引用本文： 李考, 宋淑軍, 朱敏立, 王瑞娟, 董瑾, 閆如意, 馮凱. LRP5 基因多態性與慢性阻塞性肺疾病并發骨質疏松的關聯性研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(6): 515-521. doi: 10.7507/1671-6205.201904004 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種生活方式相關的慢性炎癥性氣道疾病，是全球主要的致死性疾病之一[1]。骨質疏松是慢阻肺患者的重要并發癥[2]，其發生機制至今未明。慢阻肺和骨質疏松的基因多態性研究，從分子遺傳學角度，探索慢阻肺并發骨質疏松的發生機制。骨質疏松患者的基因多態性研究中，低密度脂蛋白受體相關蛋白 5（low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）基因報道較多[3-5]，但目前該基因罕見于慢阻肺并發骨質疏松患者的研究中。本研究旨在探索中國北方漢族 LRP5 基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與慢阻肺并發骨質疏松的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究納入的 379 例中國北方漢族慢阻肺病例樣本，來自 2007 年 9 月至 2017 年 10 月因慢阻肺急性加重入住戰略支援部隊特色醫學中心（原解放軍第 306 醫院）呼吸內科治療的患者。依據慢性阻塞性肺疾病全球倡議，患者既往接受肺功能檢查并明確診斷為慢阻肺 3～4 級，評估為 C～D 組。入組 1 個月內均接受了胸部 CT 檢查。排除標準：慢阻肺以外的其他呼吸系統疾病；5 年內發生惡性腫瘤史；自身免疫性疾病；甲狀腺功能亢進癥、甲狀旁腺功能亢進癥、皮質醇增多癥、慢性肝腎功能不全等影響骨質代謝的疾病；應用降鈣素、鈣劑、維生素 D 等影響骨代謝的藥物；口服或靜脈使用 1 個月以上的糖皮質激素[6-7]。
研究獲得解放軍第 306 醫院倫理委員會的批準［批準號：（2016）科倫審第（06）號］。所有研究對象均在知情同意的原則下參與研究，并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 分組方法
對所有入選病例，收集其人口統計學資料及臨床資料[8]。以腰 1 椎體 CT 值 100 HU 為分組標準[6]，≥100 HU 為非骨質疏松組，<100 HU 為骨質疏松組。
1.2.2 LRP5 基因標簽單核苷酸多態性選擇
利用美國加州大學圣克魯斯分校（University of California Santa Cruz，UCSC）基因組瀏覽器[8-9]，檢索 LRP5 基因，顯示出基因結構圖，LRP5 基因的位置為 chr11: 68080108-68216743（圖 1a）。LRP5 基因 5’ 端擴展 5 萬堿基對，3’ 端擴展 2 萬堿基對（chr11: 68030108-68236743，圖 1b）。確定 LRP5 基因在基因組的位置后，在千人基因組計劃網站下載中國北方漢族 LRP5 基因 SNP 分型數據，利用 Haploview4.2 軟件分析中國北方漢族人群單體型結果和確定標簽單核苷酸多態性（tag single nucleotide polymorphism，tagSNP）用于研究。參數如下：選擇哈代–溫伯格（Hardy-Weinberg equilibrium，HW）平衡 P 值的閾值 0.05，最小次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）0.2。共獲得 87 個 LRP5 基因的 SNP。使用 UCSC 基因組瀏覽器，最后確定了 LRP5 基因的 8 個 tagSNP 用于研究：rs312016 T/C，rs312017 C/T，rs312018 A/G，rs3736228 C/T，rs901823 T/C，rs589963 G/A，rs638051 A/G，rs671494 C/A（圖 1c）。
圖1
LRP5 基因研究區間和連鎖不平衡
a. LRP5 基因位于人類第 11 號染色體的位置結構示意圖，紅線標示為 LRP5 基因所在位置。b. LRP5 基因在 UCSC 基因組注釋。全圖為本研究 LRP5 基因擴展堿基對后位置圖。藍色長線為 LRP5 基因所在位置；GWAS catalog 是全基因組關聯分析目錄；GTEx gene 表示基因表達序列；Layered H3K27Ac、DNase Clusters、Txn Factor ChIP 分別表示組氨酸乙酰化、DNase I 超敏反應、轉錄因子免疫共沉淀，這三種指標代表表觀遺傳學標記；TEx combined eQTL 表示表達數量性狀基因座；100 Vertebrate Multiz Alignment & Conservation（100 Vert. Cons）表示物種序列比對保守性標記。c. LRP5 的 tagSNP 連鎖不平衡結構圖。tagSNP 所在位置用黑色方框進行了標注
1.2.3 DNA 提取
收集研究對象清晨空腹且用乙二胺四乙酸二鉀抗凝的外周血 2 mL，應用異丙醇法提取基因組 DNA 并定量，稀釋終濃度為 20 ng/μL，將每份樣本分別加入 96 孔 PCR 板制成 DNA 模板，儲存在–20 ℃ 冰箱中。
1.2.4 基因型分析
采用 Sequenom 公司的 MassARRAY SNP 基因分型技術平臺對挑選出的 8 個 tagSNP 進行分型，引物設計采用 Assay Design 3.1 軟件，對所有 SNP 兩側序列進行評價，并優化多重引物間的干擾，選擇最優的擴增和延伸引物（表 1）[9]。分析時設陽性質控品和陰性質控品，作為陽性和陰性對照。隨機選擇兩個樣本作為陽性質控品，陰性質控品為去離子水。要求樣本檢出率在 95% 以上，陽性質控品和陰性質控品的檢測結果符合預期，陰性質控品無檢測結果。
表1
LRP5 基因 tagSNP 引物
1.3 統計學方法
臨床資料采用多元變量回歸法和隨機森林法進行特征篩選，連續變量采用均數±標準差（
±s）表示，行獨立樣本的 Student’s t 檢驗，分類變量采用 χ2 檢驗。關聯分析采用 Logistic 回歸方法，計算多種遺傳模式下各 SNP 的比數比（odds ratio，OR）和 95% 可信區間（confidence interval，CI）。多重檢驗校正采用 Bonferroni 法，α 值為 0.002 08，P<α 值為差異有統計學意義。在 R 軟件 3.3.1 版上進行分析。采用把握度與樣本量計算器（Power and Sample Size Circulations，PS）3.1 軟件計算檢驗把握度[9]。
2 結果
2.1 慢阻肺非骨質疏松組與慢阻肺骨質疏松組入組人群臨床特征分析
本研究共納入 379 例患者，對 38 個變量進行特征篩選。其中，非骨質疏松組 155 例，女 30 例，男 125 例，骨質疏松組 224 例，女 103 例，男 121 例，兩組間性別構成比比較，差異有統計學意義（χ2=27.36，P=1.7×10–7）。骨質疏松組較非骨質疏松組年齡偏大，差異有統計學意義［（77.9±7.5）歲比（72.9±9.9）歲，t=–5.35，P=1.9×10–7］。患者是否飲酒差異有統計學意義（27.7% 比 38.1%，t=4.08，P=0.04）。兩組患者外周血血小板計數、血清磷、血肌酐比較，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。采用多元變量回歸分析和隨機森林法對變量進行特征篩選，線性回歸分析時去掉了吸煙、飲酒、肺氣腫、肺大皰、肺動脈高壓、糖尿病、肺心病和吸入糖皮質激素大于 1 年變量 8 個低共線性變量，從余下的 30 個高共線性變量中，最終確定年齡、血清鉀、性別、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚體、血小板、病程、血清總膽固醇、血清氯 10 個變量作為校正因子納入關聯分析（圖 2）。
圖2
隨機森林法計算變量在骨質疏松中的重要性分析圖
2.2 LRP5 基因多態性與慢阻肺并骨質疏松的易感性的關聯分析
采用 Logistic 回歸法進行關聯分析，校正了年齡、血清鉀、性別、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚體、血小板、病程、總膽固醇、血清氯 10 個變量，計算出 8 個 tagSNP 的不同遺傳模式下的檢驗值。經多重檢驗校正后，兩組患者 LRP5 基因中的 rs901823 比較，差異有統計學意義（P<0.002 08），結果見表 2。
表2
LRP5 基因多態性與慢阻肺并發骨質疏松的易感性的關聯分析
3 討論
骨質疏松作為慢阻肺的重要合并癥，對慢阻肺患者預后起著重要作用。由于臨床上常常忽視慢阻肺患者并發骨質疏松[10]，所以一般不會將雙能 X 線納入常規檢查。由于椎體的 CT 值與雙能 X 線檢查骨密度存在相關性[11]，特別是腰 1 椎體的 CT 值與骨密度有較好的相關性[6]，本研究以腰 1 椎體 CT 值分為非骨質疏松組和骨質疏松組，對缺乏雙能 X 線檢測數據的慢阻肺并骨質疏松患者的回顧性研究提供了一種可行的替代方法。
LRP5 屬于低密度脂蛋白受體家族，在 Wnt/β-catenin 信號通路中起著重要作用。LRP5 通過參與調控成骨細胞的生長和分化[4]，調節骨代謝，影響骨密度。LRP5 基因與骨質疏松的發生密切相關[3, 5, 12]。本研究發現 rs901823 攜帶 C/C 基因型的慢阻肺患者，發生骨質疏松的風險較 T/T 和 C/T 高，提示 rs901823 位點 C 等位基因可能增加慢阻肺患者患骨質疏松的風險。在 UCSC 基因組瀏覽器可以發現，該 tagSNP 位于 LRP5 的第 19 個內含子上，該區域在人骨骼肌成肌細胞（human skeletal muscle myoblasts，HSMM）系中為組蛋白乙酰化賴氨酸 27（acetylated histone 3 lysine 27，H3K27Ac）功能活躍區域，提示可能與轉錄因子功能相關。該 tagSNP 在東亞人群中 C 等位基因的分布頻率為 27.2%。本研究中，中國北方漢族慢阻肺患者中 C 等位基因分布頻率為 25.9%（196/758），與東亞人群的 C 等位基因分布頻率相仿，骨質疏松組等位基因 C 分布頻率為 29.0%（130/448），非骨質疏松組中 C 等位基因分布頻率為 21.3%（66/310），骨質疏松組中 C 等位基因分布頻率明顯高于非骨質疏松組，并且本研究骨質疏松組 C/C 純合子的比例（9.4%）明顯高于非骨質疏松組患者（1.3%）。在 Koay 等[13]的研究中，發現 rs556442 基因多態性與椎骨骨密度相關，隱性遺傳模式中的基因型 G/G 的椎骨骨密度值大于基因型 A/A 或 A/G 的骨密度。rs901823 與 rs556442 均位于 19 內含子上，兩者的功能可能存在相關性。遺憾的是我們的研究中沒有納入 rs556442 位點。
LRP5 基因中的 rs3736228 的基因多態性在骨質疏松的研究中有較多的報道[12, 14-15]。rs3736228 位于 LRP5 基因的第 18 個外顯子。本研究中經校正其他臨床因素后發現，攜帶基因型 T/T 的慢阻肺患者中，發生骨質疏松的風險高于攜帶 C/C 和 T/C 基因型的患者（在隱性遺傳模式下，P=0.003 342），攜帶 T 等位基因增加骨質疏松的風險，與其他研究的結果是一致的[5, 16]，差異雖然未達到統計學意義，但接近本研究設定的 α 值（0.002 08）。差異未達到統計學意義的可能原因分析與樣本量不足有關。在本研究中，骨質疏松組攜帶 C/C 基因型為 62.1%，T/C 基因型為 30.4%，T/T 基因型僅為 7.6%，與 Chubachi 等[17]研究的日本慢阻肺并發骨質疏松的患者是一致的。從圖 1c 中可以看出 rs901823、rs556442 與 rs3736228 均在同一連鎖不平衡區域內，前兩者的連鎖不平衡系數為 0.97，rs3736228 與余兩者的連鎖不平衡系數為 1，三者的連鎖不平衡系數較高，提示在慢阻肺患者發生骨質疏松的機制上，其功能可能存在相關性，后續的研究可以進一步探索三者的功能。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種生活方式相關的慢性炎癥性氣道疾病，是全球主要的致死性疾病之一[1]。骨質疏松是慢阻肺患者的重要并發癥[2]，其發生機制至今未明。慢阻肺和骨質疏松的基因多態性研究，從分子遺傳學角度，探索慢阻肺并發骨質疏松的發生機制。骨質疏松患者的基因多態性研究中，低密度脂蛋白受體相關蛋白 5（low-density lipoprotein receptor-related protein 5，LRP5）基因報道較多[3-5]，但目前該基因罕見于慢阻肺并發骨質疏松患者的研究中。本研究旨在探索中國北方漢族 LRP5 基因單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）與慢阻肺并發骨質疏松的關系。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究納入的 379 例中國北方漢族慢阻肺病例樣本，來自 2007 年 9 月至 2017 年 10 月因慢阻肺急性加重入住戰略支援部隊特色醫學中心（原解放軍第 306 醫院）呼吸內科治療的患者。依據慢性阻塞性肺疾病全球倡議，患者既往接受肺功能檢查并明確診斷為慢阻肺 3～4 級，評估為 C～D 組。入組 1 個月內均接受了胸部 CT 檢查。排除標準：慢阻肺以外的其他呼吸系統疾病；5 年內發生惡性腫瘤史；自身免疫性疾病；甲狀腺功能亢進癥、甲狀旁腺功能亢進癥、皮質醇增多癥、慢性肝腎功能不全等影響骨質代謝的疾病；應用降鈣素、鈣劑、維生素 D 等影響骨代謝的藥物；口服或靜脈使用 1 個月以上的糖皮質激素[6-7]。
研究獲得解放軍第 306 醫院倫理委員會的批準［批準號：（2016）科倫審第（06）號］。所有研究對象均在知情同意的原則下參與研究，并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 分組方法
對所有入選病例，收集其人口統計學資料及臨床資料[8]。以腰 1 椎體 CT 值 100 HU 為分組標準[6]，≥100 HU 為非骨質疏松組，<100 HU 為骨質疏松組。
1.2.2 LRP5 基因標簽單核苷酸多態性選擇
利用美國加州大學圣克魯斯分校（University of California Santa Cruz，UCSC）基因組瀏覽器[8-9]，檢索 LRP5 基因，顯示出基因結構圖，LRP5 基因的位置為 chr11: 68080108-68216743（圖 1a）。LRP5 基因 5’ 端擴展 5 萬堿基對，3’ 端擴展 2 萬堿基對（chr11: 68030108-68236743，圖 1b）。確定 LRP5 基因在基因組的位置后，在千人基因組計劃網站下載中國北方漢族 LRP5 基因 SNP 分型數據，利用 Haploview4.2 軟件分析中國北方漢族人群單體型結果和確定標簽單核苷酸多態性（tag single nucleotide polymorphism，tagSNP）用于研究。參數如下：選擇哈代–溫伯格（Hardy-Weinberg equilibrium，HW）平衡 P 值的閾值 0.05，最小次要等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）0.2。共獲得 87 個 LRP5 基因的 SNP。使用 UCSC 基因組瀏覽器，最后確定了 LRP5 基因的 8 個 tagSNP 用于研究：rs312016 T/C，rs312017 C/T，rs312018 A/G，rs3736228 C/T，rs901823 T/C，rs589963 G/A，rs638051 A/G，rs671494 C/A（圖 1c）。
圖1
LRP5 基因研究區間和連鎖不平衡
a. LRP5 基因位于人類第 11 號染色體的位置結構示意圖，紅線標示為 LRP5 基因所在位置。b. LRP5 基因在 UCSC 基因組注釋。全圖為本研究 LRP5 基因擴展堿基對后位置圖。藍色長線為 LRP5 基因所在位置；GWAS catalog 是全基因組關聯分析目錄；GTEx gene 表示基因表達序列；Layered H3K27Ac、DNase Clusters、Txn Factor ChIP 分別表示組氨酸乙酰化、DNase I 超敏反應、轉錄因子免疫共沉淀，這三種指標代表表觀遺傳學標記；TEx combined eQTL 表示表達數量性狀基因座；100 Vertebrate Multiz Alignment & Conservation（100 Vert. Cons）表示物種序列比對保守性標記。c. LRP5 的 tagSNP 連鎖不平衡結構圖。tagSNP 所在位置用黑色方框進行了標注
1.2.3 DNA 提取
收集研究對象清晨空腹且用乙二胺四乙酸二鉀抗凝的外周血 2 mL，應用異丙醇法提取基因組 DNA 并定量，稀釋終濃度為 20 ng/μL，將每份樣本分別加入 96 孔 PCR 板制成 DNA 模板，儲存在–20 ℃ 冰箱中。
1.2.4 基因型分析
采用 Sequenom 公司的 MassARRAY SNP 基因分型技術平臺對挑選出的 8 個 tagSNP 進行分型，引物設計采用 Assay Design 3.1 軟件，對所有 SNP 兩側序列進行評價，并優化多重引物間的干擾，選擇最優的擴增和延伸引物（表 1）[9]。分析時設陽性質控品和陰性質控品，作為陽性和陰性對照。隨機選擇兩個樣本作為陽性質控品，陰性質控品為去離子水。要求樣本檢出率在 95% 以上，陽性質控品和陰性質控品的檢測結果符合預期，陰性質控品無檢測結果。
表1
LRP5 基因 tagSNP 引物
1.3 統計學方法
臨床資料采用多元變量回歸法和隨機森林法進行特征篩選，連續變量采用均數±標準差（±s）表示，行獨立樣本的 Student’s t 檢驗，分類變量采用 χ2 檢驗。關聯分析采用 Logistic 回歸方法，計算多種遺傳模式下各 SNP 的比數比（odds ratio，OR）和 95% 可信區間（confidence interval，CI）。多重檢驗校正采用 Bonferroni 法，α 值為 0.002 08，P<α 值為差異有統計學意義。在 R 軟件 3.3.1 版上進行分析。采用把握度與樣本量計算器（Power and Sample Size Circulations，PS）3.1 軟件計算檢驗把握度[9]。
2 結果
2.1 慢阻肺非骨質疏松組與慢阻肺骨質疏松組入組人群臨床特征分析
本研究共納入 379 例患者，對 38 個變量進行特征篩選。其中，非骨質疏松組 155 例，女 30 例，男 125 例，骨質疏松組 224 例，女 103 例，男 121 例，兩組間性別構成比比較，差異有統計學意義（χ2=27.36，P=1.7×10–7）。骨質疏松組較非骨質疏松組年齡偏大，差異有統計學意義［（77.9±7.5）歲比（72.9±9.9）歲，t=–5.35，P=1.9×10–7］。患者是否飲酒差異有統計學意義（27.7% 比 38.1%，t=4.08，P=0.04）。兩組患者外周血血小板計數、血清磷、血肌酐比較，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。采用多元變量回歸分析和隨機森林法對變量進行特征篩選，線性回歸分析時去掉了吸煙、飲酒、肺氣腫、肺大皰、肺動脈高壓、糖尿病、肺心病和吸入糖皮質激素大于 1 年變量 8 個低共線性變量，從余下的 30 個高共線性變量中，最終確定年齡、血清鉀、性別、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚體、血小板、病程、血清總膽固醇、血清氯 10 個變量作為校正因子納入關聯分析（圖 2）。
圖2
隨機森林法計算變量在骨質疏松中的重要性分析圖
2.2 LRP5 基因多態性與慢阻肺并骨質疏松的易感性的關聯分析
采用 Logistic 回歸法進行關聯分析，校正了年齡、血清鉀、性別、血清磷、血清肌酐、血清 D 二聚體、血小板、病程、總膽固醇、血清氯 10 個變量，計算出 8 個 tagSNP 的不同遺傳模式下的檢驗值。經多重檢驗校正后，兩組患者 LRP5 基因中的 rs901823 比較，差異有統計學意義（P<0.002 08），結果見表 2。
表2
LRP5 基因多態性與慢阻肺并發骨質疏松的易感性的關聯分析
3 討論
骨質疏松作為慢阻肺的重要合并癥，對慢阻肺患者預后起著重要作用。由于臨床上常常忽視慢阻肺患者并發骨質疏松[10]，所以一般不會將雙能 X 線納入常規檢查。由于椎體的 CT 值與雙能 X 線檢查骨密度存在相關性[11]，特別是腰 1 椎體的 CT 值與骨密度有較好的相關性[6]，本研究以腰 1 椎體 CT 值分為非骨質疏松組和骨質疏松組，對缺乏雙能 X 線檢測數據的慢阻肺并骨質疏松患者的回顧性研究提供了一種可行的替代方法。
LRP5 屬于低密度脂蛋白受體家族，在 Wnt/β-catenin 信號通路中起著重要作用。LRP5 通過參與調控成骨細胞的生長和分化[4]，調節骨代謝，影響骨密度。LRP5 基因與骨質疏松的發生密切相關[3, 5, 12]。本研究發現 rs901823 攜帶 C/C 基因型的慢阻肺患者，發生骨質疏松的風險較 T/T 和 C/T 高，提示 rs901823 位點 C 等位基因可能增加慢阻肺患者患骨質疏松的風險。在 UCSC 基因組瀏覽器可以發現，該 tagSNP 位于 LRP5 的第 19 個內含子上，該區域在人骨骼肌成肌細胞（human skeletal muscle myoblasts，HSMM）系中為組蛋白乙酰化賴氨酸 27（acetylated histone 3 lysine 27，H3K27Ac）功能活躍區域，提示可能與轉錄因子功能相關。該 tagSNP 在東亞人群中 C 等位基因的分布頻率為 27.2%。本研究中，中國北方漢族慢阻肺患者中 C 等位基因分布頻率為 25.9%（196/758），與東亞人群的 C 等位基因分布頻率相仿，骨質疏松組等位基因 C 分布頻率為 29.0%（130/448），非骨質疏松組中 C 等位基因分布頻率為 21.3%（66/310），骨質疏松組中 C 等位基因分布頻率明顯高于非骨質疏松組，并且本研究骨質疏松組 C/C 純合子的比例（9.4%）明顯高于非骨質疏松組患者（1.3%）。在 Koay 等[13]的研究中，發現 rs556442 基因多態性與椎骨骨密度相關，隱性遺傳模式中的基因型 G/G 的椎骨骨密度值大于基因型 A/A 或 A/G 的骨密度。rs901823 與 rs556442 均位于 19 內含子上，兩者的功能可能存在相關性。遺憾的是我們的研究中沒有納入 rs556442 位點。
LRP5 基因中的 rs3736228 的基因多態性在骨質疏松的研究中有較多的報道[12, 14-15]。rs3736228 位于 LRP5 基因的第 18 個外顯子。本研究中經校正其他臨床因素后發現，攜帶基因型 T/T 的慢阻肺患者中，發生骨質疏松的風險高于攜帶 C/C 和 T/C 基因型的患者（在隱性遺傳模式下，P=0.003 342），攜帶 T 等位基因增加骨質疏松的風險，與其他研究的結果是一致的[5, 16]，差異雖然未達到統計學意義，但接近本研究設定的 α 值（0.002 08）。差異未達到統計學意義的可能原因分析與樣本量不足有關。在本研究中，骨質疏松組攜帶 C/C 基因型為 62.1%，T/C 基因型為 30.4%，T/T 基因型僅為 7.6%，與 Chubachi 等[17]研究的日本慢阻肺并發骨質疏松的患者是一致的。從圖 1c 中可以看出 rs901823、rs556442 與 rs3736228 均在同一連鎖不平衡區域內，前兩者的連鎖不平衡系數為 0.97，rs3736228 與余兩者的連鎖不平衡系數為 1，三者的連鎖不平衡系數較高，提示在慢阻肺患者發生骨質疏松的機制上，其功能可能存在相關性，后續的研究可以進一步探索三者的功能。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
