯著性差異（P=0.522）。
圖1
小鼠肺組織病理檢查像（HE×200）
a. 對照組：肺組織的結構完整而清晰，肺泡壁較連續且薄，肺泡無明顯的炎癥細胞浸潤；b. 博來霉素組：肺組織出現彌漫性實變，肺泡壁增厚明顯，肺泡間隔破壞，肺泡中可見大量炎癥細胞浸潤，較多成纖維細胞出現在肺間質；c. 吉非替尼組：肺組織結構輕度紊亂，可見少量炎癥細胞浸潤
2.1.2 肺組織 Masson 染色及纖維化程度評分
Masson 染色結果見圖 2。三組小鼠肺組織纖維化病理評分依次為（1.4±0.5）分、（5.6±1.1）分、（2.8±0.4）分，差異具有統計學意義（F=38.111，P=0.000）。博來霉素組纖維化程度評分較對照組升高（P<0.01），吉非替尼組纖維化程度評分較博來霉素組下降（P<0.01），較對照組升高（P<0.05）。
圖2
小鼠肺組織病理檢查像（Masson×200）
a. 對照組：肺組織結構完整而清晰，未出現明顯炎癥細胞浸潤及藍色的膠原沉積；b. 博來霉素組：肺組織結構紊亂，肺間質可見炎癥細胞浸潤，上皮下的藍色膠原沉積明顯增加；c. 吉非替尼組：肺組織的肺泡壁稍增厚，有少量炎癥細胞浸潤，但結構基本完整，伴有少量藍色膠原沉積
2.2 小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 的表達
肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表達的 RT-PCR 結果見圖 3a，半定量分析結果見圖 3b及表 2。
圖3
小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 表達
a. RT-PCR 結果電泳條帶圖；b. 相對表達水平。與博來霉素組比較，*
表2
小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 mRNA 相對表達水平（）
2.3 小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表達
肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白表達的免疫印跡檢測結果見圖 4a 及圖 5a，半定量分析結果見圖 4b、5b 及表 3。
圖4
肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白的表達
a. 免疫印跡檢測電泳條帶圖；b. 相對表達水平。與博來霉素組比較，*
圖5
小鼠肺組織 p-Foxo3a 與 Foxo3a 蛋白的表達
a. 免疫印跡檢測電泳條帶圖；b. Foxo3a 蛋白磷酸化水平。與博來霉素組比較，*
表3
小鼠肺組織 α-SMA、E-cadherin、HMGB1、Foxo3a、FoxM1、Snail1 蛋白相對表達水平及 Foxo3a 蛋白磷酸化水平（）
3 討論
肺纖維化的病理生理過程錯綜復雜，合理運用動物模型盡可能重現其病理生理過程，是更準確有效地探究肺纖維化治療方法的重要前提。博來霉素致肺纖維化模型是公認的較成熟的模型，能夠反映人類肺纖維化的病理特點[16]。科研人員多采用單次氣管內滴入博來霉素這一經典方法來復制肺纖維化模型[17]，該方法具有給藥次數少、劑量小、造模時間短、經濟成本較低等優點[18]。在保證實驗研究科學性的基礎上，出于對經濟成本、操作簡便性以及保持與本實驗室前期研究的連貫性等方面的考慮，本次研究依然采用氣管內滴入博來霉素的經典方法來建立小鼠肺纖維化模型。本實驗所采用的造模與干預試驗方法參考吉非替尼抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化的實驗研究[10]。而鑒定肺纖維化體外模型成功的金標準目前尚未明確，常用的方法有觀察細胞形態、檢測膠原含量與對 TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Ⅲ型膠原蛋白、α-SMA、E-cadherin 等指標的檢測，而 α-SMA 是間充質細胞表型的標志物之一，其表達對于肌成纖維細胞代謝和形態學特性維持起重要作用，其表達增加是 EMT 的標志[19]。E-cadherin 是上皮細胞黏附和表型的標志物之一，其減少和丟失是 EMT 的標志，從而形成纖維化[20]。EMT 可以由多種轉錄因子所調控，如 Snail、Slug 等，可以抑制 E-cadherin 的表達，這些分子開關都可以被 FoxM1 所調控[21]。亦有研究發現，FoxM1 是 Foxo3a 的直接轉錄靶點，PI3K-AKT-FOXO 信號通路的重要下游效應物[22]。另有研究顯示，FoxM1 是吉非替尼作用的一個下游分子靶點，在乳腺癌細胞中吉非替尼可以通過激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表達[23]。Snail1 主要表達于上皮細胞，被激活后進入胞核與 E-cadherin 啟動子中特異性 DNA 序列 E-box 元件結合后，可抑制 E-cadherin 的基因轉錄與蛋白表達，最終導致 EMT 的發生[24]。研究表明，HMGB1 參與炎癥反應，且能誘導Ⅱ型肺泡上皮細胞發生間質細胞轉分化，從上皮細胞向肌成纖維細胞轉化并且表達 α-SMA，與組織纖維化密切相關[25]。我們推測，Foxo3a 通過負調控 FoxM1 與 Snail1 來抑制肺纖維化 EMT。因此，本研究先復制博來霉素致小鼠肺纖維化模型，并予吉非替尼干預，借助 HE 染色與 Masson 染色等組織病理學方法評估各組小鼠肺組織炎癥程度與纖維化程度、RT-PCR 與免疫印跡法檢測 α-SMA、E-cadherin 表達情況以評估肺纖維化 EMT 形成與否，以 HMGB1 表達水平輔助評估肺組織炎癥程度；在成功復制模型后，再檢測 Foxo3a、p-Foxo3a、FoxM1、Snail1 的表達水平，初步探究肺纖維化中 Foxo3a 的下游通路。
由于目前還沒有一種公認的方法可以使肺纖維化在已形成后逆轉，此次研究仍然沿用傳統的干預方案，將吉非替尼的干預持續于 14 d 的整個造模過程中，即本研究所觀察到的 TKI 的數據是作用于肺泡急性損傷階段和肺纖維化兩個階段的[26]。在本研究中，HE 染色及 Masson 染色結果顯示，與對照組相比，博來霉素組小鼠的肺部炎癥損傷程度評分及纖維化程度評分上調。RT-PCR 與免疫印跡檢測結果則顯示，一方面，HMGB1 基因與蛋白水平上調，此從分子學水平上反映了小鼠肺部炎癥程度；另一方面，α-SMA 基因與蛋白表達水平上調，E-cadherin 基因與蛋白表達水平下調，提示 EMT 形成，本研究成功復制了博來霉素致肺纖維化小鼠模型。這與相關的既往研究結果相符[10-11]。本研究還發現在博來霉素誘導的肺纖維化小鼠肺組織中 HMGB1、α-SMA 基因與蛋白表達均上調，在吉非替尼干預后 HMGB1、α-SMA 基因與蛋白表達均下調，兩者的表達變化相一致。蔡琳等[25]的研究結果顯示 HMGB1 表達增加可以活化間質標志物 α-SMA 的表達，本研究及文獻結果均提示 α-SMA 可能受上游的 HMGB1 調控。此外，還有研究顯示 HMGB1 可以作為壞死細胞的死亡標志物，還是炎癥反應的關鍵分子[27]。因此，我們推測 HMGB1 可能通過其在 EMT 與炎癥反應兩個方面的變化影響著肺纖維化。
Foxo3a 可以被 PI3K/Akt 通路中活化的 Akt 磷酸化而失活，參與調控 EMT 的效應蛋白的基因如 Snails、Twist 等的表達[28]，表現為成纖維細胞增殖及Ⅰ型膠原的沉積[29]。在本研究中，與博來霉素組相比，吉非替尼組小鼠 p-Foxo3a 蛋白表達水平呈下降趨勢，Foxo3a 基因與蛋白表達水平皆有上升趨勢，但 Foxo3a 蛋白磷酸化水平下調，即活性增加；吉非替尼組肺組織炎癥損傷程度及纖維化程度減輕，α-SMA 基因與蛋白水平下調，此變化趨勢與 Foxo3a 活性變化相反；吉非替尼組 E-cadherin 基因與蛋白水平上調，此與 Foxo3a 活性變化相同。另有研究發現，敲低 Foxo3a 后，人腎小管上皮細胞 EMT 的關鍵指標 E-cadherin 蛋白含量明顯減少，而 α-SMA 蛋白含量與陰性對照組相比顯著增加[30]。這提示 Foxo3a 對 EMT 過程有負性調控作用。因此，我們推測吉非替尼可通過抑制 Foxo3a 磷酸化，使 Foxo3a 水平升高，活性增加，來抑制肺纖維化，這與彭婷等[12]的研究結果一致。但 Foxo3a 在肺纖維化 EMT 中的下游通路尚不清楚，且目前國內外亦鮮有對 Foxo3a 在肺纖維化中的作用機制的研究報道。
前文已提及 Snail1 與 FoxM1 可能是 Foxo3a 的下游分子。本研究發現，博來霉素組小鼠 Foxo3a 蛋白磷酸化水平上調（活性減少），Snail1 基因與蛋白水平上調，伴隨著 E-cadherin 基因與蛋白水平的下調與 α-SMA 基因與蛋白水平的上調；予以 EGFR 酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼后，Foxo3a 蛋白磷酸化水平下調（活性增加），Snail1 基因與蛋白水平下調，E-cadherin 基因與蛋白水平上調，α-SMA 基因與蛋白水平下調。即 Snail1 基因與蛋白水平變化與 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、α-SMA 表達水平變化互相平行，卻與 Foxo3a 活性變化、E-cadherin 表達變化相反。研究表明，Snail1 是一種含鋅指蛋白的轉錄因子，它能與 E-cadherin 或其他基因啟動子上的特異性 DNA 序列 E-box 結合，抑制基因轉錄從而誘導 EMT，是所有激活 EMT 過程的中心媒介[31]。而本研究及本實驗室前期研究[12]亦均證實了 Foxo3a 活性增加可上調 E-cadherin 表達，下調 α-SMA 表達，從而抑制肺纖維化。故我們推測，Foxo3a 通過負調控 Snail1 表達來緩解博來霉素誘導的小鼠肺纖維化。
FoxM1 屬于 Fox 家族中的一員，可以調控細胞的增殖、成熟、死亡等生理病理過程[32]。有研究提示 FoxM1 可能通過上調 Snail 來抑制 E-cadherin，從而促進非小細胞肺癌 EMT 的發生[5]。金成等[33]發現在人結腸癌組織中 FoxM1 高表達而 E-cadherin 低表達。于水等[34]發現 FoxM1 可調控 Snail1 以促進肝癌 EMT。以上研究均提示 FoxM1 與 Snail1 之間可能呈正調控關系。為了進一步探索 Foxo3a 與 Snail1 的關系，本研究檢測了各組小鼠肺組織中 FoxM1 基因與蛋白表達水平。結果顯示博來霉素組小鼠肺組織中 FoxM1 基因與蛋白表達水平呈上升趨勢，Snail1 基因與蛋白表達水平上調；予以吉非替尼干預后，吉非替尼組小鼠肺組織 FoxM1 基因與蛋白表達水平卻較博來霉素組小鼠的輕微升高，而 Snail1 基因與蛋白表達水平下調，此時 FoxM1 與 Snail1 的表達水平并非如預期一樣地呈正相關關系。同時，吉非替尼組小鼠 FoxM1 表達水平與 Foxo3a 活性變化趨勢相同，這亦與 McGovern 等[23]發現吉非替尼能通過激活 Foxo3a 抑制 FoxM1 表達的研究結果并不相符。為了解決這一疑惑，我們查閱相關文獻發現人類 FoxM1 的蛋白表達存在著 A、B、C 三種剪接異構體。FoxM1A 不具有轉錄活性，在細胞中表達很低；FoxM1B 和 FoxM1C 具有轉錄活性，在腫瘤組織中有高表達，但在某些方面具有不同的生物學功能[35-36]。譚擁軍等[37]在轉錄因子 FoxM1 剪接異構體在乳腺癌 EMT 過程中的研究中發現 FoxM1B 促進 EMT 的發生，FoxM1C 卻能抑制 EMT 的發生，FoxM1B 與 FoxM1C 作為 FoxM1 的剪接異構體具有完全相反的功能。本研究中吉非替尼組小鼠肺組織 FoxM1 基因與蛋白表達水平僅較對照組與博來霉素組小鼠的輕微上升，差異并無統計學意義，但其 Foxo3a 蛋白磷酸化水平卻顯著下調，即 Foxo3a 活性增加。這提示在此研究中 Foxo3a 活性的增加可能并未明顯影響 FoxM1 的基因轉錄與蛋白表達水平。因此，我們推測小鼠肺組織中 FoxM1 可能也存在剪接異構體，Foxo3a 可能通過調節 FoxM1 不同剪接異構體之間的比例來調控其下游通路，但具體的調控機制仍待進一步研究去闡明。另外，FoxM1 基因與蛋白表達水平的趨勢不明顯是否由各組實驗小鼠數目不夠多所致，有待深入研究。
本研究通過采用氣管內滴入博來霉素的經典方法來建立小鼠肺纖維化模型，首次探討了在肺纖維化中與 Foxo3a 相關的下游信號通路。本研究表明，Foxo3a 蛋白磷酸化水平以及 Snail1 基因與蛋白水平在博來霉素致肺纖維化小鼠肺組織中的表達變化與肺纖維化程度變化趨勢一致，而在 EGFR-TKI 代表藥物吉非替尼減輕博來霉素誘導的肺纖維化過程的同時，伴隨著 Foxo3a 蛋白磷酸化水平、Snail1 基因與蛋白水平的下調。因此，我們推測 Foxo3a 活性增加可下調 Snail1，使得 α-SMA 表達降低、E-cadherin 表達升高，從而減輕博來霉素誘導的小鼠肺纖維化，其機制可能與 Foxo3a 通過調節 FoxM1 不同剪接異構體之間的比例來調控其下游通路有關。本研究或可撥開肺纖維化發病機制上的重重迷霧，找到肺纖維化的關鍵靶點，為該病的防治貢獻一點綿薄之力。但本研究僅為初步研究，Foxo3a 是否通過調控 FoxM1 不同剪接異構體之間比例來抑制 Snail1，后續或需通過檢測 FoxM1 不同剪接異構體的 mRNA 與蛋白表達水平等進一步研究加以求證。同時應增加各組實驗小鼠樣本量，使得目的基因的表達趨勢變化更加明顯。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
