引用本文： 歐國春, 陳小菊, 陳永, 曾頔, 黃月薇, 劉琴. Maresin-1 對哮喘小鼠肺部炎癥及 MAPK 信號通路的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(3): 234-239. doi: 10.7507/1671-6205.201906073 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是呼吸系統常見的一種慢性氣道炎癥性疾病。全世界約有 3 億人患有哮喘，到 2025 年可能達到 4 億人[1]。許多研究表明，多種炎癥介質如白介素（interleukin，IL）-4、IL-5 和 IL-13，由活化的炎癥細胞特別是 Th2 細胞合成并釋放，最終誘導氣道黏液高分泌，這是哮喘發病的關鍵[2]。糖皮質激素具有良好的抗炎作用，已成為哮喘治療的首選藥物[3]，但長期使用會產生明顯甚至不可逆的不良反應，如骨質疏松、肌肉萎縮、皮質醇功能亢進及誘發心血管疾病等。此外，約 5%～10% 的哮喘患者對激素不敏感，存在糖皮質激素抵抗。因此，這些挑戰突出了開發新的控制哮喘藥物的必要性。Maresin-1（MaR1）是由巨噬細胞來源的二十二碳六烯酸衍生的促炎癥消退介質。研究發現，MaR1 不僅能夠促進巨噬細胞的趨化，活化并增強其吞噬功能，還能抑制中性粒細胞的浸潤并促進其凋亡，從多個環節減輕炎癥反應強度，從而促進炎癥的消退[4]。研究顯示，MaR1 對類風濕關節炎、結腸炎、急性肺損傷和腎缺血/再灌注損傷等動物模型的炎癥反應具有一定的抑制作用[5-8]。類風濕關節炎和哮喘均與 Th1/Th2 及 Th17/Treg 的失衡有關。MaR1 可通過調節 Th17 /Treg 的失衡對類風濕關節炎小鼠模型有改善效應[6]。而 Th17/Treg 失衡在哮喘的發病中也有較為重要的作用，因此推測 MaR1 也可能對哮喘有一定治療作用。目前，MaR1 在支氣管哮喘方面的研究極少。因此，本研究旨在探討 MaR1 在體內是否能夠減輕卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的哮喘小鼠的氣道炎癥及黏液高分泌，并進一步探討其可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料
雌性 BALB/c 小鼠，SPF 級，6～8 周，20 g，由川北醫學院實驗動物中心提供［許可證號：SYXK（川）2018-18］，并通過動物倫理委員會許可。OVA（grade V，Sigma，USA）、氫氧化鋁（Sigma，USA）、MaR1（Cayman，USA）、抗 p-p38（華安生物）、抗 p-JNK（華安生物）、p38（華安生物）、JNK（華安生物）、β 肌動蛋白（β-actin，博奧生）、羊抗兔 lgG（博士德生物）、蘇木精–伊紅染液（博士德生物）、瑞式–姬姆薩染液（珠海貝索生物），以及 IL-4、IL-5、IL-13、IgE 和 OVA-specific-IgE 試劑盒（欣博盛）。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組與哮喘模型建立
隨機將 24 只小鼠分成 4 個組，每組 6 只小鼠，分別為正常組、哮喘模型組、MaR1 組及地塞米松組。依據 Liu 等[9]的方法制作哮喘模型，并進行了適當的調整。正常組致敏及激發階段均給予生理鹽水處理，其余三組小鼠均在第 0、7、14 d 給予腹腔注射混合液 0.2 mL，即 OVA 20 μg、氫氧化鋁 2 mg。自第 21 d 起，連續 8 d 進入激發階段，給予 1% OVA 進行霧化，每次約 30 min。于第 25 d 至第 28 d，每天在霧化前 20 min，從尾靜脈給每只小鼠注射 100 μL 藥物，分別為 1 ng 的 MaR1（MaR1 組）或 1 mg/kg 的地塞米松（地塞米松組），正常組和哮喘模型組則給予生理鹽水干預。
1.2.2 支氣管肺泡灌洗液、血清、肺組織的收集
小鼠在最后一次激發結束后 24 h，給予 2% 異戊巴比妥鈉（80 mg/kg）行腹腔注射麻醉。待麻醉滿意后，用 24 G 規格留置針行氣管插管，并接 1 mL 注射器將預冷磷酸鹽緩沖溶液緩慢地灌注于雙肺，反復沖洗 3 次，每次灌洗液回吸收率在 90% 以上則為合格。將收集的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar fluid，BALF）用 4 ℃、1 200 r/mim、離心 10 min，收集上清液并凍存于–80 ℃。心臟穿刺抽取血液，并離心收集上層血清。取肺組織，一部分進行蠟塊包埋，用于肺組織病理形態檢查，另一部分則將其凍存用于后續組織蛋白的提取。
1.2.3 肺組織蘇木精–伊紅及過碘酸希夫染色
首先將取下的左肺立即放于 4% 多聚甲醛固定 24 h，然后將組織放于由低到高的梯度酒精中脫水，隨后置于二甲苯中透明，最后行浸蠟及包埋組織。將蠟塊切成 5 μm 的厚度，采用蘇木精-伊紅染色觀察肺組織病理形態變化，炎癥評分表評估肺組織的炎癥程度；過碘酸希夫染色評估氣道杯狀細胞的增生程度。染色評分細則參考文獻[10]。
1.2.4 BALF 中白細胞總數及分類計數
將 BALF 中離心沉淀的細胞用 200 μL 磷酸鹽緩沖溶液 PBS 重懸，首先用血細胞計數板測量其總的炎癥細胞數，然后將重懸液滴于防脫載玻片上，根據試劑盒說明書采用瑞氏–姬姆薩染色來分類各炎癥細胞的數量，計算每張玻片內 200 個細胞中肺泡巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例。
1.2.5 血清、BALF 中炎癥介質及 IgE 的檢測
采用 ELISA 法檢測 BALF 中 IL-4、IL-5 和 IL-13 及血清中 IgE、OVA-specific-IgE 的濃度。實驗過程是根據試劑生產廠家的說明書進行的。利用酶標儀在 450 nm 處測定其反應，然后根據標準曲線測定各炎癥因子和 IgE 的濃度。
1.2.6 蛋白印跡法分析
將凍存的一部分肺組織放于冰上解凍，并用冰水再次清洗數次，用濾紙吸干組織表面的水分，稱量其重量。隨后，將肺組織勻漿，加入適當比例的增強型 RIPA 裂解液，在 4 ℃、12 000 r/min 下離心 10 min，取上清液。BCA 定量法來檢測肺組織中的蛋白質濃度。將含有 30 μg 的變性總蛋白用 10% SDS-PAGE 膠進行分離，并轉移到 0.45 μm PVDF 膜上。5% 的脫脂奶粉將膜在室溫進行阻斷 1 h，隨后在 4 ℃ 中過夜分別孵育抗體 p-p38、p-JNK、JNK、p38、β-actin。第 2 天加入二抗于搖床上室溫孵育 1 h，然后將 PVDF 膜在 TBST 液中洗 5 次，每次 10 min。最后，將 PVDF 膜用凝膠分析軟件測量其蛋白的含量。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。所有數據均以均數±標準差（
±s）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織病理改變
通過蘇木精–伊紅及過碘酸希夫染色法觀察，哮喘模型組支氣管腔內有黏液栓存在，氣道上皮細胞明顯受損，杯狀細胞增生明顯，且支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤。經統計分析發現，哮喘模型組肺組織的炎癥評分和氣道的杯狀細胞增生評分也明顯高于正常組（均 P<0.01）。經 MaR1 或地塞米松處理后的小鼠支氣管及肺組織損傷較模型組均明顯減輕，炎癥評分和杯狀細胞增生評分也都隨之下降（均 P<0.05）。地塞米松組的炎癥評分較 MaR1 組更低一些，差異有統計學意義（P<0.05），而兩組的杯狀細胞增生評分則無統計學差異（P>0.05）。結果見圖 1、2。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（×200）
a～d. 蘇木精–伊紅染色；e～h. 過碘酸希夫染色。a、e. 正常組；b、f. 哮喘模型組；c、g. MaR1 組；d、h. 地塞米松組。哮喘模型組支氣管腔內有黏液栓存在，氣道上皮細胞明顯受損，杯狀細胞增生明顯，且支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤。經 MaR1 或地塞米松處理后的小鼠支氣管及肺組織損傷較模型組均明顯減輕
圖2
MaR1 對哮喘小鼠肺組織中炎癥評分和氣道杯狀細胞增生評分的影響
a. 炎癥評分；b. 杯狀細胞增生評分。與正常組比較，#
2.2 MaR1 對 BALF 中炎癥細胞的影響
與正常組相比，哮喘模型組 BALF 中炎癥細胞總數明顯增加，巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量也明顯增多；與哮喘模型組比，地塞米松組上述各類炎癥細胞數量均有下降，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。MaR1 可致哮喘小鼠 BALF 中炎癥細胞總數、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數量明顯減少（均 P<0.05）。但 MaR1 對小鼠 BALF 中的巨噬細胞和淋巴細胞數量無明顯影響（P>0.05）。地塞米松組與 MaR1 組比較，僅淋巴細胞數量有所降低（P<0.05），炎癥細胞總數和其余各炎癥細胞數量均無明顯差異（P>0.05）。結果見圖 3。
圖3
MaR1 對 OVA 誘導的哮喘小鼠 BALF 中炎癥細胞數的影響
與正常組比較，#
2.3 MaR1 對 BALF、血清中炎癥介質和 IgE 的影響
喘模型組小鼠 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-13 及血清中 IgE、OVA-specific-IgE 的水平較正常組明顯增高，差異有統計學意義（均 P<0.01）；經 MaR1 或地塞米松處理后，BALF 及血清中的上述炎癥因子和 IgE 的水平均顯著下降（P<0.05）。地塞米松組與 MaR1 組比較，僅總 IgE 有所降低（P<0.05），其余各炎癥因子和 OVA-specific-IgE 的水平均無明顯差異（P>0.05）。結果見圖 4。
圖4
MaR1 抑制了 BALF 中 Th2 相關炎癥因子及血清中 IgE 的表達
a～e 分別為 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-13 及血清中 IgE、OVA-specific-IgE 表達。與正常組比較，#
2.4 MaR1 對肺組織中 MAPK 信號通路表達的影響
與正常組相比，哮喘模型組中肺組織 p-p38、p-JNK 的蛋白表達水平明顯升高，均差異有統計學意義（均 P<0.01）。給予 MaR1 處理后，肺組織中 p-p38、p-JNK 的蛋白表達水平均明顯降低，地塞米松處理后效果類似（均 P<0.05）。MaR1 組與地塞米松組比較，肺組織中 p-p38、p-JNK 的蛋白表達水平無明顯差異（P>0.05）。結果見圖 5。
圖5
MaR1 對 OVA 誘導的哮喘小鼠肺組織中 MAPK 信號通路的影響
a. 蛋白印跡檢測圖像，其中 DXM 為地塞米松，“–”表示陰性處理，“+”表示陽性處理；b、c. 分別為 p-JNK 與 p-p38 相對表達柱狀圖。與正常組比較，#
3 討論
哮喘的特點是氣道炎癥、IgE 分泌增多、嗜酸性粒細胞增加、淋巴細胞浸潤、黏液分泌增多[11-12]。這些物質可直接或間接損傷氣道結構，造成大量氣管上皮黏膜脫落和部分黏液栓塞。本研究也再次證實了哮喘的這些病理改變，利用 OVA 聯合氫氧化鋁處理會造成小鼠支氣管腔內有黏液栓存在，氣道上皮細胞明顯受損，杯狀細胞增生明顯，且支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，提示該方法可以成功建立了小鼠哮喘模型。本研究還發現，作為促炎癥消退介質，MaR1 可以減少肺組織的炎癥細胞浸潤和氣道杯狀細胞增生。與此同時，MaR1 可使 BALF 中炎癥細胞總數、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數量明顯減少，這與之前的研究一致[13]。提示 MaR1 可減輕哮喘小鼠的肺部炎癥反應。而且本研究發現，MaR1 抑制肺部炎癥反應的作用與地塞米松類似，但較地塞米松稍弱。
哮喘的發病機制復雜，尚不完全明確。其中，免疫系統異常在哮喘發病機制中扮演了重要的角色。經典免疫學認為 Th1/Th2 失衡是哮喘氣道炎癥發病的關鍵因素[14]。其中 Th2 淋巴細胞的活化是哮喘發生發展的重要環節，通過釋放 IL-13、IL-4 和 IL-5 等重要的炎癥細胞因子，刺激 IgE 的合成和炎癥細胞浸潤[15]。IgE 是介導 I 型超敏反應的重要免疫球蛋白。當過敏原與 IgE 抗體結合時，會誘導肥大細胞脫顆粒，釋放細胞因子，導致疾病的發生發展。在本研究中，給予哮喘小鼠 MaR1 處理后可降低 BALF 中 Th2 相關炎癥因子 IL-4、IL-5 和 IL-13 的水平。同時，我們的結果表明，MaR1 也明顯降低了血清中 IgE 和 OVA-specific-IgE 的水平。總的來說，這些結果表明 MaR1 減輕了 Th2 相關的免疫反應。提示 MaR1 可能是通過減少炎癥細胞因子的產生和釋放，從而進一步減輕哮喘小鼠氣道的炎癥反應。而且本研究發現，MaR1 降低 IL-4、IL-5、IL-13、和 OVA-specific-IgE 水平的作用與地塞米松一致。
絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的經典信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、C-JUN 氨基端激酶（JNK）、p38MAPK 等[16]。MAPKs 通路的激活可使下游激酶和細胞內或核轉錄因子磷酸化，介導基因表達和炎性因子的產生，并在炎癥細胞的許多方面起關鍵作用。一些研究表明，持續激活 MAPKs / NF-κB 與哮喘的發展有關[17-20]。c-Jun 氨基端激酶（JNK）是 MAPK 的三個亞家族之一，其中 JNK 通路與慢性炎癥有關[21]。有研究表明脂多糖可通過 JNK 信號通路誘導支氣管上皮細胞發生炎癥，并誘導細胞因子 IL-6 和 IL-8 的釋放[22-24]。同時，有研究表明了 JNK 信號通路可通過調控 Th1 /Th2 比例參與哮喘的發生和發展[25]。本研究發現，哮喘模型小鼠肺組織中 p38MAPK、JNK 的磷酸化蛋白均明顯升高，而經 MaR1 或地塞米松處理后可以抑制 p-p38 與 p-JNK 的表達。提示 MaR1 可能是通過下調 MAPKs 信號通路的表達，進一步減少炎癥細胞因子的產生和釋放，從而減輕了哮喘小鼠氣道的炎癥反應。而且 MaR1 的這種作用與地塞米松類似。
綜上所述，MaR1 能夠抑制 Th2 相關的細胞因子和 IgE 的產生及釋放，有效地減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥反應和黏液生成，作用效果與地塞米松相近，其作用機制可能與下調 MAPKs 信號通路的表達有關。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是呼吸系統常見的一種慢性氣道炎癥性疾病。全世界約有 3 億人患有哮喘，到 2025 年可能達到 4 億人[1]。許多研究表明，多種炎癥介質如白介素（interleukin，IL）-4、IL-5 和 IL-13，由活化的炎癥細胞特別是 Th2 細胞合成并釋放，最終誘導氣道黏液高分泌，這是哮喘發病的關鍵[2]。糖皮質激素具有良好的抗炎作用，已成為哮喘治療的首選藥物[3]，但長期使用會產生明顯甚至不可逆的不良反應，如骨質疏松、肌肉萎縮、皮質醇功能亢進及誘發心血管疾病等。此外，約 5%～10% 的哮喘患者對激素不敏感，存在糖皮質激素抵抗。因此，這些挑戰突出了開發新的控制哮喘藥物的必要性。Maresin-1（MaR1）是由巨噬細胞來源的二十二碳六烯酸衍生的促炎癥消退介質。研究發現，MaR1 不僅能夠促進巨噬細胞的趨化，活化并增強其吞噬功能，還能抑制中性粒細胞的浸潤并促進其凋亡，從多個環節減輕炎癥反應強度，從而促進炎癥的消退[4]。研究顯示，MaR1 對類風濕關節炎、結腸炎、急性肺損傷和腎缺血/再灌注損傷等動物模型的炎癥反應具有一定的抑制作用[5-8]。類風濕關節炎和哮喘均與 Th1/Th2 及 Th17/Treg 的失衡有關。MaR1 可通過調節 Th17 /Treg 的失衡對類風濕關節炎小鼠模型有改善效應[6]。而 Th17/Treg 失衡在哮喘的發病中也有較為重要的作用，因此推測 MaR1 也可能對哮喘有一定治療作用。目前，MaR1 在支氣管哮喘方面的研究極少。因此，本研究旨在探討 MaR1 在體內是否能夠減輕卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導的哮喘小鼠的氣道炎癥及黏液高分泌，并進一步探討其可能的分子機制。
1 材料與方法
1.1 材料
雌性 BALB/c 小鼠，SPF 級，6～8 周，20 g，由川北醫學院實驗動物中心提供［許可證號：SYXK（川）2018-18］，并通過動物倫理委員會許可。OVA（grade V，Sigma，USA）、氫氧化鋁（Sigma，USA）、MaR1（Cayman，USA）、抗 p-p38（華安生物）、抗 p-JNK（華安生物）、p38（華安生物）、JNK（華安生物）、β 肌動蛋白（β-actin，博奧生）、羊抗兔 lgG（博士德生物）、蘇木精–伊紅染液（博士德生物）、瑞式–姬姆薩染液（珠海貝索生物），以及 IL-4、IL-5、IL-13、IgE 和 OVA-specific-IgE 試劑盒（欣博盛）。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組與哮喘模型建立
隨機將 24 只小鼠分成 4 個組，每組 6 只小鼠，分別為正常組、哮喘模型組、MaR1 組及地塞米松組。依據 Liu 等[9]的方法制作哮喘模型，并進行了適當的調整。正常組致敏及激發階段均給予生理鹽水處理，其余三組小鼠均在第 0、7、14 d 給予腹腔注射混合液 0.2 mL，即 OVA 20 μg、氫氧化鋁 2 mg。自第 21 d 起，連續 8 d 進入激發階段，給予 1% OVA 進行霧化，每次約 30 min。于第 25 d 至第 28 d，每天在霧化前 20 min，從尾靜脈給每只小鼠注射 100 μL 藥物，分別為 1 ng 的 MaR1（MaR1 組）或 1 mg/kg 的地塞米松（地塞米松組），正常組和哮喘模型組則給予生理鹽水干預。
1.2.2 支氣管肺泡灌洗液、血清、肺組織的收集
小鼠在最后一次激發結束后 24 h，給予 2% 異戊巴比妥鈉（80 mg/kg）行腹腔注射麻醉。待麻醉滿意后，用 24 G 規格留置針行氣管插管，并接 1 mL 注射器將預冷磷酸鹽緩沖溶液緩慢地灌注于雙肺，反復沖洗 3 次，每次灌洗液回吸收率在 90% 以上則為合格。將收集的支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar fluid，BALF）用 4 ℃、1 200 r/mim、離心 10 min，收集上清液并凍存于–80 ℃。心臟穿刺抽取血液，并離心收集上層血清。取肺組織，一部分進行蠟塊包埋，用于肺組織病理形態檢查，另一部分則將其凍存用于后續組織蛋白的提取。
1.2.3 肺組織蘇木精–伊紅及過碘酸希夫染色
首先將取下的左肺立即放于 4% 多聚甲醛固定 24 h，然后將組織放于由低到高的梯度酒精中脫水，隨后置于二甲苯中透明，最后行浸蠟及包埋組織。將蠟塊切成 5 μm 的厚度，采用蘇木精-伊紅染色觀察肺組織病理形態變化，炎癥評分表評估肺組織的炎癥程度；過碘酸希夫染色評估氣道杯狀細胞的增生程度。染色評分細則參考文獻[10]。
1.2.4 BALF 中白細胞總數及分類計數
將 BALF 中離心沉淀的細胞用 200 μL 磷酸鹽緩沖溶液 PBS 重懸，首先用血細胞計數板測量其總的炎癥細胞數，然后將重懸液滴于防脫載玻片上，根據試劑盒說明書采用瑞氏–姬姆薩染色來分類各炎癥細胞的數量，計算每張玻片內 200 個細胞中肺泡巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的比例。
1.2.5 血清、BALF 中炎癥介質及 IgE 的檢測
采用 ELISA 法檢測 BALF 中 IL-4、IL-5 和 IL-13 及血清中 IgE、OVA-specific-IgE 的濃度。實驗過程是根據試劑生產廠家的說明書進行的。利用酶標儀在 450 nm 處測定其反應，然后根據標準曲線測定各炎癥因子和 IgE 的濃度。
1.2.6 蛋白印跡法分析
將凍存的一部分肺組織放于冰上解凍，并用冰水再次清洗數次，用濾紙吸干組織表面的水分，稱量其重量。隨后，將肺組織勻漿，加入適當比例的增強型 RIPA 裂解液，在 4 ℃、12 000 r/min 下離心 10 min，取上清液。BCA 定量法來檢測肺組織中的蛋白質濃度。將含有 30 μg 的變性總蛋白用 10% SDS-PAGE 膠進行分離，并轉移到 0.45 μm PVDF 膜上。5% 的脫脂奶粉將膜在室溫進行阻斷 1 h，隨后在 4 ℃ 中過夜分別孵育抗體 p-p38、p-JNK、JNK、p38、β-actin。第 2 天加入二抗于搖床上室溫孵育 1 h，然后將 PVDF 膜在 TBST 液中洗 5 次，每次 10 min。最后，將 PVDF 膜用凝膠分析軟件測量其蛋白的含量。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。所有數據均以均數±標準差（±s）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織病理改變
通過蘇木精–伊紅及過碘酸希夫染色法觀察，哮喘模型組支氣管腔內有黏液栓存在，氣道上皮細胞明顯受損，杯狀細胞增生明顯，且支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤。經統計分析發現，哮喘模型組肺組織的炎癥評分和氣道的杯狀細胞增生評分也明顯高于正常組（均 P<0.01）。經 MaR1 或地塞米松處理后的小鼠支氣管及肺組織損傷較模型組均明顯減輕，炎癥評分和杯狀細胞增生評分也都隨之下降（均 P<0.05）。地塞米松組的炎癥評分較 MaR1 組更低一些，差異有統計學意義（P<0.05），而兩組的杯狀細胞增生評分則無統計學差異（P>0.05）。結果見圖 1、2。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（×200）
a～d. 蘇木精–伊紅染色；e～h. 過碘酸希夫染色。a、e. 正常組；b、f. 哮喘模型組；c、g. MaR1 組；d、h. 地塞米松組。哮喘模型組支氣管腔內有黏液栓存在，氣道上皮細胞明顯受損，杯狀細胞增生明顯，且支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤。經 MaR1 或地塞米松處理后的小鼠支氣管及肺組織損傷較模型組均明顯減輕
圖2
MaR1 對哮喘小鼠肺組織中炎癥評分和氣道杯狀細胞增生評分的影響
a. 炎癥評分；b. 杯狀細胞增生評分。與正常組比較，#
2.2 MaR1 對 BALF 中炎癥細胞的影響
與正常組相比，哮喘模型組 BALF 中炎癥細胞總數明顯增加，巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數量也明顯增多；與哮喘模型組比，地塞米松組上述各類炎癥細胞數量均有下降，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。MaR1 可致哮喘小鼠 BALF 中炎癥細胞總數、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞數量明顯減少（均 P<0.05）。但 MaR1 對小鼠 BALF 中的巨噬細胞和淋巴細胞數量無明顯影響（P>0.05）。地塞米松組與 MaR1 組比較，僅淋巴細胞數量有所降低（P<0.05），炎癥細胞總數和其余各炎癥細胞數量均無明顯差異（P>0.05）。結果見圖 3。
圖3
MaR1 對 OVA 誘導的哮喘小鼠 BALF 中炎癥細胞數的影響
與正常組比較，#
2.3 MaR1 對 BALF、血清中炎癥介質和 IgE 的影響
喘模型組小鼠 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-13 及血清中 IgE、OVA-specific-IgE 的水平較正常組明顯增高，差異有統計學意義（均 P<0.01）；經 MaR1 或地塞米松處理后，BALF 及血清中的上述炎癥因子和 IgE 的水平均顯著下降（P<0.05）。地塞米松組與 MaR1 組比較，僅總 IgE 有所降低（P<0.05），其余各炎癥因子和 OVA-specific-IgE 的水平均無明顯差異（P>0.05）。結果見圖 4。
圖4
MaR1 抑制了 BALF 中 Th2 相關炎癥因子及血清中 IgE 的表達
a～e 分別為 BALF 中 IL-4、IL-5、IL-13 及血清中 IgE、OVA-specific-IgE 表達。與正常組比較，#
2.4 MaR1 對肺組織中 MAPK 信號通路表達的影響
與正常組相比，哮喘模型組中肺組織 p-p38、p-JNK 的蛋白表達水平明顯升高，均差異有統計學意義（均 P<0.01）。給予 MaR1 處理后，肺組織中 p-p38、p-JNK 的蛋白表達水平均明顯降低，地塞米松處理后效果類似（均 P<0.05）。MaR1 組與地塞米松組比較，肺組織中 p-p38、p-JNK 的蛋白表達水平無明顯差異（P>0.05）。結果見圖 5。
圖5
MaR1 對 OVA 誘導的哮喘小鼠肺組織中 MAPK 信號通路的影響
a. 蛋白印跡檢測圖像，其中 DXM 為地塞米松，“–”表示陰性處理，“+”表示陽性處理；b、c. 分別為 p-JNK 與 p-p38 相對表達柱狀圖。與正常組比較，#
3 討論
哮喘的特點是氣道炎癥、IgE 分泌增多、嗜酸性粒細胞增加、淋巴細胞浸潤、黏液分泌增多[11-12]。這些物質可直接或間接損傷氣道結構，造成大量氣管上皮黏膜脫落和部分黏液栓塞。本研究也再次證實了哮喘的這些病理改變，利用 OVA 聯合氫氧化鋁處理會造成小鼠支氣管腔內有黏液栓存在，氣道上皮細胞明顯受損，杯狀細胞增生明顯，且支氣管和血管周圍有大量炎癥細胞浸潤，提示該方法可以成功建立了小鼠哮喘模型。本研究還發現，作為促炎癥消退介質，MaR1 可以減少肺組織的炎癥細胞浸潤和氣道杯狀細胞增生。與此同時，MaR1 可使 BALF 中炎癥細胞總數、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數量明顯減少，這與之前的研究一致[13]。提示 MaR1 可減輕哮喘小鼠的肺部炎癥反應。而且本研究發現，MaR1 抑制肺部炎癥反應的作用與地塞米松類似，但較地塞米松稍弱。
哮喘的發病機制復雜，尚不完全明確。其中，免疫系統異常在哮喘發病機制中扮演了重要的角色。經典免疫學認為 Th1/Th2 失衡是哮喘氣道炎癥發病的關鍵因素[14]。其中 Th2 淋巴細胞的活化是哮喘發生發展的重要環節，通過釋放 IL-13、IL-4 和 IL-5 等重要的炎癥細胞因子，刺激 IgE 的合成和炎癥細胞浸潤[15]。IgE 是介導 I 型超敏反應的重要免疫球蛋白。當過敏原與 IgE 抗體結合時，會誘導肥大細胞脫顆粒，釋放細胞因子，導致疾病的發生發展。在本研究中，給予哮喘小鼠 MaR1 處理后可降低 BALF 中 Th2 相關炎癥因子 IL-4、IL-5 和 IL-13 的水平。同時，我們的結果表明，MaR1 也明顯降低了血清中 IgE 和 OVA-specific-IgE 的水平。總的來說，這些結果表明 MaR1 減輕了 Th2 相關的免疫反應。提示 MaR1 可能是通過減少炎癥細胞因子的產生和釋放，從而進一步減輕哮喘小鼠氣道的炎癥反應。而且本研究發現，MaR1 降低 IL-4、IL-5、IL-13、和 OVA-specific-IgE 水平的作用與地塞米松一致。
絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的經典信號通路包括細胞外信號調節激酶（ERK）、C-JUN 氨基端激酶（JNK）、p38MAPK 等[16]。MAPKs 通路的激活可使下游激酶和細胞內或核轉錄因子磷酸化，介導基因表達和炎性因子的產生，并在炎癥細胞的許多方面起關鍵作用。一些研究表明，持續激活 MAPKs / NF-κB 與哮喘的發展有關[17-20]。c-Jun 氨基端激酶（JNK）是 MAPK 的三個亞家族之一，其中 JNK 通路與慢性炎癥有關[21]。有研究表明脂多糖可通過 JNK 信號通路誘導支氣管上皮細胞發生炎癥，并誘導細胞因子 IL-6 和 IL-8 的釋放[22-24]。同時，有研究表明了 JNK 信號通路可通過調控 Th1 /Th2 比例參與哮喘的發生和發展[25]。本研究發現，哮喘模型小鼠肺組織中 p38MAPK、JNK 的磷酸化蛋白均明顯升高，而經 MaR1 或地塞米松處理后可以抑制 p-p38 與 p-JNK 的表達。提示 MaR1 可能是通過下調 MAPKs 信號通路的表達，進一步減少炎癥細胞因子的產生和釋放，從而減輕了哮喘小鼠氣道的炎癥反應。而且 MaR1 的這種作用與地塞米松類似。
綜上所述，MaR1 能夠抑制 Th2 相關的細胞因子和 IgE 的產生及釋放，有效地減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥反應和黏液生成，作用效果與地塞米松相近，其作用機制可能與下調 MAPKs 信號通路的表達有關。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
