引用本文： 曾慶萃, 張敏慧, 成爭艷, 龍懷聰. 三葉因子對小鼠急性過敏性氣道炎癥及黏液分泌的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(5): 441-446. doi: 10.7507/1671-6205.201812027 復制
三葉因子家族（trefoil factors，TFFs）是一類含有三葉結構域的蛋白質多肽家族，迄今在哺乳動物中發現的有 TFF1、TFF2 及 TFF3。TFFs 可存在于人體的多種組織中，發揮防御、修復等作用[1-4]，其中胃腸道及呼吸系統是其表達的重要器官。哮喘的相關研究表明，氣道上皮細胞的損傷修復缺陷，是引起哮喘氣道重構的基礎。在小鼠哮喘模型中內源性 TFF2 表達增加，敲除了 TFF2 基因表達的小鼠給予外源性重組 TFF2 后可減輕哮喘慢性期的氣道重構[5]。哮喘患者內源性 TFF1 的表達升高，與維持氣道上皮的完整性相關[6]。本研究旨在探討 TFFs 對哮喘早期氣道炎癥的影響，通過建立小鼠急性過敏性氣道炎癥模型，檢測 TFF1、TFF3 在氣道中表達情況，并予以外源性重組 TFF3 及布地奈德干預，探討 TFF1 及 TFF3 對哮喘早期炎性浸潤及黏液分泌的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
BALB/c 雄性小鼠 40 只（鼠齡 6 周）由四川省人民醫院實驗動物中心提供［實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2008-110］。GradeⅡ級卵清蛋白（ovalbumin，OVA；Sigma 公司），Al（OH）3（廣州化學試劑廠），布地奈德霧化液（阿斯利康公司），人重組 TFF3（PROSPEC 公司），抗 TFF1 蛋白抗體、抗 TFF3 蛋白抗體為兔源多克隆抗體（博奧森公司），以及免疫組織化學試劑盒等。超聲霧化器，Image-Pro Plus 圖像分析軟件，光學顯微鏡等。
1.2 方法
1.2.1 急性過敏性氣道炎癥模型的建立
本實驗符合實驗動物倫理學要求。40 只小鼠隨機分為 5 組，每組 8 只。生理鹽水對照組（A 組）、急性過敏性氣道炎癥組（B 組）、布地奈德干預組（C 組）、TFF3 重組體干預組（D 組）及重組 TFF3+布地奈德干預組（E 組）。實驗第 0 天行腹腔注射致敏：B、C、D 及 E 組每次給予 80 μg OVA+ 1 mg Al（OH）3+200 μL 生理鹽水混懸液；A 組給予 200 μL 生理鹽水。實驗第 14、15、16、17 d 行霧化激發，B、C、D 及 E 組每次給予 1% OVA 溶液 10 mL 霧化吸入 0.5 h，A 組給予 10 mL 生理鹽水霧化吸入 0.5 h。A、B 和 C 組在霧化前 1 h 給予 50 μL 生理鹽水滴鼻；D 和 E 組在霧化前 1 h 予 TFF3 溶液（0.5 mg/mL）50 μL 滴鼻；C 和 E 組在霧化前 0.5 h 予 1 mg 布地奈德懸混液（普米克令舒 2 mL）加入 8 mL 生理鹽水稀釋后霧化吸入 0.5 h。
1.2.2 標本留取
小鼠末次激發 48 h 后（第 19 d），處死小鼠，并剪取氣管及右肺組織，常規脫水、透明、滲蠟、包埋脫水、切片（4 μm）。
1.2.3 蘇木精–伊紅染色觀測小鼠氣道炎癥
對切片行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin staining, HE）染色。每張切片隨機選取 5 個視野于 200 倍光鏡下觀察支氣管黏膜炎性細胞浸潤等病理改變，按照浸潤程度進行炎癥評分。評分標準：0 分：初級支氣管周圍極少量的炎癥細胞浸潤；1 分：初級支氣管周圍中等量的炎癥細胞浸潤；2 分：初級支氣管周圍中等量的炎癥細胞浸潤伴隨中級支氣管周圍中等量的炎癥細胞浸潤以及細支氣管、小血管周圍少量的炎癥細胞浸潤；3 分：主支氣管周圍大量的炎癥細胞浸潤伴隨中級支氣管周圍大量的炎癥細胞浸潤以及細支氣管、小血管周圍大量的炎癥細胞浸潤[7]。將每組的 5 次評分進行平均，得出每組最后評分。
1.2.4 阿辛藍染色觀測小鼠氣道黏液分泌
各組小鼠氣道黏液分泌采用阿辛藍染色法進行檢測。肺組織切片脫蠟至水、自來水水洗、蒸餾水水洗，醋酸液 30 s 瀝干，阿辛藍液染色 20～30 min，醋酸液 30 s，蒸餾水水洗 3 遍，核固紅染色液染色 3 min 后水洗，酸酒精液分化 20 s 后水洗，常規脫水透明封片。陽性細胞胞質含藍色顆粒。氣道上皮陽性細胞為杯狀細胞。計算氣道上皮杯狀細胞陽性細胞數及黏膜下腺累積光密度并取其平均值。
1.2.5 免疫組織化學觀測小鼠氣道 TFF1、TFF3 表達
各組小鼠氣道 TFF1、TFF3 蛋白檢測采用免疫組織化學染色 EnVision 二步法。切片脫蠟水化后，3% H2O2 水溶液處理 10 min，PBS 沖洗 5 min，檸檬酸緩沖液高壓修復 30 min，抗 TFF1、TFF3 抗體以 1∶300 稀釋后（一抗）孵育 10～30 min，4 ℃ 冰箱過夜，PBS 沖洗 5 min，EnVision 二抗孵育 10～30 min，PBS 沖洗 5 min，辣根過氧化氫酶 DAB 顯色試劑盒顯色 1～5 min，水洗，蘇木素復染，常規脫水透明封片。陽性細胞胞質含棕黃色顆粒。計算氣道上皮 TFF1、TFF3 平均光密度值并取其平均值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（
±s）表示，多組比較采用單因素方差分析法（ANOVA），組間兩兩比較采用 LSD 法，參數間的相關性采用 Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠氣道病理學改變
A 組鏡下見肺組織結構完整，未見明顯炎性細胞浸潤。B 組及 D 組小鼠光鏡下可見肺組織結構破壞，氣道上皮細胞完整性破壞，上皮增厚，黏液分泌增多，支氣管壁、血管周圍見大量炎癥細胞浸潤以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主。C 組及 E 組小鼠上述改變較輕。結果見圖 1。
圖1
各組小鼠氣道病理檢查像（HE ×200）
a. A 組正常氣道上皮；b. B 組炎細胞浸潤，氣道上皮完整性被破壞；c. C 組僅有少量炎細胞浸潤，氣道上皮相對完整；d. D 組仍有較多炎細胞浸潤，氣道上皮完整性被破壞；e. E 組僅有少量炎細胞浸潤，氣道上皮相對完整
2.2 氣道炎癥評分
B 組炎癥評分顯著大于 A 組（P<0.01）；C 組炎癥評分小于 B 組（P<0.05）；D 組與 B 組相比，炎癥評分無明顯差異（P>0.05）；E 組與 C 組相比，炎癥評分無明顯差異（P>0.05）。結果見表 1。
表1
小鼠炎癥評分及氣道上皮黏蛋白表達情況（n=8，
）
2.3 小鼠氣道黏液分泌情況
各組小鼠氣道上皮細胞、黏膜下腺細胞分泌的黏蛋白在染色后呈藍色。各組小鼠氣道上皮的杯狀細胞均有黏液分泌；B 組氣道上皮細胞陽性細胞數及黏膜下累積光密度均顯著大于 A 組（P<0.01）；C 組及 E 組氣道上皮細胞陽性細胞數及黏膜下累積光密度均明顯小于 B 組（P<0.05）；D 組與 B 組氣道上皮細胞陽性細胞數及黏膜下累積光密度差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1 和圖 2。
圖2
各組小鼠氣道黏液分泌情況（阿辛藍 ×200）
a. A 組黏液染色陽性細胞數最少；b. B 組黏液染色陽性細胞數最多；c. C 組黏液分泌陽性細胞數較 B 組少；d. D 組黏液染色陽性細胞數與 B 組相當；e. E 組黏液染色陽性細胞數與 C 組相當
2.4 免疫組織化學檢測氣道 TFF1、TFF3 的表達
TFF1、TFF3 在 A、B、C 組支氣管及細支氣管上皮細胞、杯狀細胞、黏膜下腺細胞均有表達，免疫組織化學顯示陽性信號在細胞胞漿管腔側。與 A 組比較，B 組陽性表達細胞數目多且強度高，氣道上皮 TFF1、TFF3 光密度值平均值顯著大于 A 組，差異有統計學意義（P<0.01）。與 B 組比較，C 組陽性表達細胞數目少且強度低，氣道上皮 TFF1、TFF3 光密度平均值小于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 2 和圖 3。
表2
小鼠氣道上皮 TFF1、TFF3 光密度值（n=8，
）
圖3
小鼠氣道 TFF1、TFF3 表達情況（免疫組織化學 ×200）
a. A 組 TFF1 表達最少；b. B 組 TFF1 表達最多；c. C 組 TFF1 表達較少；d. A 組 TFF3 表達最少；e. B 組 TFF3 表達最多；f. C 組 TFF3 表達較少
2.5 TFF1 及 TFF3 表達水平與炎性評分及黏蛋白表達水平的相關性分析
氣道 TFF1 表達水平與炎性評分呈顯著正相關（r=0.876，95% 可信區間 0.720～0.952，P=0.000），與黏蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.807，95% 可信區間 0.472～0.932，P=0.000）。TFF3 水平與炎性評分呈顯著正相關（r=0.654，95% 可信區間 0.348～0.937，P=0.006），與黏蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.666，95% 可信區間 0.461～0.849，P=0.005）。
3 討論
哮喘是由多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病[8]，其中過敏性哮喘屬于過敏性氣道疾病（allergic airway disease, AAD）的范疇。哮喘氣道炎癥持續及反復發作使氣道發生重構，導致持續非特異性氣道高反應性[9-10]。對于 AAD 模型的建立，一般采用小鼠 OVA 腹腔注射致敏及 OVA 霧化吸入激發的方式；根據暴露于致敏原的時間及頻率，可分為急性、亞急性及慢性過敏性氣道炎癥模型[11]。急性和亞急性模型主要用于研究哮喘的炎癥反應，而慢性模型主要用于研究哮喘的氣道重構和高反應性[12]。本研究的目的在于觀察哮喘的炎癥反應，因此建立了急性過敏性氣道炎癥的模型。
TFFs 是一類含有三葉結構域的蛋白質多肽家族，包括 TFF1、TFF2 和 TFF3。對于 TFFs 在呼吸系統中的表達情況，不同的研究得出了不同的結果。Madsen 等[13]發現正常人體氣道的上皮細胞中存在 TFF3 的高表達和 TFF1 的弱表達；dos Santos Silva 等[14]研究發現囊性纖維化患者合并炎癥的氣道中，杯狀細胞及靠近管腔的纖毛中均有 TFF1 及 TFF3 的表達。本研究顯示小鼠急性過敏性氣道炎癥期氣道中存在 TFF1 及 TFF3 的表達，且主要表達位點在黏液分泌細胞附近，這可能與 TFF1 及 TFF3 的表達與哮喘及慢性阻塞性肺疾病氣道黏液過度分泌有關[15-16]。關于 TFFs 與哮喘的研究，Royce 等[17]發現小鼠氣道中有 TFF2 的表達，而無 TFF1 及 TFF3 的表達，這與本研究觀察到小鼠氣道中存在 TFF1 及 TFF3 表達的結果不同。原因可能為：針對哮喘的不同階段，TFFs 中發揮作用的亞型不同。本研究是哮喘的急性過敏性氣道炎癥模型，主要病理表現為炎性細胞的浸潤。TFF1 及 TFF3 與黏蛋白的共同表達及分泌可能與哮喘早期對急性炎癥的防御有關。而 Royce 等[17]建立的是哮喘慢性過敏性氣道炎癥的模型，主要表現的是膠原蛋白沉著等氣道重構，TFF2 的表達上調可能與其在哮喘慢性期對抗氣道重構、發揮損傷修復作用有關。
在對小鼠急性過敏性氣道炎癥的干預中，我們采用了布地奈德、外源性 TFF3 及布地奈德聯合外源性 TFF3 三種方式。采用外源性 TFF3，而并非文獻中報道的 TFF2 是基于以下原因：首先，研究多提示 TFF2 與 AAD 慢性期的損傷重構相關，而對炎癥反應無明顯影響；Royce 等[5]和 Oertel 等[18]發現給予外源性 TFF2 的干預可以改善氣道上皮的損傷，但是對氣道的炎癥反應無影響，Nikolaidis 等[19-20]也發現過敏性炎癥誘導的小鼠氣道分泌上皮細胞表達增加的 TFF2 并不是炎癥反應的主要調節因子。其次，TFF3 有降低促炎物質產生、減輕炎性反應的作用[21]。我們觀察到布地奈德作為抑制哮喘炎癥反應的經典藥物確實可有效降低氣道的炎癥反應，同時氣道中表達的 TFF1 及 TFF3 下降，可能提示 TFFs 表達與炎癥有關；而外源性 TFF3 無論單用還是與布地奈德合用都不能產生抑制炎癥的作用。本研究因經費因素，未進行重組 TFF3 不同劑量的干預研究，故不能排除后者陰性結果與干預劑量有關。
本研究通過相關分析初步探討了 TFF1 及 TFF3 表達水平與氣道的炎癥評分及黏蛋白表達水平呈正相關。由于未使用 TFF 抑制劑或基因敲除的方法抑制 TFF 的表達，尚不足以說明 TFFs 的表達在小鼠急性過敏性氣道炎癥期的炎癥反應中所發揮的作用。
綜上所述，在小鼠急性過敏性氣道炎癥期，其氣道內源性 TFF1 及 TFF3 表達均升高，布地奈德干預后氣道 TFF1 及 TFF3 表達下降。但給予一定劑量的外源性重組 TFF3，并未發現其能有效降低小鼠氣道炎性細胞的浸潤及黏液的分泌，因此，本研究尚不能證明外源性 TFF3 在干預小鼠急性過敏性氣道炎癥期的氣道炎性反應中起重要作用，還須進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
三葉因子家族（trefoil factors，TFFs）是一類含有三葉結構域的蛋白質多肽家族，迄今在哺乳動物中發現的有 TFF1、TFF2 及 TFF3。TFFs 可存在于人體的多種組織中，發揮防御、修復等作用[1-4]，其中胃腸道及呼吸系統是其表達的重要器官。哮喘的相關研究表明，氣道上皮細胞的損傷修復缺陷，是引起哮喘氣道重構的基礎。在小鼠哮喘模型中內源性 TFF2 表達增加，敲除了 TFF2 基因表達的小鼠給予外源性重組 TFF2 后可減輕哮喘慢性期的氣道重構[5]。哮喘患者內源性 TFF1 的表達升高，與維持氣道上皮的完整性相關[6]。本研究旨在探討 TFFs 對哮喘早期氣道炎癥的影響，通過建立小鼠急性過敏性氣道炎癥模型，檢測 TFF1、TFF3 在氣道中表達情況，并予以外源性重組 TFF3 及布地奈德干預，探討 TFF1 及 TFF3 對哮喘早期炎性浸潤及黏液分泌的影響。
1 材料與方法
1.1 材料
BALB/c 雄性小鼠 40 只（鼠齡 6 周）由四川省人民醫院實驗動物中心提供［實驗動物使用許可證號：SYXK（川）2008-110］。GradeⅡ級卵清蛋白（ovalbumin，OVA；Sigma 公司），Al（OH）3（廣州化學試劑廠），布地奈德霧化液（阿斯利康公司），人重組 TFF3（PROSPEC 公司），抗 TFF1 蛋白抗體、抗 TFF3 蛋白抗體為兔源多克隆抗體（博奧森公司），以及免疫組織化學試劑盒等。超聲霧化器，Image-Pro Plus 圖像分析軟件，光學顯微鏡等。
1.2 方法
1.2.1 急性過敏性氣道炎癥模型的建立
本實驗符合實驗動物倫理學要求。40 只小鼠隨機分為 5 組，每組 8 只。生理鹽水對照組（A 組）、急性過敏性氣道炎癥組（B 組）、布地奈德干預組（C 組）、TFF3 重組體干預組（D 組）及重組 TFF3+布地奈德干預組（E 組）。實驗第 0 天行腹腔注射致敏：B、C、D 及 E 組每次給予 80 μg OVA+ 1 mg Al（OH）3+200 μL 生理鹽水混懸液；A 組給予 200 μL 生理鹽水。實驗第 14、15、16、17 d 行霧化激發，B、C、D 及 E 組每次給予 1% OVA 溶液 10 mL 霧化吸入 0.5 h，A 組給予 10 mL 生理鹽水霧化吸入 0.5 h。A、B 和 C 組在霧化前 1 h 給予 50 μL 生理鹽水滴鼻；D 和 E 組在霧化前 1 h 予 TFF3 溶液（0.5 mg/mL）50 μL 滴鼻；C 和 E 組在霧化前 0.5 h 予 1 mg 布地奈德懸混液（普米克令舒 2 mL）加入 8 mL 生理鹽水稀釋后霧化吸入 0.5 h。
1.2.2 標本留取
小鼠末次激發 48 h 后（第 19 d），處死小鼠，并剪取氣管及右肺組織，常規脫水、透明、滲蠟、包埋脫水、切片（4 μm）。
1.2.3 蘇木精–伊紅染色觀測小鼠氣道炎癥
對切片行蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin staining, HE）染色。每張切片隨機選取 5 個視野于 200 倍光鏡下觀察支氣管黏膜炎性細胞浸潤等病理改變，按照浸潤程度進行炎癥評分。評分標準：0 分：初級支氣管周圍極少量的炎癥細胞浸潤；1 分：初級支氣管周圍中等量的炎癥細胞浸潤；2 分：初級支氣管周圍中等量的炎癥細胞浸潤伴隨中級支氣管周圍中等量的炎癥細胞浸潤以及細支氣管、小血管周圍少量的炎癥細胞浸潤；3 分：主支氣管周圍大量的炎癥細胞浸潤伴隨中級支氣管周圍大量的炎癥細胞浸潤以及細支氣管、小血管周圍大量的炎癥細胞浸潤[7]。將每組的 5 次評分進行平均，得出每組最后評分。
1.2.4 阿辛藍染色觀測小鼠氣道黏液分泌
各組小鼠氣道黏液分泌采用阿辛藍染色法進行檢測。肺組織切片脫蠟至水、自來水水洗、蒸餾水水洗，醋酸液 30 s 瀝干，阿辛藍液染色 20～30 min，醋酸液 30 s，蒸餾水水洗 3 遍，核固紅染色液染色 3 min 后水洗，酸酒精液分化 20 s 后水洗，常規脫水透明封片。陽性細胞胞質含藍色顆粒。氣道上皮陽性細胞為杯狀細胞。計算氣道上皮杯狀細胞陽性細胞數及黏膜下腺累積光密度并取其平均值。
1.2.5 免疫組織化學觀測小鼠氣道 TFF1、TFF3 表達
各組小鼠氣道 TFF1、TFF3 蛋白檢測采用免疫組織化學染色 EnVision 二步法。切片脫蠟水化后，3% H2O2 水溶液處理 10 min，PBS 沖洗 5 min，檸檬酸緩沖液高壓修復 30 min，抗 TFF1、TFF3 抗體以 1∶300 稀釋后（一抗）孵育 10～30 min，4 ℃ 冰箱過夜，PBS 沖洗 5 min，EnVision 二抗孵育 10～30 min，PBS 沖洗 5 min，辣根過氧化氫酶 DAB 顯色試劑盒顯色 1～5 min，水洗，蘇木素復染，常規脫水透明封片。陽性細胞胞質含棕黃色顆粒。計算氣道上皮 TFF1、TFF3 平均光密度值并取其平均值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析法（ANOVA），組間兩兩比較采用 LSD 法，參數間的相關性采用 Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠氣道病理學改變
A 組鏡下見肺組織結構完整，未見明顯炎性細胞浸潤。B 組及 D 組小鼠光鏡下可見肺組織結構破壞，氣道上皮細胞完整性破壞，上皮增厚，黏液分泌增多，支氣管壁、血管周圍見大量炎癥細胞浸潤以嗜酸性粒細胞、淋巴細胞為主。C 組及 E 組小鼠上述改變較輕。結果見圖 1。
圖1
各組小鼠氣道病理檢查像（HE ×200）
a. A 組正常氣道上皮；b. B 組炎細胞浸潤，氣道上皮完整性被破壞；c. C 組僅有少量炎細胞浸潤，氣道上皮相對完整；d. D 組仍有較多炎細胞浸潤，氣道上皮完整性被破壞；e. E 組僅有少量炎細胞浸潤，氣道上皮相對完整
2.2 氣道炎癥評分
B 組炎癥評分顯著大于 A 組（P<0.01）；C 組炎癥評分小于 B 組（P<0.05）；D 組與 B 組相比，炎癥評分無明顯差異（P>0.05）；E 組與 C 組相比，炎癥評分無明顯差異（P>0.05）。結果見表 1。
表1
小鼠炎癥評分及氣道上皮黏蛋白表達情況（n=8，）
2.3 小鼠氣道黏液分泌情況
各組小鼠氣道上皮細胞、黏膜下腺細胞分泌的黏蛋白在染色后呈藍色。各組小鼠氣道上皮的杯狀細胞均有黏液分泌；B 組氣道上皮細胞陽性細胞數及黏膜下累積光密度均顯著大于 A 組（P<0.01）；C 組及 E 組氣道上皮細胞陽性細胞數及黏膜下累積光密度均明顯小于 B 組（P<0.05）；D 組與 B 組氣道上皮細胞陽性細胞數及黏膜下累積光密度差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1 和圖 2。
圖2
各組小鼠氣道黏液分泌情況（阿辛藍 ×200）
a. A 組黏液染色陽性細胞數最少；b. B 組黏液染色陽性細胞數最多；c. C 組黏液分泌陽性細胞數較 B 組少；d. D 組黏液染色陽性細胞數與 B 組相當；e. E 組黏液染色陽性細胞數與 C 組相當
2.4 免疫組織化學檢測氣道 TFF1、TFF3 的表達
TFF1、TFF3 在 A、B、C 組支氣管及細支氣管上皮細胞、杯狀細胞、黏膜下腺細胞均有表達，免疫組織化學顯示陽性信號在細胞胞漿管腔側。與 A 組比較，B 組陽性表達細胞數目多且強度高，氣道上皮 TFF1、TFF3 光密度值平均值顯著大于 A 組，差異有統計學意義（P<0.01）。與 B 組比較，C 組陽性表達細胞數目少且強度低，氣道上皮 TFF1、TFF3 光密度平均值小于 B 組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 2 和圖 3。
表2
小鼠氣道上皮 TFF1、TFF3 光密度值（n=8，）
圖3
小鼠氣道 TFF1、TFF3 表達情況（免疫組織化學 ×200）
a. A 組 TFF1 表達最少；b. B 組 TFF1 表達最多；c. C 組 TFF1 表達較少；d. A 組 TFF3 表達最少；e. B 組 TFF3 表達最多；f. C 組 TFF3 表達較少
2.5 TFF1 及 TFF3 表達水平與炎性評分及黏蛋白表達水平的相關性分析
氣道 TFF1 表達水平與炎性評分呈顯著正相關（r=0.876，95% 可信區間 0.720～0.952，P=0.000），與黏蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.807，95% 可信區間 0.472～0.932，P=0.000）。TFF3 水平與炎性評分呈顯著正相關（r=0.654，95% 可信區間 0.348～0.937，P=0.006），與黏蛋白表達水平呈顯著正相關（r=0.666，95% 可信區間 0.461～0.849，P=0.005）。
3 討論
哮喘是由多種炎性細胞參與的氣道慢性炎癥性疾病[8]，其中過敏性哮喘屬于過敏性氣道疾病（allergic airway disease, AAD）的范疇。哮喘氣道炎癥持續及反復發作使氣道發生重構，導致持續非特異性氣道高反應性[9-10]。對于 AAD 模型的建立，一般采用小鼠 OVA 腹腔注射致敏及 OVA 霧化吸入激發的方式；根據暴露于致敏原的時間及頻率，可分為急性、亞急性及慢性過敏性氣道炎癥模型[11]。急性和亞急性模型主要用于研究哮喘的炎癥反應，而慢性模型主要用于研究哮喘的氣道重構和高反應性[12]。本研究的目的在于觀察哮喘的炎癥反應，因此建立了急性過敏性氣道炎癥的模型。
TFFs 是一類含有三葉結構域的蛋白質多肽家族，包括 TFF1、TFF2 和 TFF3。對于 TFFs 在呼吸系統中的表達情況，不同的研究得出了不同的結果。Madsen 等[13]發現正常人體氣道的上皮細胞中存在 TFF3 的高表達和 TFF1 的弱表達；dos Santos Silva 等[14]研究發現囊性纖維化患者合并炎癥的氣道中，杯狀細胞及靠近管腔的纖毛中均有 TFF1 及 TFF3 的表達。本研究顯示小鼠急性過敏性氣道炎癥期氣道中存在 TFF1 及 TFF3 的表達，且主要表達位點在黏液分泌細胞附近，這可能與 TFF1 及 TFF3 的表達與哮喘及慢性阻塞性肺疾病氣道黏液過度分泌有關[15-16]。關于 TFFs 與哮喘的研究，Royce 等[17]發現小鼠氣道中有 TFF2 的表達，而無 TFF1 及 TFF3 的表達，這與本研究觀察到小鼠氣道中存在 TFF1 及 TFF3 表達的結果不同。原因可能為：針對哮喘的不同階段，TFFs 中發揮作用的亞型不同。本研究是哮喘的急性過敏性氣道炎癥模型，主要病理表現為炎性細胞的浸潤。TFF1 及 TFF3 與黏蛋白的共同表達及分泌可能與哮喘早期對急性炎癥的防御有關。而 Royce 等[17]建立的是哮喘慢性過敏性氣道炎癥的模型，主要表現的是膠原蛋白沉著等氣道重構，TFF2 的表達上調可能與其在哮喘慢性期對抗氣道重構、發揮損傷修復作用有關。
在對小鼠急性過敏性氣道炎癥的干預中，我們采用了布地奈德、外源性 TFF3 及布地奈德聯合外源性 TFF3 三種方式。采用外源性 TFF3，而并非文獻中報道的 TFF2 是基于以下原因：首先，研究多提示 TFF2 與 AAD 慢性期的損傷重構相關，而對炎癥反應無明顯影響；Royce 等[5]和 Oertel 等[18]發現給予外源性 TFF2 的干預可以改善氣道上皮的損傷，但是對氣道的炎癥反應無影響，Nikolaidis 等[19-20]也發現過敏性炎癥誘導的小鼠氣道分泌上皮細胞表達增加的 TFF2 并不是炎癥反應的主要調節因子。其次，TFF3 有降低促炎物質產生、減輕炎性反應的作用[21]。我們觀察到布地奈德作為抑制哮喘炎癥反應的經典藥物確實可有效降低氣道的炎癥反應，同時氣道中表達的 TFF1 及 TFF3 下降，可能提示 TFFs 表達與炎癥有關；而外源性 TFF3 無論單用還是與布地奈德合用都不能產生抑制炎癥的作用。本研究因經費因素，未進行重組 TFF3 不同劑量的干預研究，故不能排除后者陰性結果與干預劑量有關。
本研究通過相關分析初步探討了 TFF1 及 TFF3 表達水平與氣道的炎癥評分及黏蛋白表達水平呈正相關。由于未使用 TFF 抑制劑或基因敲除的方法抑制 TFF 的表達，尚不足以說明 TFFs 的表達在小鼠急性過敏性氣道炎癥期的炎癥反應中所發揮的作用。
綜上所述，在小鼠急性過敏性氣道炎癥期，其氣道內源性 TFF1 及 TFF3 表達均升高，布地奈德干預后氣道 TFF1 及 TFF3 表達下降。但給予一定劑量的外源性重組 TFF3，并未發現其能有效降低小鼠氣道炎性細胞的浸潤及黏液的分泌，因此，本研究尚不能證明外源性 TFF3 在干預小鼠急性過敏性氣道炎癥期的氣道炎性反應中起重要作用，還須進一步研究。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
