引用本文： 鐘有清, 周向東, 李琪, 覃英嬌. TLR5 rs5744174 基因多態性與肺炎鏈球菌肺炎的相關性. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(4): 342-345. doi: 10.7507/1671-6205.201908050 復制
肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，可由理化因素、免疫損傷、過敏及細菌、真菌、病毒、寄生蟲等致病微生物等因素引起[1]。肺炎鏈球菌肺炎是肺炎的一種常見類型，也是最常見的感染性疾病，其發病率及病死率均較高，對兒童及老人健康的威脅極大[2]。研究表明，肺炎鏈球菌肺炎與肺組織炎癥反應密切相關[3]。Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）是識別各種病原體及宿主細胞感染的一種跨膜蛋白，能夠參與調控細菌及病毒的感染過程，在人體調控炎癥反應中具有重要的作用。Cao 等[4]研究表明，TLR5 基因的多態性可能與乙肝病毒感染性相關的嚴重肝病的發展有關。然而 TLR5 基因的多態性是否與肺炎鏈球菌肺炎有關，目前尚鮮有報道。基于此，本研究通過分析 TLR5 rs5744174 基因多態性，以期探討其與肺炎鏈球菌肺炎的相關性。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取 2014 年 1 月至 2018 年 10 月本院收治的 106 例肺炎鏈球菌肺炎患者為觀察組研究對象，其中男 61 例，女 45 例，年齡 40～75 歲，平均年齡（64.0±15.3）歲。納入標準：（1）符合肺炎鏈球菌肺炎診斷標準[5]；（2）經臨床、實驗室檢查等確診為肺炎鏈球菌肺炎；（3）患者均已簽署知情同意書。排除標準：（1）伴有免疫缺陷或自身免疫性疾病；（2）伴有惡性腫瘤疾病患者；（3）伴有呼吸道結構異常患者；（4）伴有肺纖維化、哮喘疾病患者；（5）原發性纖毛運動障礙、膿毒癥等其他器官嚴重疾病患者。
同期選取在本院參與體檢的 85 例正常人作為對照組研究對象，男 47 例，女 38 例，年齡 40～69 歲，平均年齡（58.2±14.3）歲。兩組受試者性別、體重指數（body mass index，BMI）、高血壓、高血脂、冠心病等一般資料相比，差異無統計學意義（均P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 臨床資料的收集
分別于肺炎鏈球菌肺炎患者入院當天及健康體檢者體檢當日收集受試者的臨床資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙、嗜酒、高血壓、高血脂、糖尿病、冠心病等。
1.2.2 基因組 DNA 提取
分別抽取受試者肘靜脈血 2 mL 于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用 DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA，提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行，DNA 提取試劑盒購自北京紐樸生物技術有限公司。
1.2.3 DNA 分離與基因分型
通過 PCR 測序，確定 TLR5 rs5744174 的基因型，引物由 Program Primer 5 和 NCBI 數據庫設計，并由上海生工生物工程有限公司合成。TLR5 rs5744174 引物序列：上游 5’-CCCCTTCAGAGAATCCCAGC-3’，下游引物 5’-ACCTGGGGATGGTCCTTGAAC-3’。反應體系 50 μL，反應條件：95 ℃ 2 min 擴增，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共 42 個循環；最后 72 ℃ 5 min 延伸。最后根據測序結果的峰值數據確定單核苷酸多態性。
1.2.4 支氣管肺泡灌洗液的采集
觀察組患者分別于病變肺段快速注入滅菌后的生理鹽水，每次灌洗量 20～50 mL，共灌洗 3 次，通過 25～100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）負壓將第二次的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）吸引至無菌管中，BALF 立即進行檢測或及時保存于冰盒中，及時待檢。
1.2.5 BALF 中細胞分類計數及 C 反應蛋白水平檢測
將 BALF 充分混勻后，在離心機上離心 10 min（4 ℃，1200 r/min），取上清液檢測 C 反應蛋白（C reactive protein，CRP）的水平，檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，檢測步驟參見試劑盒說明書。取離心后的細胞沉淀成分，用不含 Ca2+、Ma2+ 的 Hank’s 液沖洗，并離心 2 次，棄去上清后，加 Hank’s 液 1 mL 制成細胞懸液。取 200 μL 細胞懸液于 1.5 mL 離心管中，加入 20 μL 臺盼藍染色 3 min，染色結束后，在 Countstar 計數板上計白細胞總數，細胞經瑞氏染色后涂片，并置于光學顯微鏡下進行計數，每張涂片均隨機選擇 3 個視野，每個視野隨機選擇 100 個細胞，分別統計并計算中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的百分比。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 進行數據分析。計量資料先進行正態分布檢驗，符合正態分布，采用均數±標準差（
±s）進行描述。進行方差齊性檢驗，若方差齊，兩組數據的組間比較采用 t 檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
觀察組與對照組性別、BMI、高血壓、高血脂、冠心病比例相比，差異無統計學意義（均 P>0.05）；觀察組與對照組年齡、吸煙、嗜酒、糖尿病比例相比，差異有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 1。
表1
觀察組與對照組一般資料（
）
2.2 TLR5 rs5744174 基因型和等位基因頻率比較
觀察組與對照組 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗水準（觀察組 χ2=16.89，對照組 χ2=10.76，P>0.05），觀察組與對照組 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布頻率相比，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 2。
表2
TLR5 rs5744174 基因型和等位基因頻率比較
2.3 TLR5 rs5744174 各基因型間臨床資料比較
肺炎鏈球菌肺炎患者三種基因型間性別、年齡、吸煙、嗜酒、高血壓、高血脂、冠心病等臨床資料相比較，差異無統計學意義（均P>0.05）；糖尿病比例相比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 3。
表3
TLR5 rs5744174 各基因型間臨床資料比較（
）
2.4 TLR5 rs5744174 各基因型間 BALF 指標比較
肺炎鏈球菌肺炎患者三種基因型間 BALF 中中性粒細胞百分比、CRP 水平相比較，差異有統計學意義（均 P<0.05）；白細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、巨噬細胞百分比水平相比，差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見表 4。
表4
TLR5 rs5744174 各基因型間 BALF 指標比較（
）
3 討論
肺炎鏈球菌為革蘭陽性球菌，是人類呼吸道的主要致病菌，是導致中耳炎、肺炎、腦膜炎及菌血癥的主要原因。肺炎鏈球菌可在呼吸道自體轉移，當機體抵抗力降低或機體免疫功能受損時，有毒力的肺炎鏈球菌可進入組織、血液，進而導致感染的發生[6]。其中肺炎鏈球菌肺炎在兒童及老人中發病率較高，是臨床威脅人類健康的重要傳染性疾病之一[7]。研究表明，不同基因背景可能影響肺炎患者炎癥的反應強度[8]。然而，目前肺炎鏈球菌肺炎的發病機制尚未明確，與宿主遺傳因素的關系仍有待探究。
TLRs 基因是是一類跨膜受體，通過對病原體相關分子模式的識別及信號級聯反應，可啟動激活信號轉導途徑，介導機體的天然免疫和獲得性免疫，誘導免疫效應分子表達[9]。目前研究較多的 TLRs 是 TLR2、TLR4 與 TLR5。TLR5 作為 TLRs 中的一員，主要通過革蘭陽/陰性菌的菌毛結合蛋白識別，激活免疫信號通路，在菌毛蛋白識別中具有重要作用[10]。王偉等[11]研究表明，TLR5 rs5744174 的基因型頻率在卒中風痰瘀阻證患者與健康對照組之間的分布差異有統計學意義。龔愛媚等[12]研究表明廣西人抗中性粒細胞胞漿抗體相關性小血管炎與健康對照組中 TLR5 rs2072493 基因型（AA、AG、GG）及等位基因頻率相比，差異無統計學意義。本研究結果顯示，觀察組與對照組 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗水準，觀察組與對照組 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布頻率差異無統計學意義，提示 TLR5 rs5744174 基因型可能與肺炎鏈球菌肺炎的發生無關。進一步研究結果顯示，肺炎鏈球菌肺炎患者三種基因型（CC、CT、TT）間合并糖尿病比例差異有統計學意義，提示肺炎鏈球菌肺炎患者并發糖尿病可能與 T 等位基因的存在有一定關系。
肺炎鏈球菌感染后，通常可產生大量的炎癥細胞因子及免疫介質，導致免疫功能發生紊亂[13]。本研究結果顯示，三種基因型（CC、CT、TT）肺炎鏈球菌肺炎患者 BALF 中中性粒細胞百分比、CRP 水平差異有統計學意義。BALF 中含有炎癥因子與免疫細胞，其中中性粒細胞是 BALF 白細胞中的一種，與感染有關[14]。CRP 是肺炎鏈球菌細胞壁 C 多糖蛋白，是一種典型的急性時相期蛋白，也是介導炎癥反應發生的最重要的炎性分子，可作為反映肺炎鏈球菌肺炎患者炎癥狀態的標志物[15]。以上結果提示 TLR5 rs5744174 基因多態性可能與肺炎鏈球菌肺炎患者體內炎癥程度有關。
綜上所述，TLR5 rs5744174 基因多態性與肺炎鏈球菌肺炎的發生可能無關，但 TLR5 rs5744174 基因多態性與合并糖尿病發生、BALF 中中性粒細胞百分比、CRP 等水平有關，可能影響鏈球菌肺炎患者疾病轉歸情況。然而本研究樣本數量較少，下一步準備擴大樣本容量，進一步就 TLR5 相關多態性位點及其與肺炎鏈球菌易感性的關系進行深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺炎是指終末氣道、肺泡和肺間質的炎癥，可由理化因素、免疫損傷、過敏及細菌、真菌、病毒、寄生蟲等致病微生物等因素引起[1]。肺炎鏈球菌肺炎是肺炎的一種常見類型，也是最常見的感染性疾病，其發病率及病死率均較高，對兒童及老人健康的威脅極大[2]。研究表明，肺炎鏈球菌肺炎與肺組織炎癥反應密切相關[3]。Toll 樣受體（toll-like receptors，TLRs）是識別各種病原體及宿主細胞感染的一種跨膜蛋白，能夠參與調控細菌及病毒的感染過程，在人體調控炎癥反應中具有重要的作用。Cao 等[4]研究表明，TLR5 基因的多態性可能與乙肝病毒感染性相關的嚴重肝病的發展有關。然而 TLR5 基因的多態性是否與肺炎鏈球菌肺炎有關，目前尚鮮有報道。基于此，本研究通過分析 TLR5 rs5744174 基因多態性，以期探討其與肺炎鏈球菌肺炎的相關性。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取 2014 年 1 月至 2018 年 10 月本院收治的 106 例肺炎鏈球菌肺炎患者為觀察組研究對象，其中男 61 例，女 45 例，年齡 40～75 歲，平均年齡（64.0±15.3）歲。納入標準：（1）符合肺炎鏈球菌肺炎診斷標準[5]；（2）經臨床、實驗室檢查等確診為肺炎鏈球菌肺炎；（3）患者均已簽署知情同意書。排除標準：（1）伴有免疫缺陷或自身免疫性疾病；（2）伴有惡性腫瘤疾病患者；（3）伴有呼吸道結構異常患者；（4）伴有肺纖維化、哮喘疾病患者；（5）原發性纖毛運動障礙、膿毒癥等其他器官嚴重疾病患者。
同期選取在本院參與體檢的 85 例正常人作為對照組研究對象，男 47 例，女 38 例，年齡 40～69 歲，平均年齡（58.2±14.3）歲。兩組受試者性別、體重指數（body mass index，BMI）、高血壓、高血脂、冠心病等一般資料相比，差異無統計學意義（均P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 臨床資料的收集
分別于肺炎鏈球菌肺炎患者入院當天及健康體檢者體檢當日收集受試者的臨床資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙、嗜酒、高血壓、高血脂、糖尿病、冠心病等。
1.2.2 基因組 DNA 提取
分別抽取受試者肘靜脈血 2 mL 于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用 DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA，提取過程嚴格按照試劑盒說明書進行，DNA 提取試劑盒購自北京紐樸生物技術有限公司。
1.2.3 DNA 分離與基因分型
通過 PCR 測序，確定 TLR5 rs5744174 的基因型，引物由 Program Primer 5 和 NCBI 數據庫設計，并由上海生工生物工程有限公司合成。TLR5 rs5744174 引物序列：上游 5’-CCCCTTCAGAGAATCCCAGC-3’，下游引物 5’-ACCTGGGGATGGTCCTTGAAC-3’。反應體系 50 μL，反應條件：95 ℃ 2 min 擴增，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 70 s，共 42 個循環；最后 72 ℃ 5 min 延伸。最后根據測序結果的峰值數據確定單核苷酸多態性。
1.2.4 支氣管肺泡灌洗液的采集
觀察組患者分別于病變肺段快速注入滅菌后的生理鹽水，每次灌洗量 20～50 mL，共灌洗 3 次，通過 25～100 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）負壓將第二次的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）吸引至無菌管中，BALF 立即進行檢測或及時保存于冰盒中，及時待檢。
1.2.5 BALF 中細胞分類計數及 C 反應蛋白水平檢測
將 BALF 充分混勻后，在離心機上離心 10 min（4 ℃，1200 r/min），取上清液檢測 C 反應蛋白（C reactive protein，CRP）的水平，檢測試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司，檢測步驟參見試劑盒說明書。取離心后的細胞沉淀成分，用不含 Ca2+、Ma2+ 的 Hank’s 液沖洗，并離心 2 次，棄去上清后，加 Hank’s 液 1 mL 制成細胞懸液。取 200 μL 細胞懸液于 1.5 mL 離心管中，加入 20 μL 臺盼藍染色 3 min，染色結束后，在 Countstar 計數板上計白細胞總數，細胞經瑞氏染色后涂片，并置于光學顯微鏡下進行計數，每張涂片均隨機選擇 3 個視野，每個視野隨機選擇 100 個細胞，分別統計并計算中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞的百分比。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 21.0 進行數據分析。計量資料先進行正態分布檢驗，符合正態分布，采用均數±標準差（±s）進行描述。進行方差齊性檢驗，若方差齊，兩組數據的組間比較采用 t 檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
觀察組與對照組性別、BMI、高血壓、高血脂、冠心病比例相比，差異無統計學意義（均 P>0.05）；觀察組與對照組年齡、吸煙、嗜酒、糖尿病比例相比，差異有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 1。
表1
觀察組與對照組一般資料（）
2.2 TLR5 rs5744174 基因型和等位基因頻率比較
觀察組與對照組 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗水準（觀察組 χ2=16.89，對照組 χ2=10.76，P>0.05），觀察組與對照組 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布頻率相比，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 2。
表2
TLR5 rs5744174 基因型和等位基因頻率比較
2.3 TLR5 rs5744174 各基因型間臨床資料比較
肺炎鏈球菌肺炎患者三種基因型間性別、年齡、吸煙、嗜酒、高血壓、高血脂、冠心病等臨床資料相比較，差異無統計學意義（均P>0.05）；糖尿病比例相比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 3。
表3
TLR5 rs5744174 各基因型間臨床資料比較（）
2.4 TLR5 rs5744174 各基因型間 BALF 指標比較
肺炎鏈球菌肺炎患者三種基因型間 BALF 中中性粒細胞百分比、CRP 水平相比較，差異有統計學意義（均 P<0.05）；白細胞總數、嗜酸性粒細胞百分比、淋巴細胞百分比、巨噬細胞百分比水平相比，差異無統計學意義（均 P>0.05）。結果見表 4。
表4
TLR5 rs5744174 各基因型間 BALF 指標比較（）
3 討論
肺炎鏈球菌為革蘭陽性球菌，是人類呼吸道的主要致病菌，是導致中耳炎、肺炎、腦膜炎及菌血癥的主要原因。肺炎鏈球菌可在呼吸道自體轉移，當機體抵抗力降低或機體免疫功能受損時，有毒力的肺炎鏈球菌可進入組織、血液，進而導致感染的發生[6]。其中肺炎鏈球菌肺炎在兒童及老人中發病率較高，是臨床威脅人類健康的重要傳染性疾病之一[7]。研究表明，不同基因背景可能影響肺炎患者炎癥的反應強度[8]。然而，目前肺炎鏈球菌肺炎的發病機制尚未明確，與宿主遺傳因素的關系仍有待探究。
TLRs 基因是是一類跨膜受體，通過對病原體相關分子模式的識別及信號級聯反應，可啟動激活信號轉導途徑，介導機體的天然免疫和獲得性免疫，誘導免疫效應分子表達[9]。目前研究較多的 TLRs 是 TLR2、TLR4 與 TLR5。TLR5 作為 TLRs 中的一員，主要通過革蘭陽/陰性菌的菌毛結合蛋白識別，激活免疫信號通路，在菌毛蛋白識別中具有重要作用[10]。王偉等[11]研究表明，TLR5 rs5744174 的基因型頻率在卒中風痰瘀阻證患者與健康對照組之間的分布差異有統計學意義。龔愛媚等[12]研究表明廣西人抗中性粒細胞胞漿抗體相關性小血管炎與健康對照組中 TLR5 rs2072493 基因型（AA、AG、GG）及等位基因頻率相比，差異無統計學意義。本研究結果顯示，觀察組與對照組 TLR5 rs5744174 基因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律檢驗水準，觀察組與對照組 TLR5 rs5744174（C<T）基因型及等位基因分布頻率差異無統計學意義，提示 TLR5 rs5744174 基因型可能與肺炎鏈球菌肺炎的發生無關。進一步研究結果顯示，肺炎鏈球菌肺炎患者三種基因型（CC、CT、TT）間合并糖尿病比例差異有統計學意義，提示肺炎鏈球菌肺炎患者并發糖尿病可能與 T 等位基因的存在有一定關系。
肺炎鏈球菌感染后，通常可產生大量的炎癥細胞因子及免疫介質，導致免疫功能發生紊亂[13]。本研究結果顯示，三種基因型（CC、CT、TT）肺炎鏈球菌肺炎患者 BALF 中中性粒細胞百分比、CRP 水平差異有統計學意義。BALF 中含有炎癥因子與免疫細胞，其中中性粒細胞是 BALF 白細胞中的一種，與感染有關[14]。CRP 是肺炎鏈球菌細胞壁 C 多糖蛋白，是一種典型的急性時相期蛋白，也是介導炎癥反應發生的最重要的炎性分子，可作為反映肺炎鏈球菌肺炎患者炎癥狀態的標志物[15]。以上結果提示 TLR5 rs5744174 基因多態性可能與肺炎鏈球菌肺炎患者體內炎癥程度有關。
綜上所述，TLR5 rs5744174 基因多態性與肺炎鏈球菌肺炎的發生可能無關，但 TLR5 rs5744174 基因多態性與合并糖尿病發生、BALF 中中性粒細胞百分比、CRP 等水平有關，可能影響鏈球菌肺炎患者疾病轉歸情況。然而本研究樣本數量較少，下一步準備擴大樣本容量，進一步就 TLR5 相關多態性位點及其與肺炎鏈球菌易感性的關系進行深入研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
