引用本文： 黃坤, 周勇, 劉美芳, 王欣燕, 康小文, 肖金玲. 甘草酸二銨聯合骨髓間充質干細胞治療大鼠肺纖維化急性加重的實驗研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2020, 19(1): 64-69. doi: 10.7507/1671-6205.201902011 復制
特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因未明的慢性進展性纖維化肺疾病，IPF 患者從診斷開始中位生存期僅 2～3 年。部分患者在短期內可出現急性呼吸功能惡化，稱之為 IPF 急性加重（AE-IPF），是 IPF 患者死亡的重要原因[1]。目前糖皮質激素仍然是 AE-IPF 患者主要的治療藥物，缺乏尼達尼布或吡非尼酮治療 AE-IPF 臨床證據[1]。IPF 發病機制復雜，上皮驅動和成纖維細胞激活，細胞因子網絡失衡，氧化和抗氧化之失衡等均參與 IPF 的病理機制[2]。甘草酸二銨（diammonium glycyrrhizinate，DG）具有較強的非特異性的抗炎作用，可調節內源性類固醇水平，而無鹽皮質激素樣不良反應[3]，在治療肝維化上表現出一定的療效[4]。對呼吸系統疾病如慢性阻塞性肺疾病[5]、急性肺損傷[6]、支氣管哮喘[7]已有較好的療效。我們的前期實驗已證實骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，MSC）移入可降低博來霉素（bleomycin，BLM）造模大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，且造模后立即移入明顯優于 7 d 后移入[8]。而造模后 7 d 正好是肺泡炎達到高峰的時期，相當于臨床上肺纖維化的急性加重期，可引起明顯臨床癥狀，需要就診和治療，但這個時期單獨移入 MSC 治療的效果卻不理想。本實驗采用 DG 聯合 MSC 7 d 后移植治療 BLM 所致的大鼠肺纖維化急性加重，觀察其干預作用的可能機制。
1 材料與方法
1.1 材料
取 4 周齡雄性清潔級健康 Wistar 幼鼠 4 只，體重 80～100 g，用于 MSC 分離和培養。取 8 周齡雌性清潔級健康 Wistar 大鼠 24 只，體重 200～240 g，用于動物實驗。實驗動物由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心提供并飼養于無特定病原級動物房。BLM（日本化藥株式會社），低糖 L-DMEM（美國 Hyclone 公司），DG（江蘇正大天晴藥業股份有限公司，生產批號 120306104），羥脯胺酸（hydroxyproline，HYP）含量、丙二醛（（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）的檢測試劑盒（南京建成生物工程公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）檢測酶聯免疫吸附試驗試劑盒（奧維生物有限公司），兔抗肺表面活性蛋白-C（pulmonary surfactant-associated protein C，SP-C）多克隆一抗（FL-197，美國 Santa Cruz 公司），四甲基羅丹明標記山羊抗兔 IgG（美國 Santa Cruz），CO2 細胞培養箱（德國 Heraeus 公司），熒光顯微鏡（日本 Olympus 公司）。
1.2 方法
1.2.1 MSC 的提取及分離
取 4 周齡雄性清潔級 Wistar 幼鼠 1 只分離和提取 MSC[8]，通過全骨髓貼壁法和離心法使細胞進一步分離純化，傳代培養。實驗用第 5 代的細胞，用不含血清的 L-DMEM 培養液配成活細胞密度為 5×106/mL 的細胞懸液備用。
1.2.2 實驗分組和處理
取 8 周齡雌性清潔級 Wistar 大鼠 24 只，隨機分為對照組（NC 組）、模型組（BLM 組）、MSC 治療組（MSC 組）、DG+MSC 治療組（DGMSC 組），每組 6 只。BLM 組、MSC 組和 DGMSC 組制備 BLM 致肺纖維化模型[9]：10% 水合氯醛按 0.3 mL/100 g 腹腔內注射麻醉，將大鼠仰位固定于操作臺，備皮，無菌條件下縱向剪開頸部皮膚分離肌肉，暴露氣管，用 1 mL 注射器向氣管內一次性快速注入 BLM（5 mg/kg），立即拔除針頭，將動物直立旋轉 1～2 min，使藥液盡可能到達兩側肺部并均勻分布，對照組向氣管注射同等劑量的生理鹽水，縫合皮膚，常規飼養。MSC 組于造模后 7 d 通過尾靜脈注入雄性大鼠 MSC 液 0.5 mL（含細胞數 2.5×106 個）；DGMSC 組在 MSC 組的基礎上，按 150 mg·kg–1·d–1 劑量給已制成的肺纖維化大鼠模型，在每天同一時間段內連續 21 d 腹腔內注射 DG。BLM 組和 MSC 組按 30 mL·kg–1·d–1 劑量，每天同一時間段內連續 21 d 腹腔內注射生理鹽水。對照組氣管內注入等量生理鹽水，于 28 d 時處死大鼠。
1.2.3 標本處理
大鼠在 28 d 時，以 10% 水合氯醛按 0.3 mL/100 g 腹腔內注射麻醉動物后，心臟放血，處死動物，立即開胸取出肺組織。取部分右下葉固定于 10% 多聚甲醛溶液中，脫水、制備石蠟切片，行蘇木精–伊紅染色、Masson 染色。取左下肺組織置入液氮中，過夜后轉入–80 ℃ 低溫冰箱中保存，用于制備肺組織勻漿進行 HYP、TNF-α、TGF-β1 測定、MDA 含量、SOD 活性及 T-AOC 的檢測。取部分右下葉及左上肺組織用聚乙烯醇包埋后置于液氮中速凍，常規制備冰凍切片，用于免疫熒光標記觀察。
1.2.4 肺組織病理學檢測
將肺組織石蠟切片進行蘇木精–伊紅染色，光學顯微鏡下觀察病理變化；Masson 染色評定肺纖維化。參照 Szapiel 等[10]的方法評價肺泡炎及肺纖維化的程度：① 無肺泡炎或無肺纖維化（0 級）；② 輕度肺泡炎或肺纖維化，受累面積少于全肺 20%（1 級）；③ 中度肺泡炎或肺纖維化占 20%～50%（2 級）；④ 重度肺泡炎或肺纖維化受累面積>50%（3 級）。由 2 名評價者背對背分別進行評價。每張切片選取 10 個視野，每只大鼠觀察 3 張切片，取中位數。計算 2 名評價者數據的均數作為每只鼠各指標的數據進行分析[9]。
1.2.5 肺組織免疫熒光染色
處死大鼠后，取冰凍組織塊于恒冷切片機連續切片，厚度約 6 μm。冰凍切片進行染色，SP-C 多克隆一抗（1∶200）孵育組織切片，4 ℃ 濕盒中過夜，PBS 漂洗。以非特異血清代替一抗作為陰性對照。加二抗即四甲基羅丹明標記山羊抗兔 IgG（1∶100）孵育組織切片，37 ℃ 避光 1 h，PBS 漂洗、封片，熒光顯微鏡觀察染色結果并照相。由于成熟的 Ⅱ 型肺泡上皮細胞特征性的功能是合成和分泌肺表面活性蛋白（SP-A、SP-B、SP-C 及 SP-D），特別是 SP-C，它是僅在 Ⅱ 型肺泡上皮細胞表達的活性蛋白，因此可以用于鑒定 Ⅱ 型肺泡上皮細胞[11]。SP-C 陽性細胞胞漿呈紅色熒光，每例標本觀察時鏡下隨機選擇 4～6 個視野，計數 100～200 個肺泡上皮細胞，得出陽性細胞百分率。
1.2.6 生化指標檢測
各組實驗大鼠分別于造模后 28 d 處死，取肺組織勻漿，堿水解法測定 HYP 含量，硫代巴比妥酸法測定 MDA 含量，比色法測定 SOD 的活性和 T-AOC。各指標測定均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。TNF-α、TGF-β1 測定按酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書進行。
1.3 統計學分析
采用 SPSS 17.0 統計軟件。呈正態分布的數據用均數±標準差（
±s）表示，組間兩兩比較用單因素方差分析、LSD-t 檢驗。計數資料使用非參數檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺泡炎和肺纖維化程度
NC 組大鼠肺組織未見明顯病理改變。BLM 組可見雙肺蒼白，體積縮小，表面散在小米粒大含氣囊泡并有出血斑；鏡下可見肺泡間隔炎細胞及紅細胞增多，肺泡間隔增寬，部分肺組織重建，肺泡結構消失，纖維化表現比較明顯，提示肺纖維化模型制作成功。MSC 組大鼠肺組織病理變化較 BLM 組減輕，其肺泡炎評分和肺纖維化評分降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。DGMSC 組肺組織病理改變減輕，肺泡炎及肺纖維化評分較 BLM 組明顯減輕（P<0.05），較 MSC 組也明顯減輕（P<0.05）。結果見圖 1、圖 2 和表 1。
圖1
大鼠肺組織病理像顯示肺泡炎程度（蘇木精–伊紅×400）
a. NC 組肺泡結構良好，無明顯病理改變；b. BLM 組肺泡間隔明顯增寬，有炎細胞和紅細胞浸潤；c. MSC 組肺泡間隔增寬，炎細胞和紅細胞浸潤較 BLM 組有所減輕；d. DGMSC 組肺泡結構尚存，肺泡間隔輕度增寬，有少量炎細胞浸潤
表1
大鼠肺組織病理評分以及肺組織 HYP、TNF-α 及 TGF-β1 含量（n=6，
）
圖2
大鼠肺組織病理像顯示肺纖維化程度（Masson×400）
a. NC 組肺泡間隔內可見極少量藍色膠原沉積；b. BLM 組可見大量藍色膠原蛋白沉積在增寬的肺泡間隔；c. MSC 組肺泡間隔增寬，膠原纖維沉積較 BLM 組減輕；d. DGMSC 組肺泡間隔輕度增寬，藍色膠原纖維沉積不明顯
2.2 肺組織病理評分以及肺組織 HYP、TNF-α 和 TGF-β1 含量
28 d 時，DGMSC 組肺泡炎及肺纖維化程度較 BLM 組明顯減輕（P<0.05）。MSC 組與 BLM 組比較，肺泡炎及肺纖維評分有所減輕，但差異無統計學意義（P>0.05），DGMSC 組與 MSC 組比較，肺泡炎及肺纖維評分明顯減輕（P<0.05）。
DGMSC 組肺組織 HYP 含量與 BLM 組相比明顯降低（P<0.05）。MSC 組 HYP 含量較 BLM 組降低（P<0.05），提示 MSC 在 7 d 后移入對減輕肺纖維化有一定作用。DGMSC 組與 MSC 組比較，HYP 含量明顯低于 MSC 組（P<0.05），說明 DG 能促進 MSC 抗纖維化的作用。DGMSC 組大鼠肺組織勻漿中的 TNF-α 和 TGF-β1 含量比 BLM 組明顯降低（P<0.05）；MSC 組與 BLM 組比較，肺組織勻漿中的 TNF-α 和 TGF-β1 含量降低（P<0.05）；DGMSC 組肺組織勻漿中的 TNF-α 和含量低于 MSC 組，但差異無統計學意義（P>0.05），而 TGF-β1 下降程度有顯著差異（P<0.05），提示 DG 對肺纖維化形成期 TGF-β1 的抑制作用明顯大于 TNF-α。結果見表 1。
2.3 肺組織中 Ⅱ 型肺泡上皮細胞的數量和分布
在大鼠肺組織冰凍切片熒光染色可見，SP-C 標記的 Ⅱ 型肺泡上皮細胞胞漿呈紅色熒光，結果見圖 3。其中，NC 組肺泡壁結構完整，SP-C 陽性細胞散在分布于肺泡壁；BLM 組肺泡間隔明顯增厚，肺泡結構破壞，SP-C 陽性細胞數量明顯減少；MSC 組 SP-C 陽性細胞數量較 BLM 組增多，但胞漿較少；DGMSC 組肺泡間隔略增厚，SP-C 陽性細胞明顯增多且胞漿豐富深染。
圖3
肺組織冰凍切片病理像（SP-C ×400）
a. NC 組 SP-C 陽性細胞散在分布于肺泡壁；b. BLM 組肺泡間隔明顯增厚，SP-C 陽性細胞數量明顯減少；c. MSC 組 SP-C 陽性細胞數量較 BLM 組增多，但胞漿較少；d. DGMSC 組肺泡間隔略增厚，SP-C 陽性細胞明顯增多且胞漿豐富深染
2.4 肺組織 MDA 含量、SOD 活性及 T-AOC 能力
28 d 時，DGMSC 組大鼠肺組織勻漿中的 MDA 含量比 BLM 組明顯降低（P<0.05）。MSC 組肺組織勻漿中的 MDA 含量與 BLM 組相近（P>0.05）；DGMSC 組肺組織勻漿中的 MDA 含量顯著低于 MSC 組（P<0.05）。在 28 d 時，DGMSC 組大鼠肺組織勻漿中的 SOD 活性、T-AOC 能力比 BLM 組顯著升高（P<0.05）。MSC 組與 BLM 組比較，肺組織勻漿中的 SOD 活性和 T-AOC 能力有所升高，但差異無統計學意義（P>0.05）；DGMSC 組與 MSC 組比較，肺組織勻漿中的 SOD 活性和 T-AOC 能力均顯著升高（P<0.05）。結果見表 2。
表2
大鼠肺組織勻漿 MDA 含量、SOD 活性及 T-AOC 能力（n=6，
）
3 討論
IPF 是一種慢性、進展性、致死性的肺疾病，以逐漸加重的肺泡結構紊亂和肺組織纖維化為特征，最終導致呼吸功能喪失，預后極差。IPF 患者可在無明確誘因時，短期內出現病情急劇惡化、呼吸困難加重和肺功能下降，導致呼吸衰竭甚至死亡，稱為 AE-IPF[12]。AE-IPF 可在 IPF 慢性過程中隨時出現，病死率高，預后極差，很難預防。目前研究發現尼達尼布可能降低急性加重發生風險[13-15]，但對 AE-IPF 是否有治療作用尚不清楚。肺移植可能是唯一可以治愈 AE-IPF、并延長患者生存期的有效治療方法[16]，但肺源、費用均制約其應用。因此，尋找 AE-IPF 恰當有效的治療是降低病死率的關鍵。
AE-IPF 發生的病因和機制至今尚不明確，也沒有成熟的動物模型。經氣管內灌注 BLM 可以造成大鼠肺纖維化，此病理過程與人類 IPF 的病理過程極其相似，因此對 BLM 致大鼠肺纖維化發生不同階段的肺組織病理改變及不同細胞因子的表達進行研究，可以探討肺纖維化在 IPF 不同階段的發生機制，從而為臨床制定有效的治療策略提供理論和實驗依據[17]。BLM 誘發大鼠肺纖維化早期以肺泡炎為主，7 d 是肺泡炎最嚴重的時期，此后逐漸出現肺纖維化，28 d 時肺纖維化為主要病變[17-18]。本實驗選取造模后第 7 d 進行干預，此時肺組織在病理變化上最接近肺纖維化急性加重。
雖然 IPF 的發病機制至今尚未完全明確，但國內外眾多學者普遍認為 IPF 的發生發展涉及到多種細胞、細胞因子及細胞外基質之間相互作用的復雜網絡。臨床觀察和實驗證實，在 IPF 的發生和發展過程中，除了涉及細胞（凋亡、轉型）、細胞因子如 TNF-α、TGF-β1 及 γ 干擾素等機制外，還存在明顯的氧化應激狀態[19]。其中關于抗氧化治療的研究也引起了廣泛的重視。本實驗模型組 28 d 時，Masson 染色可見大量藍色膠原蛋白沉積在增寬的肺泡間隔，表明肺纖維化模型造模成功。肺組織勻漿中的 HYP、TNF-α 及 TGF-β1 含量均明顯增加，提示細胞因子確實參與了肺纖維化的形成。另外，MDA 含量增加、SOD 活性及 T-AOC 能力下降，進一步證實 BLM 導致大鼠肺內氧化損傷及炎癥反應是大鼠肺纖維化產生的關鍵環節。
MSC 是一類來源于中胚層的多能成體干細胞，具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能。前期實驗已證實 MSC 可移入到 BLM 造模大鼠的肺組織內，并轉化為 Ⅱ 型肺泡上皮細胞，減輕肺泡炎及肺纖維化的程度[20]。本實驗證實 MSC 7 d 后移入可以減輕模型組大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，但效果不顯著；肺組織勻漿中 HYP、TNF-α 及 TGF-β1 含量較模型組明顯下降（P<0.05），而 MDA 含量下降、SOD 活性及 T-AOC 能力改善不明顯。這提示在肺纖維化的形成期，MSC 7 d 后移入改善肺纖維化的作用主要與減少細胞因子 TNF-α 及 TGF-β1 的生成和釋放有關。
DG 因其結構與腎上腺皮質激素相似，具有與糖皮質激素和鹽皮質激素類似的功能作用。DG 可抑制 11B-羥類固醇脫氫酶，通過影響糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體，影響機體類固醇效應[21]。DG 還具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗病毒、調節免疫、護肝及抗腫瘤等功效[22]，目前被用于治療皮炎、慢性肝炎[23]、咳嗽和哮喘。DG 亦可減輕肺部炎癥反應[24]。前期實驗證實，MSC 移入可明顯減輕 BLM 造模大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，但造模 7 d 后移入組明顯低于造模后立即移入組。因此，移入時機對 MSC 治療肺纖維化的影響很大，但造模后立即移入并不符合臨床診治的特點。臨床上大部分患者不是發病后立即就診，而是常在病情迅速進展、有明顯癥狀時，即急性加重期才就診，相當于肺泡炎最嚴重的時期。前期實驗證實 BLM 造模后 7 d 是肺泡炎最嚴重的時期，也就是進行干預治療最常用的時間窗。由于單獨移入 MSC 抗炎及抗纖維化的效果不佳，所以急需一種能協同 MSC 移入并增強其抗炎和抗纖維化效果的藥物或方法。鑒于 DG 的上述優點，設計本實驗，并通過細胞因子網絡及氧化應激方面來考察 DG 協同 MSC 發揮治療作用的機制，發現 DG 聯合 MSC 7 d 后移入可以減輕肺纖維化大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，與單獨 MSC 移入組比較有顯著差異（P<0.05）；肺組織勻漿中的 HYP 及 TGF-β1 含量較 MSC 組明顯下降（P<0.05），但對 TNF-α 含量影響不大，可能由于 TNF-α 是肺纖維化中一個非常重要的早期炎癥因子，在肺纖維化形成期其作用已經很微弱了；在氧化應激方面，DG 聯合 MSC 7 d 后移入可明顯增加造模大鼠的抗氧化能力，MDA 含量下降，SOD 活性及 T-AOC 能力改善明顯，與 MSC 組比較有顯著差異（P<0.05）。這說明在肺纖維化進展期，DG 聯合 MSC 移入減輕肺泡炎及肺纖維化的作用與減少細胞因子的生成和釋放及減輕氧化應激有關。Ⅱ型肺泡上皮細胞是肺泡上皮的干細胞，是一種局部干細胞，對維持肺泡的正常結構和功能具有重要作用。前期實驗證實 MSC 可移入到 BLM 造模大鼠肺組織內轉化為Ⅱ型肺泡上皮細胞，但造模 7 d 后移入轉化的細胞數量較少。本實驗加入 DG 干預后，Ⅱ型肺泡上皮細胞數量較單獨 MSC 組明顯增多，且細胞形態完整，提示 DG 促進了 MSC 的移入，促進 MSC 在肺組織定植、轉化及成熟。
本研究的缺陷在于未單設 DG 治療組，只考慮 DG 可能發生的協同作用，而未考慮其獨立治療作用。下一步會進行補充實驗，進一步研究其發揮協同和治療作用的可能機制。肺纖維化發病機制復雜，單一阻斷某一環節治療效果不明顯。本研究顯示 DG 可協同 MSC 治療進展期肺纖維化，可通過抑制炎性因子、抗氧化、促進 MSC 在肺組織的轉化等多種途徑減輕大鼠肺纖維化，是一個非常有前景的協同治療藥物，有望應用于臨床治療肺纖維化。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
特發性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種病因未明的慢性進展性纖維化肺疾病，IPF 患者從診斷開始中位生存期僅 2～3 年。部分患者在短期內可出現急性呼吸功能惡化，稱之為 IPF 急性加重（AE-IPF），是 IPF 患者死亡的重要原因[1]。目前糖皮質激素仍然是 AE-IPF 患者主要的治療藥物，缺乏尼達尼布或吡非尼酮治療 AE-IPF 臨床證據[1]。IPF 發病機制復雜，上皮驅動和成纖維細胞激活，細胞因子網絡失衡，氧化和抗氧化之失衡等均參與 IPF 的病理機制[2]。甘草酸二銨（diammonium glycyrrhizinate，DG）具有較強的非特異性的抗炎作用，可調節內源性類固醇水平，而無鹽皮質激素樣不良反應[3]，在治療肝維化上表現出一定的療效[4]。對呼吸系統疾病如慢性阻塞性肺疾病[5]、急性肺損傷[6]、支氣管哮喘[7]已有較好的療效。我們的前期實驗已證實骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，MSC）移入可降低博來霉素（bleomycin，BLM）造模大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，且造模后立即移入明顯優于 7 d 后移入[8]。而造模后 7 d 正好是肺泡炎達到高峰的時期，相當于臨床上肺纖維化的急性加重期，可引起明顯臨床癥狀，需要就診和治療，但這個時期單獨移入 MSC 治療的效果卻不理想。本實驗采用 DG 聯合 MSC 7 d 后移植治療 BLM 所致的大鼠肺纖維化急性加重，觀察其干預作用的可能機制。
1 材料與方法
1.1 材料
取 4 周齡雄性清潔級健康 Wistar 幼鼠 4 只，體重 80～100 g，用于 MSC 分離和培養。取 8 周齡雌性清潔級健康 Wistar 大鼠 24 只，體重 200～240 g，用于動物實驗。實驗動物由哈爾濱醫科大學附屬第二醫院動物實驗中心提供并飼養于無特定病原級動物房。BLM（日本化藥株式會社），低糖 L-DMEM（美國 Hyclone 公司），DG（江蘇正大天晴藥業股份有限公司，生產批號 120306104），羥脯胺酸（hydroxyproline，HYP）含量、丙二醛（（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）的檢測試劑盒（南京建成生物工程公司），腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）檢測酶聯免疫吸附試驗試劑盒（奧維生物有限公司），兔抗肺表面活性蛋白-C（pulmonary surfactant-associated protein C，SP-C）多克隆一抗（FL-197，美國 Santa Cruz 公司），四甲基羅丹明標記山羊抗兔 IgG（美國 Santa Cruz），CO2 細胞培養箱（德國 Heraeus 公司），熒光顯微鏡（日本 Olympus 公司）。
1.2 方法
1.2.1 MSC 的提取及分離
取 4 周齡雄性清潔級 Wistar 幼鼠 1 只分離和提取 MSC[8]，通過全骨髓貼壁法和離心法使細胞進一步分離純化，傳代培養。實驗用第 5 代的細胞，用不含血清的 L-DMEM 培養液配成活細胞密度為 5×106/mL 的細胞懸液備用。
1.2.2 實驗分組和處理
取 8 周齡雌性清潔級 Wistar 大鼠 24 只，隨機分為對照組（NC 組）、模型組（BLM 組）、MSC 治療組（MSC 組）、DG+MSC 治療組（DGMSC 組），每組 6 只。BLM 組、MSC 組和 DGMSC 組制備 BLM 致肺纖維化模型[9]：10% 水合氯醛按 0.3 mL/100 g 腹腔內注射麻醉，將大鼠仰位固定于操作臺，備皮，無菌條件下縱向剪開頸部皮膚分離肌肉，暴露氣管，用 1 mL 注射器向氣管內一次性快速注入 BLM（5 mg/kg），立即拔除針頭，將動物直立旋轉 1～2 min，使藥液盡可能到達兩側肺部并均勻分布，對照組向氣管注射同等劑量的生理鹽水，縫合皮膚，常規飼養。MSC 組于造模后 7 d 通過尾靜脈注入雄性大鼠 MSC 液 0.5 mL（含細胞數 2.5×106 個）；DGMSC 組在 MSC 組的基礎上，按 150 mg·kg–1·d–1 劑量給已制成的肺纖維化大鼠模型，在每天同一時間段內連續 21 d 腹腔內注射 DG。BLM 組和 MSC 組按 30 mL·kg–1·d–1 劑量，每天同一時間段內連續 21 d 腹腔內注射生理鹽水。對照組氣管內注入等量生理鹽水，于 28 d 時處死大鼠。
1.2.3 標本處理
大鼠在 28 d 時，以 10% 水合氯醛按 0.3 mL/100 g 腹腔內注射麻醉動物后，心臟放血，處死動物，立即開胸取出肺組織。取部分右下葉固定于 10% 多聚甲醛溶液中，脫水、制備石蠟切片，行蘇木精–伊紅染色、Masson 染色。取左下肺組織置入液氮中，過夜后轉入–80 ℃ 低溫冰箱中保存，用于制備肺組織勻漿進行 HYP、TNF-α、TGF-β1 測定、MDA 含量、SOD 活性及 T-AOC 的檢測。取部分右下葉及左上肺組織用聚乙烯醇包埋后置于液氮中速凍，常規制備冰凍切片，用于免疫熒光標記觀察。
1.2.4 肺組織病理學檢測
將肺組織石蠟切片進行蘇木精–伊紅染色，光學顯微鏡下觀察病理變化；Masson 染色評定肺纖維化。參照 Szapiel 等[10]的方法評價肺泡炎及肺纖維化的程度：① 無肺泡炎或無肺纖維化（0 級）；② 輕度肺泡炎或肺纖維化，受累面積少于全肺 20%（1 級）；③ 中度肺泡炎或肺纖維化占 20%～50%（2 級）；④ 重度肺泡炎或肺纖維化受累面積>50%（3 級）。由 2 名評價者背對背分別進行評價。每張切片選取 10 個視野，每只大鼠觀察 3 張切片，取中位數。計算 2 名評價者數據的均數作為每只鼠各指標的數據進行分析[9]。
1.2.5 肺組織免疫熒光染色
處死大鼠后，取冰凍組織塊于恒冷切片機連續切片，厚度約 6 μm。冰凍切片進行染色，SP-C 多克隆一抗（1∶200）孵育組織切片，4 ℃ 濕盒中過夜，PBS 漂洗。以非特異血清代替一抗作為陰性對照。加二抗即四甲基羅丹明標記山羊抗兔 IgG（1∶100）孵育組織切片，37 ℃ 避光 1 h，PBS 漂洗、封片，熒光顯微鏡觀察染色結果并照相。由于成熟的 Ⅱ 型肺泡上皮細胞特征性的功能是合成和分泌肺表面活性蛋白（SP-A、SP-B、SP-C 及 SP-D），特別是 SP-C，它是僅在 Ⅱ 型肺泡上皮細胞表達的活性蛋白，因此可以用于鑒定 Ⅱ 型肺泡上皮細胞[11]。SP-C 陽性細胞胞漿呈紅色熒光，每例標本觀察時鏡下隨機選擇 4～6 個視野，計數 100～200 個肺泡上皮細胞，得出陽性細胞百分率。
1.2.6 生化指標檢測
各組實驗大鼠分別于造模后 28 d 處死，取肺組織勻漿，堿水解法測定 HYP 含量，硫代巴比妥酸法測定 MDA 含量，比色法測定 SOD 的活性和 T-AOC。各指標測定均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。TNF-α、TGF-β1 測定按酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書進行。
1.3 統計學分析
采用 SPSS 17.0 統計軟件。呈正態分布的數據用均數±標準差（±s）表示，組間兩兩比較用單因素方差分析、LSD-t 檢驗。計數資料使用非參數檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺泡炎和肺纖維化程度
NC 組大鼠肺組織未見明顯病理改變。BLM 組可見雙肺蒼白，體積縮小，表面散在小米粒大含氣囊泡并有出血斑；鏡下可見肺泡間隔炎細胞及紅細胞增多，肺泡間隔增寬，部分肺組織重建，肺泡結構消失，纖維化表現比較明顯，提示肺纖維化模型制作成功。MSC 組大鼠肺組織病理變化較 BLM 組減輕，其肺泡炎評分和肺纖維化評分降低，但差異無統計學意義（P>0.05）。DGMSC 組肺組織病理改變減輕，肺泡炎及肺纖維化評分較 BLM 組明顯減輕（P<0.05），較 MSC 組也明顯減輕（P<0.05）。結果見圖 1、圖 2 和表 1。
圖1
大鼠肺組織病理像顯示肺泡炎程度（蘇木精–伊紅×400）
a. NC 組肺泡結構良好，無明顯病理改變；b. BLM 組肺泡間隔明顯增寬，有炎細胞和紅細胞浸潤；c. MSC 組肺泡間隔增寬，炎細胞和紅細胞浸潤較 BLM 組有所減輕；d. DGMSC 組肺泡結構尚存，肺泡間隔輕度增寬，有少量炎細胞浸潤
表1
大鼠肺組織病理評分以及肺組織 HYP、TNF-α 及 TGF-β1 含量（n=6，）
圖2
大鼠肺組織病理像顯示肺纖維化程度（Masson×400）
a. NC 組肺泡間隔內可見極少量藍色膠原沉積；b. BLM 組可見大量藍色膠原蛋白沉積在增寬的肺泡間隔；c. MSC 組肺泡間隔增寬，膠原纖維沉積較 BLM 組減輕；d. DGMSC 組肺泡間隔輕度增寬，藍色膠原纖維沉積不明顯
2.2 肺組織病理評分以及肺組織 HYP、TNF-α 和 TGF-β1 含量
28 d 時，DGMSC 組肺泡炎及肺纖維化程度較 BLM 組明顯減輕（P<0.05）。MSC 組與 BLM 組比較，肺泡炎及肺纖維評分有所減輕，但差異無統計學意義（P>0.05），DGMSC 組與 MSC 組比較，肺泡炎及肺纖維評分明顯減輕（P<0.05）。
DGMSC 組肺組織 HYP 含量與 BLM 組相比明顯降低（P<0.05）。MSC 組 HYP 含量較 BLM 組降低（P<0.05），提示 MSC 在 7 d 后移入對減輕肺纖維化有一定作用。DGMSC 組與 MSC 組比較，HYP 含量明顯低于 MSC 組（P<0.05），說明 DG 能促進 MSC 抗纖維化的作用。DGMSC 組大鼠肺組織勻漿中的 TNF-α 和 TGF-β1 含量比 BLM 組明顯降低（P<0.05）；MSC 組與 BLM 組比較，肺組織勻漿中的 TNF-α 和 TGF-β1 含量降低（P<0.05）；DGMSC 組肺組織勻漿中的 TNF-α 和含量低于 MSC 組，但差異無統計學意義（P>0.05），而 TGF-β1 下降程度有顯著差異（P<0.05），提示 DG 對肺纖維化形成期 TGF-β1 的抑制作用明顯大于 TNF-α。結果見表 1。
2.3 肺組織中 Ⅱ 型肺泡上皮細胞的數量和分布
在大鼠肺組織冰凍切片熒光染色可見，SP-C 標記的 Ⅱ 型肺泡上皮細胞胞漿呈紅色熒光，結果見圖 3。其中，NC 組肺泡壁結構完整，SP-C 陽性細胞散在分布于肺泡壁；BLM 組肺泡間隔明顯增厚，肺泡結構破壞，SP-C 陽性細胞數量明顯減少；MSC 組 SP-C 陽性細胞數量較 BLM 組增多，但胞漿較少；DGMSC 組肺泡間隔略增厚，SP-C 陽性細胞明顯增多且胞漿豐富深染。
圖3
肺組織冰凍切片病理像（SP-C ×400）
a. NC 組 SP-C 陽性細胞散在分布于肺泡壁；b. BLM 組肺泡間隔明顯增厚，SP-C 陽性細胞數量明顯減少；c. MSC 組 SP-C 陽性細胞數量較 BLM 組增多，但胞漿較少；d. DGMSC 組肺泡間隔略增厚，SP-C 陽性細胞明顯增多且胞漿豐富深染
2.4 肺組織 MDA 含量、SOD 活性及 T-AOC 能力
28 d 時，DGMSC 組大鼠肺組織勻漿中的 MDA 含量比 BLM 組明顯降低（P<0.05）。MSC 組肺組織勻漿中的 MDA 含量與 BLM 組相近（P>0.05）；DGMSC 組肺組織勻漿中的 MDA 含量顯著低于 MSC 組（P<0.05）。在 28 d 時，DGMSC 組大鼠肺組織勻漿中的 SOD 活性、T-AOC 能力比 BLM 組顯著升高（P<0.05）。MSC 組與 BLM 組比較，肺組織勻漿中的 SOD 活性和 T-AOC 能力有所升高，但差異無統計學意義（P>0.05）；DGMSC 組與 MSC 組比較，肺組織勻漿中的 SOD 活性和 T-AOC 能力均顯著升高（P<0.05）。結果見表 2。
表2
大鼠肺組織勻漿 MDA 含量、SOD 活性及 T-AOC 能力（n=6，）
3 討論
IPF 是一種慢性、進展性、致死性的肺疾病，以逐漸加重的肺泡結構紊亂和肺組織纖維化為特征，最終導致呼吸功能喪失，預后極差。IPF 患者可在無明確誘因時，短期內出現病情急劇惡化、呼吸困難加重和肺功能下降，導致呼吸衰竭甚至死亡，稱為 AE-IPF[12]。AE-IPF 可在 IPF 慢性過程中隨時出現，病死率高，預后極差，很難預防。目前研究發現尼達尼布可能降低急性加重發生風險[13-15]，但對 AE-IPF 是否有治療作用尚不清楚。肺移植可能是唯一可以治愈 AE-IPF、并延長患者生存期的有效治療方法[16]，但肺源、費用均制約其應用。因此，尋找 AE-IPF 恰當有效的治療是降低病死率的關鍵。
AE-IPF 發生的病因和機制至今尚不明確，也沒有成熟的動物模型。經氣管內灌注 BLM 可以造成大鼠肺纖維化，此病理過程與人類 IPF 的病理過程極其相似，因此對 BLM 致大鼠肺纖維化發生不同階段的肺組織病理改變及不同細胞因子的表達進行研究，可以探討肺纖維化在 IPF 不同階段的發生機制，從而為臨床制定有效的治療策略提供理論和實驗依據[17]。BLM 誘發大鼠肺纖維化早期以肺泡炎為主，7 d 是肺泡炎最嚴重的時期，此后逐漸出現肺纖維化，28 d 時肺纖維化為主要病變[17-18]。本實驗選取造模后第 7 d 進行干預，此時肺組織在病理變化上最接近肺纖維化急性加重。
雖然 IPF 的發病機制至今尚未完全明確，但國內外眾多學者普遍認為 IPF 的發生發展涉及到多種細胞、細胞因子及細胞外基質之間相互作用的復雜網絡。臨床觀察和實驗證實，在 IPF 的發生和發展過程中，除了涉及細胞（凋亡、轉型）、細胞因子如 TNF-α、TGF-β1 及 γ 干擾素等機制外，還存在明顯的氧化應激狀態[19]。其中關于抗氧化治療的研究也引起了廣泛的重視。本實驗模型組 28 d 時，Masson 染色可見大量藍色膠原蛋白沉積在增寬的肺泡間隔，表明肺纖維化模型造模成功。肺組織勻漿中的 HYP、TNF-α 及 TGF-β1 含量均明顯增加，提示細胞因子確實參與了肺纖維化的形成。另外，MDA 含量增加、SOD 活性及 T-AOC 能力下降，進一步證實 BLM 導致大鼠肺內氧化損傷及炎癥反應是大鼠肺纖維化產生的關鍵環節。
MSC 是一類來源于中胚層的多能成體干細胞，具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能。前期實驗已證實 MSC 可移入到 BLM 造模大鼠的肺組織內，并轉化為 Ⅱ 型肺泡上皮細胞，減輕肺泡炎及肺纖維化的程度[20]。本實驗證實 MSC 7 d 后移入可以減輕模型組大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，但效果不顯著；肺組織勻漿中 HYP、TNF-α 及 TGF-β1 含量較模型組明顯下降（P<0.05），而 MDA 含量下降、SOD 活性及 T-AOC 能力改善不明顯。這提示在肺纖維化的形成期，MSC 7 d 后移入改善肺纖維化的作用主要與減少細胞因子 TNF-α 及 TGF-β1 的生成和釋放有關。
DG 因其結構與腎上腺皮質激素相似，具有與糖皮質激素和鹽皮質激素類似的功能作用。DG 可抑制 11B-羥類固醇脫氫酶，通過影響糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體，影響機體類固醇效應[21]。DG 還具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗病毒、調節免疫、護肝及抗腫瘤等功效[22]，目前被用于治療皮炎、慢性肝炎[23]、咳嗽和哮喘。DG 亦可減輕肺部炎癥反應[24]。前期實驗證實，MSC 移入可明顯減輕 BLM 造模大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，但造模 7 d 后移入組明顯低于造模后立即移入組。因此，移入時機對 MSC 治療肺纖維化的影響很大，但造模后立即移入并不符合臨床診治的特點。臨床上大部分患者不是發病后立即就診，而是常在病情迅速進展、有明顯癥狀時，即急性加重期才就診，相當于肺泡炎最嚴重的時期。前期實驗證實 BLM 造模后 7 d 是肺泡炎最嚴重的時期，也就是進行干預治療最常用的時間窗。由于單獨移入 MSC 抗炎及抗纖維化的效果不佳，所以急需一種能協同 MSC 移入并增強其抗炎和抗纖維化效果的藥物或方法。鑒于 DG 的上述優點，設計本實驗，并通過細胞因子網絡及氧化應激方面來考察 DG 協同 MSC 發揮治療作用的機制，發現 DG 聯合 MSC 7 d 后移入可以減輕肺纖維化大鼠肺泡炎及肺纖維化的程度，與單獨 MSC 移入組比較有顯著差異（P<0.05）；肺組織勻漿中的 HYP 及 TGF-β1 含量較 MSC 組明顯下降（P<0.05），但對 TNF-α 含量影響不大，可能由于 TNF-α 是肺纖維化中一個非常重要的早期炎癥因子，在肺纖維化形成期其作用已經很微弱了；在氧化應激方面，DG 聯合 MSC 7 d 后移入可明顯增加造模大鼠的抗氧化能力，MDA 含量下降，SOD 活性及 T-AOC 能力改善明顯，與 MSC 組比較有顯著差異（P<0.05）。這說明在肺纖維化進展期，DG 聯合 MSC 移入減輕肺泡炎及肺纖維化的作用與減少細胞因子的生成和釋放及減輕氧化應激有關。Ⅱ型肺泡上皮細胞是肺泡上皮的干細胞，是一種局部干細胞，對維持肺泡的正常結構和功能具有重要作用。前期實驗證實 MSC 可移入到 BLM 造模大鼠肺組織內轉化為Ⅱ型肺泡上皮細胞，但造模 7 d 后移入轉化的細胞數量較少。本實驗加入 DG 干預后，Ⅱ型肺泡上皮細胞數量較單獨 MSC 組明顯增多，且細胞形態完整，提示 DG 促進了 MSC 的移入，促進 MSC 在肺組織定植、轉化及成熟。
本研究的缺陷在于未單設 DG 治療組，只考慮 DG 可能發生的協同作用，而未考慮其獨立治療作用。下一步會進行補充實驗，進一步研究其發揮協同和治療作用的可能機制。肺纖維化發病機制復雜，單一阻斷某一環節治療效果不明顯。本研究顯示 DG 可協同 MSC 治療進展期肺纖維化，可通過抑制炎性因子、抗氧化、促進 MSC 在肺組織的轉化等多種途徑減輕大鼠肺纖維化，是一個非常有前景的協同治療藥物，有望應用于臨床治療肺纖維化。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
