引用本文： 孫雨晴, 程朋朋, 於海洋, 王萌萌, 管雯斌, 韓鋒鋒. 自噬相關蛋白及基因在非小細胞肺癌中的表達及其意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(5): 447-451. doi: 10.7507/1671-6205.201811038 復制
肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發生率及死亡率居全球所有癌癥首位，并且每年仍有上升趨勢，嚴重威脅人類的生命安全與生活質量。目前，根據病因學研究，肺癌的預防、診斷及治療是越來越重要的問題。然而，由于肺癌治療方面進展緩慢，導致肺癌患者預后很差[1]。所以，盡管目前可以通過手術、化療、放療、靶向藥物等手段治療肺癌，但肺癌患者的生存期仍然很短暫，而且靶向藥物治療局限在小部分肺癌患者，故進一步探究肺癌的發病機制，對探究更多藥物靶向治療肺癌具有重要意義。近年來，自噬和腫瘤的關系逐漸引起重視，大量研究表明，自噬和自噬相關基因（autophagy-related genes，ATG）在腫瘤的發生、生長及轉移的過程中發揮重要的作用[2]。但不同自噬基因及蛋白在肺癌中的不同表達，是否可以為以后的治療提供靶向依據？是否可以通過肺癌組織中不同自噬蛋白表達水平與臨床病理特征的關系，對肺癌患者預后進行預測？本研究通過檢測肺癌組織和正常組織中自噬相關基因及其蛋白的表達水平，探究肺癌組織中自噬相關蛋白表達水平與臨床病理特征之間的關系，分析其在肺癌發病過程中的作用，為肺癌患者的治療提供新的理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2016 年 3 月至 2018 年 5 月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院因疑似非小細胞肺癌行手術切除的患者肺組織標本。肺癌組 29 例，正常組 32 例。肺癌組來自于病理診斷為非小細胞肺癌的組織，正常肺組織為遠離肺部病灶 5 cm 以外的肺組織。本研究經上海交通大學醫學院附屬新華醫院倫理委員會批準（XHEC-D-2019-048），所有受試對象均簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 試劑
微管相關蛋白 1 輕鏈 3（light chain 3，LC3）B 抗體、p62 抗體、ATG5 抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自于美國 Abcam 公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）山羊抗兔（二抗）、HRP 山羊抗鼠（二抗）購自于中國碧云天公司。p62、ATG5 引物合成購自于上海生物工程有限公司（由其設計并合成）。反轉錄試劑盒購自于日本 Takara 公司。
1.2.2 Western blot 測定肺組織中自噬相關基因 ATG5、p62、LC3B 的蛋白表達
分別取 30 mg 相同質量的肺組織與 300 μL 蛋白裂解液（RIPA 裂解液：PMSF=100∶1）混合后加入研磨器中，研磨至完全后，置于冰上，30 min 使其完全裂解，離心機冷卻至 4 ℃ 后，20 000 r/min 離心 20 min，取上清，根據 BCA 蛋白濃度測定試劑盒的說明書測定提取的肺組織樣本蛋白濃度。以 10%、12% SDS-PAGE 凝膠固定電壓 80 V 電泳 60 min 后，轉換成 120 V 電泳 40 min。電泳結束后，將所需凝膠轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 1～2 h，按 ATG5、LC3B、p62、β-actin 抗體說明書稀釋比例加入一抗，4 ℃ 孵育過夜。次日清洗一抗 3 次后，加入相對應的二抗 HRP 山羊抗鼠，HRP 山羊抗兔（1∶1 000 稀釋）于搖床上孵育 1 h，經發光劑顯影成像，應用 Image LabTM 軟件對檢測結果的灰度值進行分析。以目的蛋白相對表達量表示最終所需結果，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。
1.2.3 實時–聚合酶鏈反應方法檢測肺組織中自噬相關基因 ATG5、p62 的 mRNA 表達
取等質量的肺組織 50 mg 加入 1 mL TRIzol，混合后置入研磨器中研磨，RNA 提取后，反轉錄成互補 DNA（cDNA），以 cDNA 為模板，使用核苷酸膠體染料（SYBR Green）進行采用實時–聚合酶鏈反應（real-time PCR，RT-PCR） 。人 ATG5 的上游引物為 5’-GTGGCTGCAGATGGACAGTT-3’，下游引物 3’-GCCACTGCAGAGGTGTTTCC-5’；人 p62 上游引物為 5’-CCTGTGGTAGGAACCCGCTA-3’，下游引物為 3’-GTTTCACCTTCCGGAGCCAG-5’；人 β-actin 上游引物為 5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，下游引物為 3’-GGGCCGGACTCGTCATAC-5’。反應參數：95 ℃ 30 s×1 個循環，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s×40 個循環，95 ℃ 15 s×1 個循環，60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s×1 個循環，內參照為 β-actin。目的基因的計算方法為 2－△△Ct，結果以相對表達量表示。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。計數資料以頻數（n）表示，組間比較采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
正常組和肺癌組之間的年齡、性別及吸煙史構成比較，差異均無統計學意義（P>0.05），結果見表 1。
表1
正常組和肺癌組一般資料（
）
2.2 肺組織病理形態學觀察
正常肺組織鏡下可見肺泡壁，肺泡管結構完整，肺泡間隔無破壞，細胞分化良好，無異型性（圖 1a）。高分化腺癌鏡下可見癌細胞沿肺泡壁、肺泡管壁呈鱗屑樣生長，肺泡間隔大多未被破壞，故肺泡輪廓依然保留；低分化腺癌常無腺樣結構，呈實心條索狀，細胞異型性明顯（圖 1b）。高分化鱗癌可見癌巢中有角化珠形成，常可見細胞間橋，中分化時有細胞角化，但無角化珠形成，可有細胞間橋；低分化者，癌巢界限不是很明顯，細胞異型性大，無細胞內角化及角化珠形成（圖 1c）。腺鱗癌的癌組織內可見鱗癌和腺癌兩種成分，且在數量上大致相等（圖 1d）。
圖1
正常肺組織和不同病理類型的肺癌組織的病理檢查像（蘇木精–伊紅×100）
a. 正常肺組織：肺泡壁、肺泡管結構完整，肺泡間隔無破壞，細胞分化良好，無異型性；b. 腺癌：細胞沿肺泡壁、肺泡管壁呈鱗屑樣生長，肺泡間隔大多未被破壞；c. 鱗癌：癌巢中有角化珠形成，可見細胞間橋，細胞異型性大，無細胞內角化及角化珠形成；d. 腺鱗癌：癌組織內可見鱗癌和腺癌兩種成分，且在數量上大致相等
2.3 自噬相關蛋白 ATG5、LC3B、p62 的蛋白表達
ATG5、LC3B、p62 在正常組織及肺癌組織的相對表達量見表 2。肺癌組織中的 ATG5、p62 高表達，LC3B 低表達（圖 2）。與正常組比較，ATG5、LC3B、p62 在肺癌組織的蛋白相對表達量差異有統計學意義（P<0.05）。
表2
正常組和肺癌組 ATG5、LC3B、p62 的蛋白相對表達量（
）
圖2
正常組和肺癌組 ATG5、LC3B、p62 的蛋白表達電泳像
2.4 自噬相關基因 ATG5、p62 的 mRNA 表達
ATG5 和 p62 mRNA 在正常組織和肺癌組織的相對表達量見表 3。與正常組比較，ATG5 和 p62 在肺癌組織中的表達量均高于正常組織，差異有統計學意義（P<0.05）。
表3
正常組和肺癌組 ATG5、p62 mRNA 相對表達量（
）
2.5 ATG5、LC3B、p62 蛋白在 NSCLC 中的表達與臨床特征參數之間的關系
ATG5、LC3B、p62 的蛋白相對表達量在性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤病理類型、分化程度以及腫瘤 TNM 分期組間差異無統計學意義（P>0.05）。ATG5 的蛋白表達量在淋巴結是否轉移組間差異有統計學意義（P<0.05）。LC3B、p62 蛋白表達量在淋巴結是否轉移組間差異無統計學意義（P>0.05）。
表4
ATG5、LC3B、p62 蛋白在 NSCLC 中的表達與臨床特征參數之間的關系（
）
3 討論
細胞自噬作為一種新的細胞程序性死亡方式，是維持細胞內環境自穩的重要保護機制，是通過溶酶體介導的降解細胞內受損蛋白質或者細胞器的代謝及更新過程[3-4]。自噬主要包括三個過程，即膜結構包裹受損的蛋白質或者細胞器形成自噬小體，自噬小體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，以及自噬溶酶體對包裹的物質進行降解[5]。主要參與自噬小體形成的是兩個泛素化系統，一個是 ATG5-ATG12-ATG16L 復合物，ATG12 與 ATG5 C-末端的甘氨酸結合，形成 ATG5-ATG12 復合物，再與 ATG16L1 結合形成新的復合物，通過特異性的方式促進脂質和蛋白結合。其中 ATG5 是最常見的促表達變化的自噬因子，在惡性腫瘤的發生發展過程中起重要的作用。另一個是 LC3 蛋白與磷脂酰乙醇胺結合系統，其中 LC3B-Ⅱ蛋白位于自噬小體細胞質表面，是自噬小體形成的標志[4-6]，被用于說明自噬在良惡性腫瘤的增強與降低的情況[7]。SQSTM1/p62 是第一個被發現的自噬受體蛋白，對細胞解毒及抵抗營養壓力非常重要，在多種不同的細胞信號轉換及調節中也發揮重要的作用。p62 是一個多功能樞紐，參與很多重要的細胞增殖和凋亡過程，特別是腫瘤形成的條件中，調控著很多下游通路，促進腫瘤的發生。p62 作為自噬過程獨立的影響因素，在卵巢癌、乳腺癌、肝癌、腎癌等中都有報道[8-10]。
盡管自噬被認為是對整合壓力（營養缺乏、活性氧種類、內質網壓力）的適應性反應，但是在腫瘤方面卻發揮雙刃劍的作用。一方面，自噬抑制腫瘤發生發展；另一方面，自噬對細胞內壓力產生應答而發揮促進腫瘤生存的作用。研究發現肺癌的發生和大量基因的改變有關[11]，其中就包括 ATG5、LC3B 和 p62。文獻報道 LC3B 在肺癌中的表達下降[12]，p62 在肺癌中的表達增高[8]。ATG5 作為自噬小體形成過程重要的因子，目前在腫瘤中的表達報道不一。研究發現 ATG5 在前列腺癌和腎癌中表達增高，提示 ATG5 高表達可能是惡性腫瘤的早期事件或惡性進展的促進因素。然而，另有研究發現 ATG5 的表達水平在上皮性卵巢癌組織、肝癌組織和胃癌組織是降低的，提示 ATG5 可能抑制惡性腫瘤的發生和發展[13]。
在本研究中，LC3B 在肺癌中的表達明顯下降，p62 在肺癌中的表達顯著升高，ATG5 在肺癌中的表達增加，說明自噬水平增強，這與曾曉剛等[14]的研究結果一致，提示 ATG5 促進肺癌的發生和發展。ATG5 在不同腫瘤中表達水平不一致，可能是因為腫瘤類型多樣、應激模式多元性、自噬機制復雜、自噬檢測手段存在差異性以及細胞環境存在變化性等因素所致。NRF2-Keap1 對于人體抵抗親電氧化應激是核心的信號通路，p62 的過表達可完全與 Keap1 結合，從而穩定 NRF2，這可能導致腫瘤的發生。另外，p62 可激活核轉錄因子-κB 并通過該因子獨立轉錄導致腫瘤的轉移。而且，p62 可能會影響線粒體及有絲分裂的功能。以上方面可以解釋 p62 在肺癌中表達量增高、自噬水平增加的原因[15-18]。本研究結果提示在未來的研究中，可以通過干預自噬相關基因及蛋白，如增加 LC3B 的表達水平，降低 ATG5、p62 的表達水平，調控自噬在肺癌中的表達水平，延緩肺癌的進展，為未來肺癌的藥物靶向治療提供了新的思路。
本研究中，我們還對 ATG5、LC3B、p62 蛋白的表達與肺癌患者臨床病理特征的相關性進行分析。我們發現，ATG5、LC3B、p62 的蛋白相對表達量在性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤病理類型、分化程度以及腫瘤 TNM 分期組間差異無統計學意義（P>0.05）。在淋巴結是否轉移分組中，ATG5 的蛋白表達水平與淋巴結轉移有關（P<0.05），而 LC3B、p62 蛋白表達量與淋巴結是否轉移無關。但既往研究表明，LC3 在 NSCLC 的表達與患者的臨床分期和腫瘤分化程度有關[19]。這提示在肺癌的發生和發展中，LC3B 表達下調使自噬小體生成減少，自噬活性降低，增加了腫瘤的易感性，推動了腫瘤的進展。p62 作為一個自噬可選擇的底物，在很多病理情況下可發現其異常的蓄積[20]。王璁等[21]的研究結果提示 p62 高表達與患者的病理類型、臨床分期以及淋巴結轉移有關：在腺癌患者，TNM 分期 Ⅲ期、Ⅳ 期及無遠處轉移的患者中 p62 的陽性表達率顯著增高，提示自噬水平增強可能介導 NSCLC 的發生和發展過程。ATG5 的蛋白表達水平與肺癌患者淋巴結轉移相關，推測可根據淋巴結轉移情況判斷自噬水平的高低，從而進行干預與調控。本研究結果與王璁等[21]研究結果不一致，推測是研究方法、研究實驗條件等原因，也可能是因為自噬通路復雜多變，取樣標本的組織在自噬通路中表現不同。
自噬對腫瘤的作用是相互矛盾的，既可以抑制腫瘤細胞的生長，又可以促進腫瘤的發生和發展，確切地說，在腫瘤形成后自噬便開始維持腫瘤細胞的生長[22-23]。本研究結果也說明自噬在肺癌發生中發揮重要作用，但目前其具體機制并未完全明確。本課題組將進一步增加樣本量，使用多種方法檢測自噬在肺癌中的作用，增加對患者預后的統計及分析，充分掌握自噬的具體機制，為探討其作為肺癌預后標志物進行療效預測和預后判斷，以及作為肺癌患者治療新靶點的可能性提供理論依據。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發生率及死亡率居全球所有癌癥首位，并且每年仍有上升趨勢，嚴重威脅人類的生命安全與生活質量。目前，根據病因學研究，肺癌的預防、診斷及治療是越來越重要的問題。然而，由于肺癌治療方面進展緩慢，導致肺癌患者預后很差[1]。所以，盡管目前可以通過手術、化療、放療、靶向藥物等手段治療肺癌，但肺癌患者的生存期仍然很短暫，而且靶向藥物治療局限在小部分肺癌患者，故進一步探究肺癌的發病機制，對探究更多藥物靶向治療肺癌具有重要意義。近年來，自噬和腫瘤的關系逐漸引起重視，大量研究表明，自噬和自噬相關基因（autophagy-related genes，ATG）在腫瘤的發生、生長及轉移的過程中發揮重要的作用[2]。但不同自噬基因及蛋白在肺癌中的不同表達，是否可以為以后的治療提供靶向依據？是否可以通過肺癌組織中不同自噬蛋白表達水平與臨床病理特征的關系，對肺癌患者預后進行預測？本研究通過檢測肺癌組織和正常組織中自噬相關基因及其蛋白的表達水平，探究肺癌組織中自噬相關蛋白表達水平與臨床病理特征之間的關系，分析其在肺癌發病過程中的作用，為肺癌患者的治療提供新的理論依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取 2016 年 3 月至 2018 年 5 月在上海交通大學醫學院附屬新華醫院因疑似非小細胞肺癌行手術切除的患者肺組織標本。肺癌組 29 例，正常組 32 例。肺癌組來自于病理診斷為非小細胞肺癌的組織，正常肺組織為遠離肺部病灶 5 cm 以外的肺組織。本研究經上海交通大學醫學院附屬新華醫院倫理委員會批準（XHEC-D-2019-048），所有受試對象均簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 試劑
微管相關蛋白 1 輕鏈 3（light chain 3，LC3）B 抗體、p62 抗體、ATG5 抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自于美國 Abcam 公司。辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）山羊抗兔（二抗）、HRP 山羊抗鼠（二抗）購自于中國碧云天公司。p62、ATG5 引物合成購自于上海生物工程有限公司（由其設計并合成）。反轉錄試劑盒購自于日本 Takara 公司。
1.2.2 Western blot 測定肺組織中自噬相關基因 ATG5、p62、LC3B 的蛋白表達
分別取 30 mg 相同質量的肺組織與 300 μL 蛋白裂解液（RIPA 裂解液：PMSF=100∶1）混合后加入研磨器中，研磨至完全后，置于冰上，30 min 使其完全裂解，離心機冷卻至 4 ℃ 后，20 000 r/min 離心 20 min，取上清，根據 BCA 蛋白濃度測定試劑盒的說明書測定提取的肺組織樣本蛋白濃度。以 10%、12% SDS-PAGE 凝膠固定電壓 80 V 電泳 60 min 后，轉換成 120 V 電泳 40 min。電泳結束后，將所需凝膠轉移至 PVDF 膜，5% 脫脂奶粉封閉 1～2 h，按 ATG5、LC3B、p62、β-actin 抗體說明書稀釋比例加入一抗，4 ℃ 孵育過夜。次日清洗一抗 3 次后，加入相對應的二抗 HRP 山羊抗鼠，HRP 山羊抗兔（1∶1 000 稀釋）于搖床上孵育 1 h，經發光劑顯影成像，應用 Image LabTM 軟件對檢測結果的灰度值進行分析。以目的蛋白相對表達量表示最終所需結果，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。
1.2.3 實時–聚合酶鏈反應方法檢測肺組織中自噬相關基因 ATG5、p62 的 mRNA 表達
取等質量的肺組織 50 mg 加入 1 mL TRIzol，混合后置入研磨器中研磨，RNA 提取后，反轉錄成互補 DNA（cDNA），以 cDNA 為模板，使用核苷酸膠體染料（SYBR Green）進行采用實時–聚合酶鏈反應（real-time PCR，RT-PCR） 。人 ATG5 的上游引物為 5’-GTGGCTGCAGATGGACAGTT-3’，下游引物 3’-GCCACTGCAGAGGTGTTTCC-5’；人 p62 上游引物為 5’-CCTGTGGTAGGAACCCGCTA-3’，下游引物為 3’-GTTTCACCTTCCGGAGCCAG-5’；人 β-actin 上游引物為 5’-CCTGGCACCCAGCACAAT-3’，下游引物為 3’-GGGCCGGACTCGTCATAC-5’。反應參數：95 ℃ 30 s×1 個循環，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s×40 個循環，95 ℃ 15 s×1 個循環，60 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 15 s×1 個循環，內參照為 β-actin。目的基因的計算方法為 2－△△Ct，結果以相對表達量表示。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。計數資料以頻數（n）表示，組間比較采用 χ2 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料
正常組和肺癌組之間的年齡、性別及吸煙史構成比較，差異均無統計學意義（P>0.05），結果見表 1。
表1
正常組和肺癌組一般資料（）
2.2 肺組織病理形態學觀察
正常肺組織鏡下可見肺泡壁，肺泡管結構完整，肺泡間隔無破壞，細胞分化良好，無異型性（圖 1a）。高分化腺癌鏡下可見癌細胞沿肺泡壁、肺泡管壁呈鱗屑樣生長，肺泡間隔大多未被破壞，故肺泡輪廓依然保留；低分化腺癌常無腺樣結構，呈實心條索狀，細胞異型性明顯（圖 1b）。高分化鱗癌可見癌巢中有角化珠形成，常可見細胞間橋，中分化時有細胞角化，但無角化珠形成，可有細胞間橋；低分化者，癌巢界限不是很明顯，細胞異型性大，無細胞內角化及角化珠形成（圖 1c）。腺鱗癌的癌組織內可見鱗癌和腺癌兩種成分，且在數量上大致相等（圖 1d）。
圖1
正常肺組織和不同病理類型的肺癌組織的病理檢查像（蘇木精–伊紅×100）
a. 正常肺組織：肺泡壁、肺泡管結構完整，肺泡間隔無破壞，細胞分化良好，無異型性；b. 腺癌：細胞沿肺泡壁、肺泡管壁呈鱗屑樣生長，肺泡間隔大多未被破壞；c. 鱗癌：癌巢中有角化珠形成，可見細胞間橋，細胞異型性大，無細胞內角化及角化珠形成；d. 腺鱗癌：癌組織內可見鱗癌和腺癌兩種成分，且在數量上大致相等
2.3 自噬相關蛋白 ATG5、LC3B、p62 的蛋白表達
ATG5、LC3B、p62 在正常組織及肺癌組織的相對表達量見表 2。肺癌組織中的 ATG5、p62 高表達，LC3B 低表達（圖 2）。與正常組比較，ATG5、LC3B、p62 在肺癌組織的蛋白相對表達量差異有統計學意義（P<0.05）。
表2
正常組和肺癌組 ATG5、LC3B、p62 的蛋白相對表達量（）
圖2
正常組和肺癌組 ATG5、LC3B、p62 的蛋白表達電泳像
2.4 自噬相關基因 ATG5、p62 的 mRNA 表達
ATG5 和 p62 mRNA 在正常組織和肺癌組織的相對表達量見表 3。與正常組比較，ATG5 和 p62 在肺癌組織中的表達量均高于正常組織，差異有統計學意義（P<0.05）。
表3
正常組和肺癌組 ATG5、p62 mRNA 相對表達量（）
2.5 ATG5、LC3B、p62 蛋白在 NSCLC 中的表達與臨床特征參數之間的關系
ATG5、LC3B、p62 的蛋白相對表達量在性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤病理類型、分化程度以及腫瘤 TNM 分期組間差異無統計學意義（P>0.05）。ATG5 的蛋白表達量在淋巴結是否轉移組間差異有統計學意義（P<0.05）。LC3B、p62 蛋白表達量在淋巴結是否轉移組間差異無統計學意義（P>0.05）。
表4
ATG5、LC3B、p62 蛋白在 NSCLC 中的表達與臨床特征參數之間的關系（）
3 討論
細胞自噬作為一種新的細胞程序性死亡方式，是維持細胞內環境自穩的重要保護機制，是通過溶酶體介導的降解細胞內受損蛋白質或者細胞器的代謝及更新過程[3-4]。自噬主要包括三個過程，即膜結構包裹受損的蛋白質或者細胞器形成自噬小體，自噬小體與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，以及自噬溶酶體對包裹的物質進行降解[5]。主要參與自噬小體形成的是兩個泛素化系統，一個是 ATG5-ATG12-ATG16L 復合物，ATG12 與 ATG5 C-末端的甘氨酸結合，形成 ATG5-ATG12 復合物，再與 ATG16L1 結合形成新的復合物，通過特異性的方式促進脂質和蛋白結合。其中 ATG5 是最常見的促表達變化的自噬因子，在惡性腫瘤的發生發展過程中起重要的作用。另一個是 LC3 蛋白與磷脂酰乙醇胺結合系統，其中 LC3B-Ⅱ蛋白位于自噬小體細胞質表面，是自噬小體形成的標志[4-6]，被用于說明自噬在良惡性腫瘤的增強與降低的情況[7]。SQSTM1/p62 是第一個被發現的自噬受體蛋白，對細胞解毒及抵抗營養壓力非常重要，在多種不同的細胞信號轉換及調節中也發揮重要的作用。p62 是一個多功能樞紐，參與很多重要的細胞增殖和凋亡過程，特別是腫瘤形成的條件中，調控著很多下游通路，促進腫瘤的發生。p62 作為自噬過程獨立的影響因素，在卵巢癌、乳腺癌、肝癌、腎癌等中都有報道[8-10]。
盡管自噬被認為是對整合壓力（營養缺乏、活性氧種類、內質網壓力）的適應性反應，但是在腫瘤方面卻發揮雙刃劍的作用。一方面，自噬抑制腫瘤發生發展；另一方面，自噬對細胞內壓力產生應答而發揮促進腫瘤生存的作用。研究發現肺癌的發生和大量基因的改變有關[11]，其中就包括 ATG5、LC3B 和 p62。文獻報道 LC3B 在肺癌中的表達下降[12]，p62 在肺癌中的表達增高[8]。ATG5 作為自噬小體形成過程重要的因子，目前在腫瘤中的表達報道不一。研究發現 ATG5 在前列腺癌和腎癌中表達增高，提示 ATG5 高表達可能是惡性腫瘤的早期事件或惡性進展的促進因素。然而，另有研究發現 ATG5 的表達水平在上皮性卵巢癌組織、肝癌組織和胃癌組織是降低的，提示 ATG5 可能抑制惡性腫瘤的發生和發展[13]。
在本研究中，LC3B 在肺癌中的表達明顯下降，p62 在肺癌中的表達顯著升高，ATG5 在肺癌中的表達增加，說明自噬水平增強，這與曾曉剛等[14]的研究結果一致，提示 ATG5 促進肺癌的發生和發展。ATG5 在不同腫瘤中表達水平不一致，可能是因為腫瘤類型多樣、應激模式多元性、自噬機制復雜、自噬檢測手段存在差異性以及細胞環境存在變化性等因素所致。NRF2-Keap1 對于人體抵抗親電氧化應激是核心的信號通路，p62 的過表達可完全與 Keap1 結合，從而穩定 NRF2，這可能導致腫瘤的發生。另外，p62 可激活核轉錄因子-κB 并通過該因子獨立轉錄導致腫瘤的轉移。而且，p62 可能會影響線粒體及有絲分裂的功能。以上方面可以解釋 p62 在肺癌中表達量增高、自噬水平增加的原因[15-18]。本研究結果提示在未來的研究中，可以通過干預自噬相關基因及蛋白，如增加 LC3B 的表達水平，降低 ATG5、p62 的表達水平，調控自噬在肺癌中的表達水平，延緩肺癌的進展，為未來肺癌的藥物靶向治療提供了新的思路。
本研究中，我們還對 ATG5、LC3B、p62 蛋白的表達與肺癌患者臨床病理特征的相關性進行分析。我們發現，ATG5、LC3B、p62 的蛋白相對表達量在性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤病理類型、分化程度以及腫瘤 TNM 分期組間差異無統計學意義（P>0.05）。在淋巴結是否轉移分組中，ATG5 的蛋白表達水平與淋巴結轉移有關（P<0.05），而 LC3B、p62 蛋白表達量與淋巴結是否轉移無關。但既往研究表明，LC3 在 NSCLC 的表達與患者的臨床分期和腫瘤分化程度有關[19]。這提示在肺癌的發生和發展中，LC3B 表達下調使自噬小體生成減少，自噬活性降低，增加了腫瘤的易感性，推動了腫瘤的進展。p62 作為一個自噬可選擇的底物，在很多病理情況下可發現其異常的蓄積[20]。王璁等[21]的研究結果提示 p62 高表達與患者的病理類型、臨床分期以及淋巴結轉移有關：在腺癌患者，TNM 分期 Ⅲ期、Ⅳ 期及無遠處轉移的患者中 p62 的陽性表達率顯著增高，提示自噬水平增強可能介導 NSCLC 的發生和發展過程。ATG5 的蛋白表達水平與肺癌患者淋巴結轉移相關，推測可根據淋巴結轉移情況判斷自噬水平的高低，從而進行干預與調控。本研究結果與王璁等[21]研究結果不一致，推測是研究方法、研究實驗條件等原因，也可能是因為自噬通路復雜多變，取樣標本的組織在自噬通路中表現不同。
自噬對腫瘤的作用是相互矛盾的，既可以抑制腫瘤細胞的生長，又可以促進腫瘤的發生和發展，確切地說，在腫瘤形成后自噬便開始維持腫瘤細胞的生長[22-23]。本研究結果也說明自噬在肺癌發生中發揮重要作用，但目前其具體機制并未完全明確。本課題組將進一步增加樣本量，使用多種方法檢測自噬在肺癌中的作用，增加對患者預后的統計及分析，充分掌握自噬的具體機制，為探討其作為肺癌預后標志物進行療效預測和預后判斷，以及作為肺癌患者治療新靶點的可能性提供理論依據。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
