引用本文： 鄭琳, 王麗, 毛山, 周丹陽, 谷偉, 史瑩. 支氣管哮喘患者肝 X 受體、蛋白磷酸酶 1A 的表達及與氣道重塑的關系研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(3): 229-233. doi: 10.7507/1671-6205.201905031 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是世界范圍內患病率和死亡率都很高的慢性疾病之一[1]。多數患者從兒童或青少年即開始發病，雖經短期治療后炎癥能夠緩解，但氣道重塑仍持續存在并進行性發展[2-3]，從而導致氣道壁形態學上的改變越來越嚴重。目前認為氣道重塑是造成不可逆性氣流阻塞和重癥哮喘的病理基礎[4]。哮喘氣道重塑發病機制較為復雜，目前尚未完全闡明，其中 TGF-β/Smad 信號通路在參與氣道重塑過程中發揮了重要的作用[5]。既往的研究著重對 TGF-β/Smad 信號通路和氣道重塑的關系進行研究，而對 TGF-β/Smad 通路的調控蛋白研究甚少。蛋白磷酸酶 1A（protein phosphatase 1A，PPM1A）是 TGF-β/Smad 信號通路的重要調控蛋白，能明顯抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）引起的增殖及轉錄反應，終止 TGF-β/Smad 信號活動。PPM1A 失表達能增強 TGF-β 信號通路[6-7]。因此 PPM1A 在哮喘患者體內表達水平的高低可能導致患者氣道重塑水平的不同。肝 X 受體（liver X receptors，LXRs）屬于Ⅱ型核受體，有 LXRα 和 LXRβ 兩個亞型。研究發現 LXRs 有抑制 TGF-β/Smad 信號通路的作用[8]。LXRβ 與 TGF-β 受體存在相互作用，LXRs 能有效地抑制 TGF-β 受體調節的轉錄反應[9]。但 LXRs 及 PPM1A 在哮喘患者體內的表達及作用均尚不清楚，本研究擬檢測 LXRs 和 PPM1A 在哮喘患者血清中的表達，了解 LXRs 和 PPM1A 與氣道重塑的關系。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
本研究為前瞻性研究。選取 2017 年 1 月至 2018 年 6 月在南京市第一醫院就診的哮喘患者 60 例，輕中度哮喘及重癥哮喘患者各 30 例。年齡 18 歲以上（包含 18 歲）、75 歲以下，性別、民族不限，符合中華醫學會呼吸病學分會制訂的《支氣管哮喘防治指南》[10]的診斷標準。重癥哮喘患者的控制標準按照 GINA 的標準進行綜合、全面的評估[11]，符合重癥哮喘未控制的常見特征：（1）癥狀控制差：哮喘控制問卷評分>1.5 分，哮喘控制測試評分<20 分，或符合 GINA 定義的未控制；（2）頻繁急性發作：前一年需要 2 次或以上連續使用全身性激素（每次 3 d 以上）；（3）嚴重急性發作：前一年至少 1 次住院、進入重癥加強治療病房或需要機械通氣；（4）持續性氣流受限：盡管給予充分的支氣管舒張劑治療，仍存在持續的氣流受限，即第 1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred）<80%，第 1 秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）低于正常值下限；（5）高劑量吸入性糖皮質激素或全身性糖皮質激素（或其他生物制劑）可以維持控制，但只要減量哮喘就會加重。輕中度哮喘患者為達不到上述重癥標準的患者。選擇體檢中心健康對照者 30 人。各組在年齡、性別上匹配。本研究獲得了南京市第一醫院倫理委員會的批準，并獲得入選者的知情同意。本研究不存在經濟、物質以及社會關系方面的利益沖突。
哮喘組排除標準：排除患慢性阻塞性肺疾病（參照中華醫學會呼吸病學分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（2013 年修訂版）[12]的診斷標準）、支氣管擴張、肺結核、肺栓塞、肺動脈高壓、間質性肺疾病和支氣管肺癌；有過敏性疾病、風濕系統疾病或免疫功能缺陷；依從性差者；4 周內有證據表明有呼吸道感染或相關癥狀；妊娠或哺乳期女性；近期有喪失行為能力的精神疾病病史。
1.2 方法
1.2.1 儀器和試劑
肺功能儀（耶格公司，德國），CT 機（菲利浦公司，荷蘭），人 TGF-β1、Smad2 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Invitrogen 公司，美國），人 LXRα、LXRβ 及 PPM1A 的 ELISA 試劑盒（Abcam 公司，英國），酶標儀（Bio-rad 公司，美國）。
1.2.2 一般資料收集
收集受試者年齡、性別、病程以及吸煙指數等資料。
1.2.3 肺功能檢查
所有受試者在入組前檢測肺功能，記錄 FEV1%pred、FEV1/FVC、呼氣峰流速占預計值百分比（PEF%pred），分析氣流受限程度。
1.2.4 高分辨率 CT 檢查
在入組后使用 GE HD750CT 機對所有受試者進行胸部高分辨率 CT（high-resolution computed tomography，HRCT）掃描。運用薄層技術（1.0 mm 層厚，1.0 mm 間距），選擇主動脈弓層面上下各 3 個層面掃描，掃描電壓 120 MV、矩陣 512×512，采用骨算法進行重建。對每位患者進行深吸氣末屏氣相和深呼氣末屏氣相掃描。參考文獻[13]的方法，每個層面選擇右肺 2 個影像清晰的氣道進行測量，每個氣道的每項指標需進行 2 次測量，取平均值作為每次的測量值。測量指標：氣道內徑（L）、氣道外徑（D）、氣道腔面積（Ai）、氣道總面積（Ao）。計算指標：氣道壁厚度（T）：（D–L）/2；氣道壁面積（WA）：Ao–Ai；氣道壁面積占氣道總橫截面積的百分比（WA%）：（Ao–Ai）/Ao×100%。選用 T/D、WA% 作為氣道重塑評價指標。
1.2.5 血清 ELISA 檢測
無菌采集外周靜脈血 5 mL，乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝，4 ℃、3 000 r/min 下離心 5 min，分離血清，保存在 –70 ℃ 冰箱中。采用 ELISA 法定量檢測血清 LXRα、LXRβ、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 的水平。操作步驟嚴格按照說明書執行，根據吸光度值計算出標本中蛋白水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 12 統計軟件。結果以均數±標準差（
±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用成組 t 檢驗對各組進行比較，P≤0.05 為差異有統計學意義。采用 Pearson 相關分析法進行相關性分析。
2 結果
2.1 受試者一般資料及肺功能
各組年齡、性別、病程及吸煙指數無明顯差異（表 1）。輕中度哮喘組較對照組的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差異有統計學意義（均 P<0.05），而重癥哮喘組較輕中度哮喘組的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差異有統計學意義（均 P<0.05），見表 2。
表1
受試者一般資料（n=30）
表2
受試者肺功能情況（n=30，
）
2.2 受試者氣道重塑情況
HRCT 測定支氣管氣道壁面積和厚度，輕中度哮喘組的 T/D 及 WA% 明顯高于對照組，差異有統計學意義（均 P<0.05），重癥哮喘組的 T/D 及 WA% 明顯高于輕中度哮喘組，差異有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 3。
表3
HRCT 測定的支氣管氣道壁面積和厚度（n=30，
）
2.3 受試者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平
輕中度哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 的值較對照組明顯增高，差異有統計學意義（均 P<0.05），重癥哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 較對照組明顯增高，差異有統計學意義（均 P<0.05），但輕中度哮喘組及重癥哮喘組之間無明顯差異。輕中度哮喘組的 TGF-β1 及 Smad2 明顯高于對照組，差異有統計學意義（均 P<0.05）。而重癥哮喘組的 TGF-β1 及 Smad2 明顯高于輕中度哮喘組，差異有統計學意義（均 P<0.05）。輕中度哮喘組的 PPM1A 明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），而重癥哮喘組的血清 PPM1A 較輕中度哮喘組明顯降低（P<0.05）。結果見表 4。
表4
受試者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平（n=30，
）
2.4 相關性分析
對 TGF-β1 和 T/D 及 WA% 進行相關性分析，結果提示：TGF-β1 與 T/D 和 WA% 呈正相關，r 分別為 0.452 及 0.514。Smad2 與 T/D 及 WA% 呈正相關，r 分別為 0.418 及 0.477。PPM1A 與 T/D 及 WA% 呈負相關，r 分別為 –0.557 及 –0.671。LXRα 和 LXRβ 與 T/D 及 WA% 均無相關性，均 P>0.05。
3 討論
本研究以我院呼吸與危重癥醫學科門診就診的哮喘患者為研究對象，通過檢測哮喘患者胸部 HRCT 來判斷患者氣道重塑水平，同時檢測外周血 LXRs 及 PPM1A 的水平，并進一步分析哮喘患者血清 LXRs 及 PPM1A 與氣道重塑的關系。HRCT 被用于評估哮喘患者的氣道重塑程度，可識別 100～200 μm 的結構，顯示直徑 1.5～2 mm 的氣道，相對支氣管鏡檢查更簡單無創[13]。LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad 的 ELISA 試劑盒均可購買獲得，從而確保了研究的順利開展。本研究結果顯示，哮喘患者存在不同程度的氣道重塑，重癥哮喘患者氣道重塑程度較輕中度哮喘患者氣道重塑水平更高。此外，哮喘患者 PPM1A 表達較健康人降低，提示其與哮喘患者氣道重塑程度有關。
PPM1A 是 TGF-β/Smad 信號通路重要的調控蛋白，能終止 TGF-β 信號傳導[14]。哮喘患者血清 PPM1A 較健康者表達減少，且與氣道重塑水平呈負相關。推測哮喘患者體內低水平的 PPM1A 有可能導致機體 TGF-β/Smad 信號通路的作用增強，可能導致是哮喘患者氣道重塑的原因之一。此外，重癥哮喘患者的 PPM1A 水平較其他受試者低，而 TGF-β/Smad 水平較其他受試者高，可能是其氣道重塑較嚴重的原因。
本研究檢測了 LXRs 在哮喘患者血清中的表達水平。LXRs 是核受體，活化后有抑制 TGF-β/Smad 信號傳導的作用[15]，并能抑制哮喘動物模型的 IgE 生成及氣道重塑[16-17]。我們的研究發現，哮喘患者血清 LXRs 水平較健康者增高，提示 LXRs 可能在哮喘的慢性氣道炎癥過程中反應性增高。但重癥哮喘患者和輕中度哮喘患者之間 LXRs 表達無差異，因而 LXRs 水平高低無法反映哮喘氣道重塑的嚴重程度。由于 LXRs 的功能主要由配體激活所致，而目前尚不清楚哮喘患者體內 LXRs 配體的種類，加上我們的研究未對 LXRs 是否被活化進行檢測，因此其抑制氣道重塑的機制尚仍待進一步研究。
綜上所述，哮喘患者氣道中 TGF-β/Smad 的表達水平較健康人增加，PPM1A 表達較健康人降低，可能與氣道重塑有關。哮喘患者 LXRs 表達較健康者增高，但與氣道重塑無相關性。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是世界范圍內患病率和死亡率都很高的慢性疾病之一[1]。多數患者從兒童或青少年即開始發病，雖經短期治療后炎癥能夠緩解，但氣道重塑仍持續存在并進行性發展[2-3]，從而導致氣道壁形態學上的改變越來越嚴重。目前認為氣道重塑是造成不可逆性氣流阻塞和重癥哮喘的病理基礎[4]。哮喘氣道重塑發病機制較為復雜，目前尚未完全闡明，其中 TGF-β/Smad 信號通路在參與氣道重塑過程中發揮了重要的作用[5]。既往的研究著重對 TGF-β/Smad 信號通路和氣道重塑的關系進行研究，而對 TGF-β/Smad 通路的調控蛋白研究甚少。蛋白磷酸酶 1A（protein phosphatase 1A，PPM1A）是 TGF-β/Smad 信號通路的重要調控蛋白，能明顯抑制轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）引起的增殖及轉錄反應，終止 TGF-β/Smad 信號活動。PPM1A 失表達能增強 TGF-β 信號通路[6-7]。因此 PPM1A 在哮喘患者體內表達水平的高低可能導致患者氣道重塑水平的不同。肝 X 受體（liver X receptors，LXRs）屬于Ⅱ型核受體，有 LXRα 和 LXRβ 兩個亞型。研究發現 LXRs 有抑制 TGF-β/Smad 信號通路的作用[8]。LXRβ 與 TGF-β 受體存在相互作用，LXRs 能有效地抑制 TGF-β 受體調節的轉錄反應[9]。但 LXRs 及 PPM1A 在哮喘患者體內的表達及作用均尚不清楚，本研究擬檢測 LXRs 和 PPM1A 在哮喘患者血清中的表達，了解 LXRs 和 PPM1A 與氣道重塑的關系。
1 資料和方法
1.1 臨床資料
本研究為前瞻性研究。選取 2017 年 1 月至 2018 年 6 月在南京市第一醫院就診的哮喘患者 60 例，輕中度哮喘及重癥哮喘患者各 30 例。年齡 18 歲以上（包含 18 歲）、75 歲以下，性別、民族不限，符合中華醫學會呼吸病學分會制訂的《支氣管哮喘防治指南》[10]的診斷標準。重癥哮喘患者的控制標準按照 GINA 的標準進行綜合、全面的評估[11]，符合重癥哮喘未控制的常見特征：（1）癥狀控制差：哮喘控制問卷評分>1.5 分，哮喘控制測試評分<20 分，或符合 GINA 定義的未控制；（2）頻繁急性發作：前一年需要 2 次或以上連續使用全身性激素（每次 3 d 以上）；（3）嚴重急性發作：前一年至少 1 次住院、進入重癥加強治療病房或需要機械通氣；（4）持續性氣流受限：盡管給予充分的支氣管舒張劑治療，仍存在持續的氣流受限，即第 1 秒用力呼氣容積占預計值百分比（FEV1%pred）<80%，第 1 秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值（FEV1/FVC）低于正常值下限；（5）高劑量吸入性糖皮質激素或全身性糖皮質激素（或其他生物制劑）可以維持控制，但只要減量哮喘就會加重。輕中度哮喘患者為達不到上述重癥標準的患者。選擇體檢中心健康對照者 30 人。各組在年齡、性別上匹配。本研究獲得了南京市第一醫院倫理委員會的批準，并獲得入選者的知情同意。本研究不存在經濟、物質以及社會關系方面的利益沖突。
哮喘組排除標準：排除患慢性阻塞性肺疾病（參照中華醫學會呼吸病學分會制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（2013 年修訂版）[12]的診斷標準）、支氣管擴張、肺結核、肺栓塞、肺動脈高壓、間質性肺疾病和支氣管肺癌；有過敏性疾病、風濕系統疾病或免疫功能缺陷；依從性差者；4 周內有證據表明有呼吸道感染或相關癥狀；妊娠或哺乳期女性；近期有喪失行為能力的精神疾病病史。
1.2 方法
1.2.1 儀器和試劑
肺功能儀（耶格公司，德國），CT 機（菲利浦公司，荷蘭），人 TGF-β1、Smad2 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Invitrogen 公司，美國），人 LXRα、LXRβ 及 PPM1A 的 ELISA 試劑盒（Abcam 公司，英國），酶標儀（Bio-rad 公司，美國）。
1.2.2 一般資料收集
收集受試者年齡、性別、病程以及吸煙指數等資料。
1.2.3 肺功能檢查
所有受試者在入組前檢測肺功能，記錄 FEV1%pred、FEV1/FVC、呼氣峰流速占預計值百分比（PEF%pred），分析氣流受限程度。
1.2.4 高分辨率 CT 檢查
在入組后使用 GE HD750CT 機對所有受試者進行胸部高分辨率 CT（high-resolution computed tomography，HRCT）掃描。運用薄層技術（1.0 mm 層厚，1.0 mm 間距），選擇主動脈弓層面上下各 3 個層面掃描，掃描電壓 120 MV、矩陣 512×512，采用骨算法進行重建。對每位患者進行深吸氣末屏氣相和深呼氣末屏氣相掃描。參考文獻[13]的方法，每個層面選擇右肺 2 個影像清晰的氣道進行測量，每個氣道的每項指標需進行 2 次測量，取平均值作為每次的測量值。測量指標：氣道內徑（L）、氣道外徑（D）、氣道腔面積（Ai）、氣道總面積（Ao）。計算指標：氣道壁厚度（T）：（D–L）/2；氣道壁面積（WA）：Ao–Ai；氣道壁面積占氣道總橫截面積的百分比（WA%）：（Ao–Ai）/Ao×100%。選用 T/D、WA% 作為氣道重塑評價指標。
1.2.5 血清 ELISA 檢測
無菌采集外周靜脈血 5 mL，乙二胺四乙酸二鈉鹽抗凝，4 ℃、3 000 r/min 下離心 5 min，分離血清，保存在 –70 ℃ 冰箱中。采用 ELISA 法定量檢測血清 LXRα、LXRβ、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 的水平。操作步驟嚴格按照說明書執行，根據吸光度值計算出標本中蛋白水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 12 統計軟件。結果以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，采用成組 t 檢驗對各組進行比較，P≤0.05 為差異有統計學意義。采用 Pearson 相關分析法進行相關性分析。
2 結果
2.1 受試者一般資料及肺功能
各組年齡、性別、病程及吸煙指數無明顯差異（表 1）。輕中度哮喘組較對照組的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差異有統計學意義（均 P<0.05），而重癥哮喘組較輕中度哮喘組的 FEV1%pred、FEV1/FVC 和 PEF%pred 降低，差異有統計學意義（均 P<0.05），見表 2。
表1
受試者一般資料（n=30）
表2
受試者肺功能情況（n=30，）
2.2 受試者氣道重塑情況
HRCT 測定支氣管氣道壁面積和厚度，輕中度哮喘組的 T/D 及 WA% 明顯高于對照組，差異有統計學意義（均 P<0.05），重癥哮喘組的 T/D 及 WA% 明顯高于輕中度哮喘組，差異有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 3。
表3
HRCT 測定的支氣管氣道壁面積和厚度（n=30，）
2.3 受試者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平
輕中度哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 的值較對照組明顯增高，差異有統計學意義（均 P<0.05），重癥哮喘患者血清 LXRα 及 LXRβ 較對照組明顯增高，差異有統計學意義（均 P<0.05），但輕中度哮喘組及重癥哮喘組之間無明顯差異。輕中度哮喘組的 TGF-β1 及 Smad2 明顯高于對照組，差異有統計學意義（均 P<0.05）。而重癥哮喘組的 TGF-β1 及 Smad2 明顯高于輕中度哮喘組，差異有統計學意義（均 P<0.05）。輕中度哮喘組的 PPM1A 明顯低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），而重癥哮喘組的血清 PPM1A 較輕中度哮喘組明顯降低（P<0.05）。結果見表 4。
表4
受試者血清 LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad2 水平（n=30，）
2.4 相關性分析
對 TGF-β1 和 T/D 及 WA% 進行相關性分析，結果提示：TGF-β1 與 T/D 和 WA% 呈正相關，r 分別為 0.452 及 0.514。Smad2 與 T/D 及 WA% 呈正相關，r 分別為 0.418 及 0.477。PPM1A 與 T/D 及 WA% 呈負相關，r 分別為 –0.557 及 –0.671。LXRα 和 LXRβ 與 T/D 及 WA% 均無相關性，均 P>0.05。
3 討論
本研究以我院呼吸與危重癥醫學科門診就診的哮喘患者為研究對象，通過檢測哮喘患者胸部 HRCT 來判斷患者氣道重塑水平，同時檢測外周血 LXRs 及 PPM1A 的水平，并進一步分析哮喘患者血清 LXRs 及 PPM1A 與氣道重塑的關系。HRCT 被用于評估哮喘患者的氣道重塑程度，可識別 100～200 μm 的結構，顯示直徑 1.5～2 mm 的氣道，相對支氣管鏡檢查更簡單無創[13]。LXRs、PPM1A、TGF-β1 及 Smad 的 ELISA 試劑盒均可購買獲得，從而確保了研究的順利開展。本研究結果顯示，哮喘患者存在不同程度的氣道重塑，重癥哮喘患者氣道重塑程度較輕中度哮喘患者氣道重塑水平更高。此外，哮喘患者 PPM1A 表達較健康人降低，提示其與哮喘患者氣道重塑程度有關。
PPM1A 是 TGF-β/Smad 信號通路重要的調控蛋白，能終止 TGF-β 信號傳導[14]。哮喘患者血清 PPM1A 較健康者表達減少，且與氣道重塑水平呈負相關。推測哮喘患者體內低水平的 PPM1A 有可能導致機體 TGF-β/Smad 信號通路的作用增強，可能導致是哮喘患者氣道重塑的原因之一。此外，重癥哮喘患者的 PPM1A 水平較其他受試者低，而 TGF-β/Smad 水平較其他受試者高，可能是其氣道重塑較嚴重的原因。
本研究檢測了 LXRs 在哮喘患者血清中的表達水平。LXRs 是核受體，活化后有抑制 TGF-β/Smad 信號傳導的作用[15]，并能抑制哮喘動物模型的 IgE 生成及氣道重塑[16-17]。我們的研究發現，哮喘患者血清 LXRs 水平較健康者增高，提示 LXRs 可能在哮喘的慢性氣道炎癥過程中反應性增高。但重癥哮喘患者和輕中度哮喘患者之間 LXRs 表達無差異，因而 LXRs 水平高低無法反映哮喘氣道重塑的嚴重程度。由于 LXRs 的功能主要由配體激活所致，而目前尚不清楚哮喘患者體內 LXRs 配體的種類，加上我們的研究未對 LXRs 是否被活化進行檢測，因此其抑制氣道重塑的機制尚仍待進一步研究。
綜上所述，哮喘患者氣道中 TGF-β/Smad 的表達水平較健康人增加，PPM1A 表達較健康人降低，可能與氣道重塑有關。哮喘患者 LXRs 表達較健康者增高，但與氣道重塑無相關性。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
