引用本文： 孫亮, 李鑫, 姬文婕, 魏路清. KLF4、單核/巨噬細胞亞群在間質性肺疾病中的變化及可能的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(5): 467-473. doi: 10.7507/1671-6205.201907018 復制
Krüppel 樣因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是參與單核巨噬細胞亞群調控的重要轉錄因子。本課題組的前期研究證實 KLF4、單核巨噬細胞亞群在博來霉素致肺纖維化進程中均呈現動態變化，同時發現阿托伐他汀能夠影響博來霉素小鼠肺纖維化模型肺組織 KLF4 的表達[1]。但 KLF4 參與的單核巨噬細胞亞群調控是否在肺纖維化患者發病過程中發揮作用，目前仍未闡明。因此本課題意圖從臨床基礎角度出發，觀察肺纖維化患者 KLF4、單核– 巨噬細胞亞群變化與肺功能的關系；并進一步深化前期的研究工作，探討 KLF4 參與的單核巨噬細胞亞群調控與肺纖維化發生發展的關系，為尋找肺纖維化治療的新靶點奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選取武警特色醫學中心 2015 年 5 月至 2017 年 1 月住院治療的患者（肺纖維化組）、同期健康體檢者（外周血單核細胞亞群及 KLF4 對照組，對照 A 組）以及需行支氣管鏡檢查的慢性咳嗽且無肺纖維化患者（肺泡灌洗液巨噬細胞亞群對照組，對照 B 組）。本研究由武警特色醫學中心研究倫理委員會批準，保證患者入院后的各項檢查措施符合診療常規，包括常規抽血、高分辨率 CT、肺功能檢測及支氣管鏡檢查），各項檢查前均簽署書面知情同意書。所有檢查結果回報后，病例在武警特色醫學中心呼吸與重癥醫學科醫生辦公室討論決定最終診斷，討論醫生包括呼吸科醫師、風濕免疫科醫師、病理科醫師以及放射科醫師。診斷依據：美國胸科協會/歐洲呼吸學會的特發性肺間質纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）診斷及治療指南（2011 版）以及干燥綜合征（圣地亞哥標準）、多發性肌炎/皮肌炎［1975 年 Bohn 和 Peter 提出的診斷標準］、類風濕性關節炎［美國風濕病協會 1987 年修正的分類標準］等疾病的診療標準，決定患者為原發或繼發性間質性肺疾病，并根據高分辨率 CT 診斷典型的 IPF。
肺纖維化組：肺纖維化組包括特發性間質性肺炎和繼發性間質性肺炎，特發性間質性肺炎包括新發的 IPF 和非特異性間質性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）；繼發性間質性肺炎主要選取繼發于結締組織病、影像學主要表現為 NSIP 的間質性肺疾病患者。納入標準：① 均為初診患者；② 年齡 18～70 歲；③ 無嚴重心腦血管疾病；④ 無胸廓畸形及肺部基礎病。排除標準：① 不能耐受支氣管鏡檢查；② 不能耐受肺功能檢查。
外周血單核細胞對照組（對照 A 組）：選取正常人群（在武警特色醫學中心健康體檢者），抽取外周血檢測單核細胞亞群作為對照。納入標準：① 既往體健，無吸煙史，體檢胸部 X 線片及心電圖正常；② 年齡 18～70 歲。排除標準：① 近期出現感冒、肺部感染等疾病；② 肥胖患者（肥胖影響單核細胞分化）[2]。
肺泡灌洗液巨噬細胞對照組（對照 B 組）：需行支氣管鏡檢查的慢性咳嗽且無肺纖維化患者。納入標準：① 既往體健，無吸煙史，不明原因咳嗽超過 8 周，胸部 X 線片及心電圖檢查正常；② 年齡 18～70 歲；③ 支氣管鏡下檢查未見異常；④ 肺功能檢查正常。排除標準：① 近期出現肺部感染；② 不能耐受支氣管鏡檢查。
1.2 方法
1.2.1 主要儀器
肺功能儀（Master Screen Diffusion，德國）；WS-H200 型自動超聲波人體秤（上海，中國）；電子天平-FA 1104（上海，中國）；–80 ℃ 冰箱（Sanyo，日本）；CytomicsFC500 流式細胞儀（Beckman coulter，美國）；漩渦混勻器（IKA，德國）；流式分析試管（BD，美國）；雙人單面凈化工作臺-SW-CJ-2FD 型（蘇州，中國）；血氣分析儀（GEM premier 3000；Instrumentation Laboratory，Bedford，IL，美國）。
1.2.2 主要試劑
（1）異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記鼠抗人 CD45（BD，美國）；（2）藻紅蛋白（phycoerhthrin，PE）標記鼠抗人 CD14（BD，美國）；（3）藻紅蛋白-Cy5 結合物（phycoerhthrin-Cy5 conjugate，PE/Cy5）標記鼠抗人 CD16（BD，美國）；（4）紅細胞裂解（BD，美國）；（5）PE/Cy7 標記鼠抗人 CD41（BD，美國）；（6）Flow-CountTM 熒光微球（Beckman coulter，美國）；（7）磷酸鹽緩沖液（BD，美國）；（8）FITC 標記鼠抗人 CD11b（BD，美國）；（9）PE 標記鼠抗人 CD169（BD，美國）；（10）PE/Cy5 標記大鼠抗小鼠 mIgG1（BD，美國）；（11）PE/Cy5 標記鼠抗人 CD206（BD，美國）；（12）7-氨基放線菌素 D（7-amino-actinomycin D，7-AAD；BD，美國）。
1.2.3 肺功能檢測
（1）準確測量身高和體重；（2）檢查前詢問受試者病史，囑在檢查過程中保持坐位并盡量避免運動；（3）肺彌散功能檢查前先準確測定受試者的肺活量或用力肺活量；（4）向受試者介紹檢查動作，指導受試者依次練習呼氣—深吸氣—屏氣—呼氣等動作。（5）給患者夾上鼻夾；（6）將咬嘴含口上，平靜呼吸 4～5 個循環，待潮氣末基線平穩后，讓患者呼氣至殘氣量位；（7）令受試者在 2 s 內均勻吸氣至肺總量位；（8）接著屏氣 10 s，最后在 2～4 s 內均勻持續中速呼氣完全至殘氣量位。
1.2.4 動脈氧分壓的檢測
清晨留取動脈血，輕輕混勻，應用 GEM premier 3000 血氣自動分析儀行血氣檢測。
1.2.5 流式細胞術檢測外周血單核細胞亞群
1.2.5.1 血液標本制備
（1）研究對象入院后抽取空腹外周靜脈血 5 mL 至抗凝管中，送至實驗室，準備制備血液標本上機檢測；（2）取 600 μL EP 管，標記并編號；（3）檢測管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μLCD16-PE-Cy5 單克隆抗體，對照管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μL mIgG1 PE-Cy5 單克隆抗體，各管再加 30 μL 靜脈全血，混勻（漩渦），室溫、避光，孵育 15 min；（4）溶解紅細胞，向流式試管中加 600 μL 紅細胞裂解液，漩渦混勻，室溫避光反應 10 min；（5）取出 Flow-CountTM 熒光微球，漩渦混勻 10 s，反向加樣法在各標本管中加入 30 μL 熒光微球，漩渦混勻。
1.2.5.2 上機檢測步驟
（1）用熒光微球（Flow-CountTM）校正機器；（2）側向角散射光（side scatter，SSC）和前向角散射光（forward scatter，FSC）雙參數點圖檢測外周血單核細胞亞群；（3）根據 SSC 為縱坐標，CD86-FITC 為橫坐標，建立 SSC-CD86-FITC 散點圖，反向設門法圈出單核細胞亞群；（4）利用 CD16 抗體對照抗體 mIgG1-PE-Cy5 界定陰性細胞；（5）抗 CD86-FITC、CD14-PE、CD16-PE-Cy5 單陽細胞調節補償；（6）利用單核細胞 CD14 和 CD16 表達水平將單核細胞分為 3 個亞群，分別為 CD14++CD16– 亞群（Mon1），CD14++CD16+亞群（Mon2）及 CD14+CD16++亞群（Mon3）；（7）利用 Flowjo 6.2 軟件獲取并分析數據；（8）分析流程圖見圖 1。
圖1
外周血單核細胞分析流程圖
1.2.6 流式細胞術檢測肺泡灌洗液巨噬細胞亞群
1.2.6.1 肺泡灌洗液的獲取及制備
（1）向患者及家屬說明支氣管鏡檢查的目的及意義，取得患者配合后行支氣管鏡檢查，生理鹽水灌洗病變肺，回收肺泡灌洗液；（2）將回收肺泡灌洗液立即用雙層無菌紗布過濾除去黏液，記錄總量；（3）將肺泡灌洗液裝入硅塑瓶滅菌玻璃容器中，置于含有冰塊的保溫瓶中，立即送往實驗室；（4）取肺泡灌洗液 10 mL，經 300 目金屬網過濾去掉雜質和痰液，300 g、5 min 離心后棄上清；（5）用含有 0.5% 胎牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液洗 2 次；（6）取肺泡灌洗液 100 μL 加入 20 μL 熒光抗體，室溫避光孵育 20 min，300 g、5 min 離心后棄上清；（7）加 1∶9 配制的溶血素 2 mL，避光 10 min，200 g、5 min 離心后棄上清；（8）加入磷酸鹽緩沖液 300 g、5 min 離心后棄上清，加 0.5 mL 磷酸鹽緩沖液重懸細胞上機待測。
1.2.6.2 上機檢測
（1）Flow-CountTM 熒光微球校正儀器使其達到最佳工作狀態；（2）經 7-AAD 染色，區分死亡和成活細胞；（3）三色熒光/側向散射光設門（CD11b/SSC-Gating），設置巨噬細胞門并分析巨噬細胞免疫表型；（4）建立 CD11b /SSC 熒光點圖，用 CD11b+細胞群圈門以排除其他成分的干擾，調節 FSC、SSC 電壓，FSC 閾值，FL1-FL2% 、FL2-FL1% 熒光補償，建立 CD206++/CD169+散點圖，根據同型對照設門分析巨噬細胞（CD163+/CD163++）的表達情況，同時計算出 M1/M2 比值；（5）利用 Flowjo 6.2 軟件獲取并分析數據；（6）分選流程圖見圖 2。
圖2
肺泡灌洗液巨噬細胞亞型流式細胞術分選流程圖
1.2.7 酶聯免疫吸附試驗法檢測血清 KLF4 的表達
根據試劑盒說明，在 15 min 內以 450 nm 波長依序測量各樣本的吸光度值；得出并描繪標準物的濃度與吸光度值，計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的吸光度值代入方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，得出樣品的實際濃度。
1.3 統計學方法
不符合正態分布的數據以中位數表示，組間中位數的比較采用 Mann–Whitney U 檢驗。符合正態分布者的數據，以均數±標準差（
±s）表示，采用成組 t 檢驗，否則進行秩和檢驗。檢驗水準為雙側 P<0.05。KLF4 與肺功能（彌散功能）、單核細胞亞群以及肺泡巨噬細胞亞群之間的關系采用相關分析法進行分析。
2 結果
2.1 外周血單核細胞檢測結果
2.1.1 一般情況
肺纖維化組共搜集 36 例，男 12 例，女 24 例，平均年齡（64.3±9.8）歲；進一步亞組分析，發現其中特發性間質性肺炎組患者 18 例（IPF 患者 6 例，NSIP 患者 12 例），簡稱 IPF/NSIP 亞組；繼發性間質性肺炎組患者 18 例，均繼發于結締組織病（干燥綜合征 10 例，繼發于類風濕性關節炎 6 例，繼發于多發性肌炎/皮肌炎 2 例），簡稱 CTD-ILD 亞組；對照 A 組 30 例，男 25 例，女 5 例，平均年齡（35.6±11.5）歲。
2.1.2 肺纖維化組及對照 A 組單核細胞亞群比例結果
肺纖維化組 Mon1 為（79.21±11.51）%，對照 A 組為（84.32±4.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；肺纖維化組 Mon2 為（6.42±4.04）%，對照 A 組為（3.95±0.94）%，差異有統計學意義（P<0.05）；肺纖維化組 Mon3 為（10.12±8.37）%，對照 A 組為（7.41±3.50）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.3 IPF/NSIP 亞組與對照 A 組單核細胞亞群比例結果
亞組分析發現，IPF/NSIP 亞組 Mon1 為（80.73±10.47）%，對照 A 組為（84.32±4.67）%，差異無統計學意義（P>0.05）；IPF/NSIP 亞組 Mon2 為（5.80±3.25）%，對照 A 組為（3.95±0.94）%，差異有統計學意義（P<0.05）；IPF/NSIP 亞組 Mon3 為（10.54±7.60）%，對照 A 組為（7.41±3.50）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.4 CTD-ILD 亞組與對照 A 組單核細胞亞群比例結果
亞組分析發現，CTD-ILD 亞組 Mon1 為（77.68±12.90）%，對照 A 組為（84.32±4.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon2 為（7.03±4.83）%，對照 A 組為（3.95±0.94）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon3 為（9.70±9.52）%，對照 A 組為（7.41±3.50）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.5 CTD-ILD 亞組與 IPF/NSIP 亞組單核細胞亞群比例結果
亞組分析發現，CTD-ILD 亞組 Mon1 為（77.68±12.90）%，IPF/NSIP 亞組為（80.73±10.47）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon2 為（7.03±4.83）%，IPF/NSIP 亞組為（5.80±3.25）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon3 為（9.70±9.52）%，IPF/NSIP 亞組為（10.54±7.60）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.6 肺纖維化組外周血單核細胞亞群與 DLCO 及 PaO2 的相關關系
相關分析發現單核細胞三個亞型分化比例與患者 DLCO 及 PaO2 之間無相關性。結果見表 1。
表1
肺纖維化組外周血單核細胞亞群與 DLCO 及 PaO2 的相關關系
2.2 肺泡灌洗液巨噬細胞細胞檢測結果
2.2.1 一般情況
肺纖維化組共搜集 23 例支氣管肺泡灌洗液，男 10 例，女 13 例，平均年齡（63.6±7.5）歲；進一步亞組分析發現，其中特發性間質性肺炎 14 例（IPF 4 例，NSIP 10 例），簡稱 IPF/NSIP 亞組；繼發性間質性肺炎患者 9 例，均繼發于結締組織病（繼發于干燥綜合征 4 例，繼發于類風濕性關節炎 3 例，繼發于多發性肌炎/皮肌炎 2 例），簡稱 CTD-ILD 亞組；對照 B 組 10 例，男 5 例，女 5 例，平均年齡（41.4±10.7）歲。
2.2.2 肺纖維化組及對照 B 組巨噬細胞亞群比例結果
肺纖維化組 M1 為（24.42±13.95）%，對照 B 組為（47.02±21.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；肺纖維化組 M2 為（75.30±13.76）%，對照 B 組為（52.54±21.12）%，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 IPF/NSIP 亞組與對照 B 組巨噬細胞亞群比例結果
亞組分析發現，IPF/NSIP 亞組 M1 為（27.46±11.47）%，對照 B 組為（47.02±21.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；IPF/NSIP 亞組 M2 為（72.24±11.22）%，對照 B 組為（52.54±21.12）%，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.4 CTD-ILD 亞組與對照 B 組巨噬細胞亞群比例結果
亞組分析發現，繼發性間質性肺炎組 M1 為（19.68±16.73）%，對照 B 組為（47.02±21.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；繼發性間質性肺炎組 M2 為（80.07±16.55）%，對照 B 組為（52.54±21.12）%，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.5 CTD-ILD 亞組與 IPF/NSIP 亞組巨噬細胞亞群比例結果
亞組分析發現，CTD-ILD 亞組 M1 為（19.68±16.73）%，IPF/NSIP 亞組為（27.46±11.47）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 M2 為（80.07±16.55）%，IPF/NSIP 亞組為（72.24±11.22）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2.6 肺纖維化組肺泡灌洗液巨噬細胞亞群與 DLCO 及 PaO2的相關關系
pearson 相關分析發現肺纖維化組 M2 亞型分化比例與患者 DLCO 及 PaO2 之間呈負相關（P<0.05）。結果見表 2。
表2
肺纖維化組肺泡灌洗液巨噬細胞亞群與 DLCO 及 PaO2 的相關關系
2.3 外周血 KLF4 蛋白檢測結果
2.3.1 一般情況
肺纖維化組收集到 23 份外周血標本，用于檢測 KLF4 蛋白表達量，其中有效數據 18 份，男 10 例，女 8 例，平均年齡（63.4±9.1）歲，特發性間質性肺炎 9 例（其中 IPF 2 例，NSIP 7 例），繼發性間質性肺炎 9 例（繼發于干燥綜合征 4 例，繼發于類風濕性關節炎 3 例，繼發于多發性肌炎/皮肌炎 2 例）；對照 A 組30 例，男 25 例，女 5 例，平均年齡（35.6±11.5）歲。
2.3.2 肺纖維化組與對照 A 組外周血 KLF4 檢測結果
肺纖維化組為 18 例，對照 A 組為 30 例，肺纖維化組 KLF4 為（17.13±6.47）ng/mL，對照 A 組為（13.95±0.85）ng/mL，兩者相比差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3.3 肺纖維化組外周血 KLF4 的表達與巨噬細胞亞群分化的相關關系
pearson 相關分析發現 KLF4 的表達與 M2 型巨噬細胞的數量呈正相關（ρ=0.378，P=0.122），與 M1 型巨噬細胞的數量呈負相關（ρ=–0.380，P=0.119）。
3 討論
本研究選取確診的肺纖維化患者 36 例作為研究對象，患者中包括特發性間質性肺炎和繼發性間質性肺炎患者；同時，還選取 10 例需行支氣管鏡檢查的無肺纖維化患者以及 30 例正常人群作為對照。通過分析肺纖維化組肺泡巨噬細胞亞群及外周血單核細胞亞群與相應對照組肺泡巨噬細胞亞群及外周血單核細胞亞群的關系，以及肺纖維化組外周血 KLF4 的表達量及其與巨噬細胞亞群分化的關系，進一步觀察肺纖維化組單核細胞亞群及巨噬細胞亞群分化與肺功能的關系。
根據目前常用的分類原則，利用單核細胞 CD14 和 CD16 表達水平將人體中的單核細胞分為 3 個亞群，分別為 CD14++CD16–亞群（Mon1），CD14++CD16+亞群（Mon2）及 CD14+CD16++亞群（Mon3）[3]。三群單核細胞分別代表單核細胞不同的分化階段，Mon1 亞群和 Mon3 亞群是單核細胞分化發育的兩極，即相對低分化和高分化階段，而 Mon2 是過渡亞型。在健康人群中，Mon1 約占外周血單核細胞總數的 80%～90%，而 Mon2、Mon3 亞型均占外周血單核細胞總數的 5%～10%[4]。我們測定的對照 A 組外周血 Mon1 亞型占比為（84.32±4.67）%，Mon2、Mon3 亞型占比分別是（3.95±0.94）%、（7.41±3.50）%，與文獻報道基本一致。
研究發現 CD16+單核細胞呈炎癥表型，能夠分泌 TGF-α 等促炎因子[4]，在機體出現炎癥時，外周血中 CD16+單核細胞顯著增高[5]，可能參與纖維化早起的炎癥反應。我們課題組的動物實驗也證明，博來霉素誘導的肺損傷小鼠，Ly6Chi主要是在炎癥早期升高，而在纖維化進展期 Ly6Chi單核細胞比例較早期呈下降趨勢[6]。但人單核細胞哪個亞群與肺纖維化關系密切，并在肺纖維化的進展中起主要作用，目前臨床研究較少。我們發現，肺纖維化組患者 Mon1 亞型為（79.21±11.51）%，較對照 A 組下降，而 Mon2 及 Mon3 亞型較對照 A 組升高。這可能說明，在肺纖維化進程中，隨著炎癥反應的加重，單核細胞由 CD16– 亞型向更為成熟的 CD16+、CD16++亞型發展，CD16+單核細胞確實參與了肺組織由炎癥向纖維化方向的發展。
但應該指出，雖然肺纖維化組 Mon2、Mon3 亞型較對照 A 組升高，但差異無統計學意義。而且通過相關性分析發現，三個亞型的單核細胞與肺間質纖維化程度均沒有相關關系，我們主要考慮本次所納入的患者雖然肺間質纖維化程度不同，但均已發展至纖維化期，這與早期的炎癥反應存在差異，或許在間質性肺炎早期，Mon2、Mon3 亞型升高更為明顯，其次，本次納入的樣本數量較少，可能對結果產生一定影響，下一步需要大樣本的臨床數據證實。
在炎癥、損傷、修復過程中，不同亞型的單核細胞在組織局部浸潤過程中亦分化為不同亞型及功能的巨噬細胞[7-8]。M1 型巨噬細胞由典型單核細胞（CD14++CD16– 或 CD11b+CD115+Ly6Chigh）分化產生；M2 型巨噬細胞由非典型單核細胞（CD14+CD16++或 CD11b+CD115+Ly6Clow）分化而來，不同的巨噬細胞亞型對組織損傷、修復所起的作用不同。目前認為 M1 型巨噬細胞在炎癥早期具有抗菌、抗炎作用，炎癥后期巨細胞通過多種途徑，逐漸分化為 M2 型巨噬細胞，而 M2 型巨噬細胞則以旁分泌的形式引起成纖維細胞的過度增殖、細胞外基質沉積，逐漸發展為不可逆的肺間質纖維化，但關于肺纖維化患者肺泡灌洗液中巨噬細胞的分布及其可能的調控因素，目前尚少見研究報道。我們的結果顯示，在肺纖維化組肺泡巨噬細胞以 M2 亞型為主，該結果提示在間質性肺疾病發展至肺纖維化階段，巨噬細胞存在向 M2 亞型分化的傾向。
雖然沒有直接的研究表明，肺間質纖維化患者肺組織 M2 型巨噬細胞明顯增高，但有研究發現，在 IPF 患者及繼發于系統性硬化癥的間質性肺炎患者中，M2 型巨噬細胞表明標志物 CCL-18 明顯增高，同時與肺纖維化程度呈正相關[9-10]。根據相關分析，我們的研究同樣發現，M2 型巨噬細胞所占比例與 PaO2 呈明顯的負相關，這說明，巨噬細胞向 M2 型分化與肺纖維化的進程呈正相關，這與既往研究相符。因此可以認為，在間質性肺疾病發展至肺纖維化階段的過程中，M2 型巨噬細胞在其中起到重要作用。
但必須指出，有研究發現人類肺組織巨噬細胞與小鼠發展和分化基本相同[11]，而我們課題組的前期結果顯示，博來霉素誘導的肺損傷小鼠從炎癥期到損傷修復期，肺泡灌洗液 M1 巨噬細胞逐漸減少，M2 型巨噬細胞逐漸增多，但 M2 型巨噬細胞比例均未超過 70%[12]。
而本次我們檢測肺泡灌洗液中的巨噬細胞，M2 亞型占（75.30±13.76）%，而 M1 亞型占（24.42±13.95）%。這可能與本研究對象為患者，且其肺纖維化程度較高，與藥物所致肺損傷存在差異。且肺泡灌洗液中巨噬細胞并不能完全反映肺組織的巨噬細胞分布有關[13]。而對纖維化程度不同的結節病、外源性過敏性肺泡炎、NSIP 及 IPF 患者支氣管肺泡灌洗液中巨噬細胞亞型分析發現[14]，在以炎癥反應為主的結節病中 CD40 表型的巨噬細胞（M1 巨噬細胞表型標志物）明顯增高，而在纖維化程度較重的過敏性肺泡炎、NSIP、IPF 中以 CD163 表型的巨噬細胞（M2 巨噬細胞表型標志物）明顯增高，雖然 CD163 表型的巨噬細胞低于本研究，但都表明 M2 型巨噬細胞比例與肺纖維化存在相關性。綜上，間質性肺疾病患者的 M2 型巨噬細胞明顯增高，并與肺纖維化程度呈正相關，這些研究結果均表明，M2 型巨噬細胞在肺間質纖維化的發生、發展中起重要作用。
研究表明，KLF4 是調控肺纖維化的重要調控因子，可通過調控成纖維細胞細胞分化[15]，調節平滑肌細胞分化及調控 alpha-SMA 的表達影響肺纖維化的進程[16]。新近研究顯示，KLF4 也是調節單核巨噬細胞亞群偏移的關鍵因子，其上調可促使單核細胞向非典型方向分化，并使巨噬細胞向 M2 型偏移，其下調則抑制單核細胞向非典型方向分化，并可使巨噬細胞向 M1 偏移[17]。我們的前期研究發現，小鼠肺組織中 KLF4 mRNA 和蛋白的表達水平在博來霉素致肺纖維化過程中呈現明顯的動態變化，第 1 d 開始升高，而后降低，第 3 d 達最低后逐漸升高直至第 28 d[1]。因此認為，KLF4 對巨噬細胞的這種雙向調控作用，可能在肺纖維化的發生、發展中其中重要作用，而其影響肺纖維化進程的機制之一可能是通過調控單核巨噬細胞亞型的分化。
本組觀察中，我們應用酶聯免疫吸附試驗法檢測了間質性肺疾病患者外周血 KLF4 的表達量，試圖尋找 KLF4 的表達與單核巨噬細胞分化的關系。但遺憾的是，雖然間質性肺疾病組 KLF4 蛋白較對照 A 組明顯增高，KLF4 的表達與 M2 型巨噬細胞的數量呈正相關關系（ρ=0.378），但這種相關性未達到統計學意義。分析原因，我們認為可能與以下因素有關：第一，KLF4 的表達可能在組織或細胞中表達量較高，其分泌入血的量較少；第二，我們的檢測方法粗糙，可能應用 PCR 技術，得到的結果更為可靠；第三，納入患者的肺纖維化發展的階段不一，影響了 KLF4 與單核巨噬細胞的相關性分析。或許動態觀察 KLF4 的表達與肺間質纖維化發生、發展的關系更為可靠。因此我們推測 KLF4 參與的單核巨噬細胞亞群調控可能參與了肺纖維化發生、發展，關于其具體機制，以及在何種程度上影響纖維化的進程仍需要進一步研究。
另外，由于本組觀察是臨床研究，在支氣管鏡檢查過程中，操作者不同，所得到的支氣管肺泡灌洗液質量不同，可能對結果造成一定的影響。此外本研究樣本量較少，且肺纖維化類型不同，也對結果造成一定影響，關于 KLF4 參與的單核/巨噬細胞亞群調控在間質性肺疾病中的變化及可能的作用仍需大樣本的臨床研究進一步觀察。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
Krüppel 樣因子 4（Krüppel-like factor 4，KLF4）是參與單核巨噬細胞亞群調控的重要轉錄因子。本課題組的前期研究證實 KLF4、單核巨噬細胞亞群在博來霉素致肺纖維化進程中均呈現動態變化，同時發現阿托伐他汀能夠影響博來霉素小鼠肺纖維化模型肺組織 KLF4 的表達[1]。但 KLF4 參與的單核巨噬細胞亞群調控是否在肺纖維化患者發病過程中發揮作用，目前仍未闡明。因此本課題意圖從臨床基礎角度出發，觀察肺纖維化患者 KLF4、單核– 巨噬細胞亞群變化與肺功能的關系；并進一步深化前期的研究工作，探討 KLF4 參與的單核巨噬細胞亞群調控與肺纖維化發生發展的關系，為尋找肺纖維化治療的新靶點奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選取武警特色醫學中心 2015 年 5 月至 2017 年 1 月住院治療的患者（肺纖維化組）、同期健康體檢者（外周血單核細胞亞群及 KLF4 對照組，對照 A 組）以及需行支氣管鏡檢查的慢性咳嗽且無肺纖維化患者（肺泡灌洗液巨噬細胞亞群對照組，對照 B 組）。本研究由武警特色醫學中心研究倫理委員會批準，保證患者入院后的各項檢查措施符合診療常規，包括常規抽血、高分辨率 CT、肺功能檢測及支氣管鏡檢查），各項檢查前均簽署書面知情同意書。所有檢查結果回報后，病例在武警特色醫學中心呼吸與重癥醫學科醫生辦公室討論決定最終診斷，討論醫生包括呼吸科醫師、風濕免疫科醫師、病理科醫師以及放射科醫師。診斷依據：美國胸科協會/歐洲呼吸學會的特發性肺間質纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）診斷及治療指南（2011 版）以及干燥綜合征（圣地亞哥標準）、多發性肌炎/皮肌炎［1975 年 Bohn 和 Peter 提出的診斷標準］、類風濕性關節炎［美國風濕病協會 1987 年修正的分類標準］等疾病的診療標準，決定患者為原發或繼發性間質性肺疾病，并根據高分辨率 CT 診斷典型的 IPF。
肺纖維化組：肺纖維化組包括特發性間質性肺炎和繼發性間質性肺炎，特發性間質性肺炎包括新發的 IPF 和非特異性間質性肺炎（nonspecific interstitial pneumonia，NSIP）；繼發性間質性肺炎主要選取繼發于結締組織病、影像學主要表現為 NSIP 的間質性肺疾病患者。納入標準：① 均為初診患者；② 年齡 18～70 歲；③ 無嚴重心腦血管疾病；④ 無胸廓畸形及肺部基礎病。排除標準：① 不能耐受支氣管鏡檢查；② 不能耐受肺功能檢查。
外周血單核細胞對照組（對照 A 組）：選取正常人群（在武警特色醫學中心健康體檢者），抽取外周血檢測單核細胞亞群作為對照。納入標準：① 既往體健，無吸煙史，體檢胸部 X 線片及心電圖正常；② 年齡 18～70 歲。排除標準：① 近期出現感冒、肺部感染等疾病；② 肥胖患者（肥胖影響單核細胞分化）[2]。
肺泡灌洗液巨噬細胞對照組（對照 B 組）：需行支氣管鏡檢查的慢性咳嗽且無肺纖維化患者。納入標準：① 既往體健，無吸煙史，不明原因咳嗽超過 8 周，胸部 X 線片及心電圖檢查正常；② 年齡 18～70 歲；③ 支氣管鏡下檢查未見異常；④ 肺功能檢查正常。排除標準：① 近期出現肺部感染；② 不能耐受支氣管鏡檢查。
1.2 方法
1.2.1 主要儀器
肺功能儀（Master Screen Diffusion，德國）；WS-H200 型自動超聲波人體秤（上海，中國）；電子天平-FA 1104（上海，中國）；–80 ℃ 冰箱（Sanyo，日本）；CytomicsFC500 流式細胞儀（Beckman coulter，美國）；漩渦混勻器（IKA，德國）；流式分析試管（BD，美國）；雙人單面凈化工作臺-SW-CJ-2FD 型（蘇州，中國）；血氣分析儀（GEM premier 3000；Instrumentation Laboratory，Bedford，IL，美國）。
1.2.2 主要試劑
（1）異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記鼠抗人 CD45（BD，美國）；（2）藻紅蛋白（phycoerhthrin，PE）標記鼠抗人 CD14（BD，美國）；（3）藻紅蛋白-Cy5 結合物（phycoerhthrin-Cy5 conjugate，PE/Cy5）標記鼠抗人 CD16（BD，美國）；（4）紅細胞裂解（BD，美國）；（5）PE/Cy7 標記鼠抗人 CD41（BD，美國）；（6）Flow-CountTM 熒光微球（Beckman coulter，美國）；（7）磷酸鹽緩沖液（BD，美國）；（8）FITC 標記鼠抗人 CD11b（BD，美國）；（9）PE 標記鼠抗人 CD169（BD，美國）；（10）PE/Cy5 標記大鼠抗小鼠 mIgG1（BD，美國）；（11）PE/Cy5 標記鼠抗人 CD206（BD，美國）；（12）7-氨基放線菌素 D（7-amino-actinomycin D，7-AAD；BD，美國）。
1.2.3 肺功能檢測
（1）準確測量身高和體重；（2）檢查前詢問受試者病史，囑在檢查過程中保持坐位并盡量避免運動；（3）肺彌散功能檢查前先準確測定受試者的肺活量或用力肺活量；（4）向受試者介紹檢查動作，指導受試者依次練習呼氣—深吸氣—屏氣—呼氣等動作。（5）給患者夾上鼻夾；（6）將咬嘴含口上，平靜呼吸 4～5 個循環，待潮氣末基線平穩后，讓患者呼氣至殘氣量位；（7）令受試者在 2 s 內均勻吸氣至肺總量位；（8）接著屏氣 10 s，最后在 2～4 s 內均勻持續中速呼氣完全至殘氣量位。
1.2.4 動脈氧分壓的檢測
清晨留取動脈血，輕輕混勻，應用 GEM premier 3000 血氣自動分析儀行血氣檢測。
1.2.5 流式細胞術檢測外周血單核細胞亞群
1.2.5.1 血液標本制備
（1）研究對象入院后抽取空腹外周靜脈血 5 mL 至抗凝管中，送至實驗室，準備制備血液標本上機檢測；（2）取 600 μL EP 管，標記并編號；（3）檢測管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μLCD16-PE-Cy5 單克隆抗體，對照管加 2 μL CD45-FITC、3 μL CD14-PE、2 μL mIgG1 PE-Cy5 單克隆抗體，各管再加 30 μL 靜脈全血，混勻（漩渦），室溫、避光，孵育 15 min；（4）溶解紅細胞，向流式試管中加 600 μL 紅細胞裂解液，漩渦混勻，室溫避光反應 10 min；（5）取出 Flow-CountTM 熒光微球，漩渦混勻 10 s，反向加樣法在各標本管中加入 30 μL 熒光微球，漩渦混勻。
1.2.5.2 上機檢測步驟
（1）用熒光微球（Flow-CountTM）校正機器；（2）側向角散射光（side scatter，SSC）和前向角散射光（forward scatter，FSC）雙參數點圖檢測外周血單核細胞亞群；（3）根據 SSC 為縱坐標，CD86-FITC 為橫坐標，建立 SSC-CD86-FITC 散點圖，反向設門法圈出單核細胞亞群；（4）利用 CD16 抗體對照抗體 mIgG1-PE-Cy5 界定陰性細胞；（5）抗 CD86-FITC、CD14-PE、CD16-PE-Cy5 單陽細胞調節補償；（6）利用單核細胞 CD14 和 CD16 表達水平將單核細胞分為 3 個亞群，分別為 CD14++CD16– 亞群（Mon1），CD14++CD16+亞群（Mon2）及 CD14+CD16++亞群（Mon3）；（7）利用 Flowjo 6.2 軟件獲取并分析數據；（8）分析流程圖見圖 1。
圖1
外周血單核細胞分析流程圖
1.2.6 流式細胞術檢測肺泡灌洗液巨噬細胞亞群
1.2.6.1 肺泡灌洗液的獲取及制備
（1）向患者及家屬說明支氣管鏡檢查的目的及意義，取得患者配合后行支氣管鏡檢查，生理鹽水灌洗病變肺，回收肺泡灌洗液；（2）將回收肺泡灌洗液立即用雙層無菌紗布過濾除去黏液，記錄總量；（3）將肺泡灌洗液裝入硅塑瓶滅菌玻璃容器中，置于含有冰塊的保溫瓶中，立即送往實驗室；（4）取肺泡灌洗液 10 mL，經 300 目金屬網過濾去掉雜質和痰液，300 g、5 min 離心后棄上清；（5）用含有 0.5% 胎牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液洗 2 次；（6）取肺泡灌洗液 100 μL 加入 20 μL 熒光抗體，室溫避光孵育 20 min，300 g、5 min 離心后棄上清；（7）加 1∶9 配制的溶血素 2 mL，避光 10 min，200 g、5 min 離心后棄上清；（8）加入磷酸鹽緩沖液 300 g、5 min 離心后棄上清，加 0.5 mL 磷酸鹽緩沖液重懸細胞上機待測。
1.2.6.2 上機檢測
（1）Flow-CountTM 熒光微球校正儀器使其達到最佳工作狀態；（2）經 7-AAD 染色，區分死亡和成活細胞；（3）三色熒光/側向散射光設門（CD11b/SSC-Gating），設置巨噬細胞門并分析巨噬細胞免疫表型；（4）建立 CD11b /SSC 熒光點圖，用 CD11b+細胞群圈門以排除其他成分的干擾，調節 FSC、SSC 電壓，FSC 閾值，FL1-FL2% 、FL2-FL1% 熒光補償，建立 CD206++/CD169+散點圖，根據同型對照設門分析巨噬細胞（CD163+/CD163++）的表達情況，同時計算出 M1/M2 比值；（5）利用 Flowjo 6.2 軟件獲取并分析數據；（6）分選流程圖見圖 2。
圖2
肺泡灌洗液巨噬細胞亞型流式細胞術分選流程圖
1.2.7 酶聯免疫吸附試驗法檢測血清 KLF4 的表達
根據試劑盒說明，在 15 min 內以 450 nm 波長依序測量各樣本的吸光度值；得出并描繪標準物的濃度與吸光度值，計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的吸光度值代入方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，得出樣品的實際濃度。
1.3 統計學方法
不符合正態分布的數據以中位數表示，組間中位數的比較采用 Mann–Whitney U 檢驗。符合正態分布者的數據，以均數±標準差（±s）表示，采用成組 t 檢驗，否則進行秩和檢驗。檢驗水準為雙側 P<0.05。KLF4 與肺功能（彌散功能）、單核細胞亞群以及肺泡巨噬細胞亞群之間的關系采用相關分析法進行分析。
2 結果
2.1 外周血單核細胞檢測結果
2.1.1 一般情況
肺纖維化組共搜集 36 例，男 12 例，女 24 例，平均年齡（64.3±9.8）歲；進一步亞組分析，發現其中特發性間質性肺炎組患者 18 例（IPF 患者 6 例，NSIP 患者 12 例），簡稱 IPF/NSIP 亞組；繼發性間質性肺炎組患者 18 例，均繼發于結締組織病（干燥綜合征 10 例，繼發于類風濕性關節炎 6 例，繼發于多發性肌炎/皮肌炎 2 例），簡稱 CTD-ILD 亞組；對照 A 組 30 例，男 25 例，女 5 例，平均年齡（35.6±11.5）歲。
2.1.2 肺纖維化組及對照 A 組單核細胞亞群比例結果
肺纖維化組 Mon1 為（79.21±11.51）%，對照 A 組為（84.32±4.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；肺纖維化組 Mon2 為（6.42±4.04）%，對照 A 組為（3.95±0.94）%，差異有統計學意義（P<0.05）；肺纖維化組 Mon3 為（10.12±8.37）%，對照 A 組為（7.41±3.50）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.3 IPF/NSIP 亞組與對照 A 組單核細胞亞群比例結果
亞組分析發現，IPF/NSIP 亞組 Mon1 為（80.73±10.47）%，對照 A 組為（84.32±4.67）%，差異無統計學意義（P>0.05）；IPF/NSIP 亞組 Mon2 為（5.80±3.25）%，對照 A 組為（3.95±0.94）%，差異有統計學意義（P<0.05）；IPF/NSIP 亞組 Mon3 為（10.54±7.60）%，對照 A 組為（7.41±3.50）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.4 CTD-ILD 亞組與對照 A 組單核細胞亞群比例結果
亞組分析發現，CTD-ILD 亞組 Mon1 為（77.68±12.90）%，對照 A 組為（84.32±4.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon2 為（7.03±4.83）%，對照 A 組為（3.95±0.94）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon3 為（9.70±9.52）%，對照 A 組為（7.41±3.50）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.5 CTD-ILD 亞組與 IPF/NSIP 亞組單核細胞亞群比例結果
亞組分析發現，CTD-ILD 亞組 Mon1 為（77.68±12.90）%，IPF/NSIP 亞組為（80.73±10.47）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon2 為（7.03±4.83）%，IPF/NSIP 亞組為（5.80±3.25）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 Mon3 為（9.70±9.52）%，IPF/NSIP 亞組為（10.54±7.60）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.1.6 肺纖維化組外周血單核細胞亞群與 DLCO 及 PaO2 的相關關系
相關分析發現單核細胞三個亞型分化比例與患者 DLCO 及 PaO2 之間無相關性。結果見表 1。
表1
肺纖維化組外周血單核細胞亞群與 DLCO 及 PaO2 的相關關系
2.2 肺泡灌洗液巨噬細胞細胞檢測結果
2.2.1 一般情況
肺纖維化組共搜集 23 例支氣管肺泡灌洗液，男 10 例，女 13 例，平均年齡（63.6±7.5）歲；進一步亞組分析發現，其中特發性間質性肺炎 14 例（IPF 4 例，NSIP 10 例），簡稱 IPF/NSIP 亞組；繼發性間質性肺炎患者 9 例，均繼發于結締組織病（繼發于干燥綜合征 4 例，繼發于類風濕性關節炎 3 例，繼發于多發性肌炎/皮肌炎 2 例），簡稱 CTD-ILD 亞組；對照 B 組 10 例，男 5 例，女 5 例，平均年齡（41.4±10.7）歲。
2.2.2 肺纖維化組及對照 B 組巨噬細胞亞群比例結果
肺纖維化組 M1 為（24.42±13.95）%，對照 B 組為（47.02±21.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；肺纖維化組 M2 為（75.30±13.76）%，對照 B 組為（52.54±21.12）%，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.3 IPF/NSIP 亞組與對照 B 組巨噬細胞亞群比例結果
亞組分析發現，IPF/NSIP 亞組 M1 為（27.46±11.47）%，對照 B 組為（47.02±21.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；IPF/NSIP 亞組 M2 為（72.24±11.22）%，對照 B 組為（52.54±21.12）%，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.4 CTD-ILD 亞組與對照 B 組巨噬細胞亞群比例結果
亞組分析發現，繼發性間質性肺炎組 M1 為（19.68±16.73）%，對照 B 組為（47.02±21.67）%，差異有統計學意義（P<0.05）；繼發性間質性肺炎組 M2 為（80.07±16.55）%，對照 B 組為（52.54±21.12）%，差異有統計學意義（P<0.05）。
2.2.5 CTD-ILD 亞組與 IPF/NSIP 亞組巨噬細胞亞群比例結果
亞組分析發現，CTD-ILD 亞組 M1 為（19.68±16.73）%，IPF/NSIP 亞組為（27.46±11.47）%，差異無統計學意義（P>0.05）；CTD-ILD 亞組 M2 為（80.07±16.55）%，IPF/NSIP 亞組為（72.24±11.22）%，差異無統計學意義（P>0.05）。
2.2.6 肺纖維化組肺泡灌洗液巨噬細胞亞群與 DLCO 及 PaO2的相關關系
pearson 相關分析發現肺纖維化組 M2 亞型分化比例與患者 DLCO 及 PaO2 之間呈負相關（P<0.05）。結果見表 2。
表2
肺纖維化組肺泡灌洗液巨噬細胞亞群與 DLCO 及 PaO2 的相關關系
2.3 外周血 KLF4 蛋白檢測結果
2.3.1 一般情況
肺纖維化組收集到 23 份外周血標本，用于檢測 KLF4 蛋白表達量，其中有效數據 18 份，男 10 例，女 8 例，平均年齡（63.4±9.1）歲，特發性間質性肺炎 9 例（其中 IPF 2 例，NSIP 7 例），繼發性間質性肺炎 9 例（繼發于干燥綜合征 4 例，繼發于類風濕性關節炎 3 例，繼發于多發性肌炎/皮肌炎 2 例）；對照 A 組30 例，男 25 例，女 5 例，平均年齡（35.6±11.5）歲。
2.3.2 肺纖維化組與對照 A 組外周血 KLF4 檢測結果
肺纖維化組為 18 例，對照 A 組為 30 例，肺纖維化組 KLF4 為（17.13±6.47）ng/mL，對照 A 組為（13.95±0.85）ng/mL，兩者相比差異有統計學意義（P<0.05）。
2.3.3 肺纖維化組外周血 KLF4 的表達與巨噬細胞亞群分化的相關關系
pearson 相關分析發現 KLF4 的表達與 M2 型巨噬細胞的數量呈正相關（ρ=0.378，P=0.122），與 M1 型巨噬細胞的數量呈負相關（ρ=–0.380，P=0.119）。
3 討論
本研究選取確診的肺纖維化患者 36 例作為研究對象，患者中包括特發性間質性肺炎和繼發性間質性肺炎患者；同時，還選取 10 例需行支氣管鏡檢查的無肺纖維化患者以及 30 例正常人群作為對照。通過分析肺纖維化組肺泡巨噬細胞亞群及外周血單核細胞亞群與相應對照組肺泡巨噬細胞亞群及外周血單核細胞亞群的關系，以及肺纖維化組外周血 KLF4 的表達量及其與巨噬細胞亞群分化的關系，進一步觀察肺纖維化組單核細胞亞群及巨噬細胞亞群分化與肺功能的關系。
根據目前常用的分類原則，利用單核細胞 CD14 和 CD16 表達水平將人體中的單核細胞分為 3 個亞群，分別為 CD14++CD16–亞群（Mon1），CD14++CD16+亞群（Mon2）及 CD14+CD16++亞群（Mon3）[3]。三群單核細胞分別代表單核細胞不同的分化階段，Mon1 亞群和 Mon3 亞群是單核細胞分化發育的兩極，即相對低分化和高分化階段，而 Mon2 是過渡亞型。在健康人群中，Mon1 約占外周血單核細胞總數的 80%～90%，而 Mon2、Mon3 亞型均占外周血單核細胞總數的 5%～10%[4]。我們測定的對照 A 組外周血 Mon1 亞型占比為（84.32±4.67）%，Mon2、Mon3 亞型占比分別是（3.95±0.94）%、（7.41±3.50）%，與文獻報道基本一致。
研究發現 CD16+單核細胞呈炎癥表型，能夠分泌 TGF-α 等促炎因子[4]，在機體出現炎癥時，外周血中 CD16+單核細胞顯著增高[5]，可能參與纖維化早起的炎癥反應。我們課題組的動物實驗也證明，博來霉素誘導的肺損傷小鼠，Ly6Chi主要是在炎癥早期升高，而在纖維化進展期 Ly6Chi單核細胞比例較早期呈下降趨勢[6]。但人單核細胞哪個亞群與肺纖維化關系密切，并在肺纖維化的進展中起主要作用，目前臨床研究較少。我們發現，肺纖維化組患者 Mon1 亞型為（79.21±11.51）%，較對照 A 組下降，而 Mon2 及 Mon3 亞型較對照 A 組升高。這可能說明，在肺纖維化進程中，隨著炎癥反應的加重，單核細胞由 CD16– 亞型向更為成熟的 CD16+、CD16++亞型發展，CD16+單核細胞確實參與了肺組織由炎癥向纖維化方向的發展。
但應該指出，雖然肺纖維化組 Mon2、Mon3 亞型較對照 A 組升高，但差異無統計學意義。而且通過相關性分析發現，三個亞型的單核細胞與肺間質纖維化程度均沒有相關關系，我們主要考慮本次所納入的患者雖然肺間質纖維化程度不同，但均已發展至纖維化期，這與早期的炎癥反應存在差異，或許在間質性肺炎早期，Mon2、Mon3 亞型升高更為明顯，其次，本次納入的樣本數量較少，可能對結果產生一定影響，下一步需要大樣本的臨床數據證實。
在炎癥、損傷、修復過程中，不同亞型的單核細胞在組織局部浸潤過程中亦分化為不同亞型及功能的巨噬細胞[7-8]。M1 型巨噬細胞由典型單核細胞（CD14++CD16– 或 CD11b+CD115+Ly6Chigh）分化產生；M2 型巨噬細胞由非典型單核細胞（CD14+CD16++或 CD11b+CD115+Ly6Clow）分化而來，不同的巨噬細胞亞型對組織損傷、修復所起的作用不同。目前認為 M1 型巨噬細胞在炎癥早期具有抗菌、抗炎作用，炎癥后期巨細胞通過多種途徑，逐漸分化為 M2 型巨噬細胞，而 M2 型巨噬細胞則以旁分泌的形式引起成纖維細胞的過度增殖、細胞外基質沉積，逐漸發展為不可逆的肺間質纖維化，但關于肺纖維化患者肺泡灌洗液中巨噬細胞的分布及其可能的調控因素，目前尚少見研究報道。我們的結果顯示，在肺纖維化組肺泡巨噬細胞以 M2 亞型為主，該結果提示在間質性肺疾病發展至肺纖維化階段，巨噬細胞存在向 M2 亞型分化的傾向。
雖然沒有直接的研究表明，肺間質纖維化患者肺組織 M2 型巨噬細胞明顯增高，但有研究發現，在 IPF 患者及繼發于系統性硬化癥的間質性肺炎患者中，M2 型巨噬細胞表明標志物 CCL-18 明顯增高，同時與肺纖維化程度呈正相關[9-10]。根據相關分析，我們的研究同樣發現，M2 型巨噬細胞所占比例與 PaO2 呈明顯的負相關，這說明，巨噬細胞向 M2 型分化與肺纖維化的進程呈正相關，這與既往研究相符。因此可以認為，在間質性肺疾病發展至肺纖維化階段的過程中，M2 型巨噬細胞在其中起到重要作用。
但必須指出，有研究發現人類肺組織巨噬細胞與小鼠發展和分化基本相同[11]，而我們課題組的前期結果顯示，博來霉素誘導的肺損傷小鼠從炎癥期到損傷修復期，肺泡灌洗液 M1 巨噬細胞逐漸減少，M2 型巨噬細胞逐漸增多，但 M2 型巨噬細胞比例均未超過 70%[12]。
而本次我們檢測肺泡灌洗液中的巨噬細胞，M2 亞型占（75.30±13.76）%，而 M1 亞型占（24.42±13.95）%。這可能與本研究對象為患者，且其肺纖維化程度較高，與藥物所致肺損傷存在差異。且肺泡灌洗液中巨噬細胞并不能完全反映肺組織的巨噬細胞分布有關[13]。而對纖維化程度不同的結節病、外源性過敏性肺泡炎、NSIP 及 IPF 患者支氣管肺泡灌洗液中巨噬細胞亞型分析發現[14]，在以炎癥反應為主的結節病中 CD40 表型的巨噬細胞（M1 巨噬細胞表型標志物）明顯增高，而在纖維化程度較重的過敏性肺泡炎、NSIP、IPF 中以 CD163 表型的巨噬細胞（M2 巨噬細胞表型標志物）明顯增高，雖然 CD163 表型的巨噬細胞低于本研究，但都表明 M2 型巨噬細胞比例與肺纖維化存在相關性。綜上，間質性肺疾病患者的 M2 型巨噬細胞明顯增高，并與肺纖維化程度呈正相關，這些研究結果均表明，M2 型巨噬細胞在肺間質纖維化的發生、發展中起重要作用。
研究表明，KLF4 是調控肺纖維化的重要調控因子，可通過調控成纖維細胞細胞分化[15]，調節平滑肌細胞分化及調控 alpha-SMA 的表達影響肺纖維化的進程[16]。新近研究顯示，KLF4 也是調節單核巨噬細胞亞群偏移的關鍵因子，其上調可促使單核細胞向非典型方向分化，并使巨噬細胞向 M2 型偏移，其下調則抑制單核細胞向非典型方向分化，并可使巨噬細胞向 M1 偏移[17]。我們的前期研究發現，小鼠肺組織中 KLF4 mRNA 和蛋白的表達水平在博來霉素致肺纖維化過程中呈現明顯的動態變化，第 1 d 開始升高，而后降低，第 3 d 達最低后逐漸升高直至第 28 d[1]。因此認為，KLF4 對巨噬細胞的這種雙向調控作用，可能在肺纖維化的發生、發展中其中重要作用，而其影響肺纖維化進程的機制之一可能是通過調控單核巨噬細胞亞型的分化。
本組觀察中，我們應用酶聯免疫吸附試驗法檢測了間質性肺疾病患者外周血 KLF4 的表達量，試圖尋找 KLF4 的表達與單核巨噬細胞分化的關系。但遺憾的是，雖然間質性肺疾病組 KLF4 蛋白較對照 A 組明顯增高，KLF4 的表達與 M2 型巨噬細胞的數量呈正相關關系（ρ=0.378），但這種相關性未達到統計學意義。分析原因，我們認為可能與以下因素有關：第一，KLF4 的表達可能在組織或細胞中表達量較高，其分泌入血的量較少；第二，我們的檢測方法粗糙，可能應用 PCR 技術，得到的結果更為可靠；第三，納入患者的肺纖維化發展的階段不一，影響了 KLF4 與單核巨噬細胞的相關性分析。或許動態觀察 KLF4 的表達與肺間質纖維化發生、發展的關系更為可靠。因此我們推測 KLF4 參與的單核巨噬細胞亞群調控可能參與了肺纖維化發生、發展，關于其具體機制，以及在何種程度上影響纖維化的進程仍需要進一步研究。
另外，由于本組觀察是臨床研究，在支氣管鏡檢查過程中，操作者不同，所得到的支氣管肺泡灌洗液質量不同，可能對結果造成一定的影響。此外本研究樣本量較少，且肺纖維化類型不同，也對結果造成一定影響，關于 KLF4 參與的單核/巨噬細胞亞群調控在間質性肺疾病中的變化及可能的作用仍需大樣本的臨床研究進一步觀察。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
