引用本文： 楊麗莎, 李福祥. 沉默 CDH1 基因促進非小細胞肺癌 A549 細胞系轉移侵襲的機制. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(5): 452-456. doi: 10.7507/1671-6205.201807042 復制
E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是由 CDH1 基因編碼的一種鈣依賴性黏附分子，其表達水平和多種腫瘤的分化和侵襲能力有關[1]。E-cadherin 表達缺失可以增加腫瘤細胞增殖能力，細胞間隙增大，腫瘤細胞易脫落并獲得較強的上皮間充質轉化能力，因此 CDH1 可以作為一種抑癌基因[2]。由于 CDH1 的表達主要受到甲基化調控，相關研究集中在甲基化調控中[3]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）目前是發病率較高的惡性腫瘤之一，在臨床中以外科手術和放化療為主，目前已有相關的文獻報道 CDH1 基因甲基化水平增高與 NSCLC 的惡性程度和分期等相關[4]，但是 CDH1 在 NSCLC 中的確切作用機制還未見報道。本研究主要采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）技術沉默在人 NSCLC 細胞株 A549 細胞中的 CDH1 基因，研究其對 A549 轉移侵襲的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
A549 細胞系購于上海細胞所，RPMI1640 完全培養基和 Opti-MEM 培養基（Gibco 公司），Lipofectamine2000 試劑（Invitrogen 公司），CDH1 基因的 siRNA 及其陰性對照（上海愛丁堡生物科技有限公司），Transwell 小室（康寧公司），實時定量 PCR（realtime quantitative PCR, RT-QPCR）試劑盒/SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Sinobio 公司），總 RNA 提取試劑盒（TRIzol 法；BioTeKe 公司）。波形蛋白（vimentin）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9 以及 N-cal 的一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗（Santa Cruz 公司），CCK-8 試劑盒（碧云天生物科技有限公司）。vimentin、MMP-2、MMP-9、Slug、Snail 的引物購于大連寶生物科技有限公司。
電子分析天平（梅特勒-托里多儀器有限公司，型號：ME204E）、DP11 顯微鏡（奧林巴斯公司）、PCR 儀（Bio-Rad 公司，型號：BS97MyCycler）、Western blot 電泳儀（Bio-Rad 公司，型號：1658001）、ChemiDoc MP 凝膠成像分析系統（Bio-Rad 公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及轉染
細胞復蘇后培養于 RPMI1640 完全培養基，37 ℃、5% CO2 飽和濕度下培養。每 3～5 天傳代一次。取對數期的細胞進行轉染。將細胞接種于 6 孔板內，待細胞長至 80% 左右進行轉染。設置對照組（Control）、siRNA 陰性對照組（siRNA-NC）和 CDH1 siRNA 組（siRNA-CDH1）。其中，Control 組常規培養細胞；siRNA-NC 組轉染無序 siRNA，作為對照；siRNA-CDH1 組轉染 CDH1 siRNA。siRNA 轉染的方法為：將 CDH1/NC-siRNA 溶解于 Opti-MEM 培養基中，室溫孵育 5 min，另外取 Lipofectamine2000 溶解于 Opti-MEM 培養基中，室溫孵育 5 min，混合兩種 Opti-MEM 液，孵育 5 min 后加入相應的細胞中，室溫孵育 6 h 后更換為正常的 DMEM 培養液進行培養。之后進行轉染效率的檢測。
1.2.2 RT-QPCR 檢測轉染后細胞中 CDH1 的 mRNA 表達水平
各組細胞在轉染后進行常規培養 48 h 后，收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗 2～3 次后加入 Trizol 試劑 1 mL 裂解 15 min，加入三氯甲烷 1 mL，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min，加入等體積的異丙醇混合后，靜置 10 min，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min 后取沉淀，紫外分光光度計下檢測 RNA 純度（吸光度在 0.8～1.0）。CDH1 的引物序列：上游引物 5’-ATTCTGTCCCCGGGGTGCTTGCT-3’，下游引物 5’-TGCGCGATTGCATGCGCGATGGC-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，GAPDH 的引物序列：上游引物 5’-TCGTCCCGTAGACAAAATGG-3’，下游引物 5’-TTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’。反應條件：95 ℃ 預變性 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循環 40 次。
1.2.3 CCK-8 檢測細胞活力
各組細胞在轉染后進行常規培養 6、12、24、36、48 h 后，加入 CCK-8 試劑 10 μL，孵育 4 h 后，在 480 nm 處檢測吸光度 A，每組細胞設置 3 個平行對照，計算細胞活力。細胞活力（%）=［（A 實驗組–A 空白）/（A 初始–A 空白）］ ×100%。
1.2.4 細胞劃痕實驗
將對數期的細胞接種在 6 孔板中，使其成為單層細胞，棄去常規培養基后用 10 μL 的移液槍在單層細胞上劃“一”字劃痕，PBS 清洗 3 次，棄去懸浮的細胞后，常規培養 24 h 后，在鏡下觀察細胞遷移的程度，利用 ImageJ 軟件進行實驗前后細胞遷移距離（S）測定和遷移能力的計算。遷移能力（%）=（1–S 實驗后/S 實驗前）×100%。
1.2.5 Transwell 小室檢測細胞的侵襲轉移能力
各組細胞在轉染后培養，取對數期的細胞加入 Transwell 小室，24 孔板下室加入完全培養基，待細胞貼壁后使用藥物干預，待培養 24 h 后取出小室，棄去培養基，甲醇固定后用 0.1% 的結晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞后鏡下觀察。取視野下進行侵襲細胞的計數，分別選擇 3 個視野計算細胞數。
1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達水平
收集各組細胞后加入 NP-40 裂解液冰上裂解 30 min，3 000 r/min 離心 30 min 后收集上清液，并使用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，調整各組蛋白濃度后進行上樣，經過 SDS-PAGE 凝膠電泳、PVDF 轉膜、脫脂牛奶封閉、一抗孵育、二抗標記后，ECL 發光液中激發熒光，顯影并定影。結果采用 ImageJ 灰度分析。以目的蛋白和內參蛋白 GAPDH 的相對表達量為結果。
1.2.7 RT-QPCR 檢測相關 mRNA 的表達水平
各組細胞在轉染后進行常規培養 48 h 后，收集細胞，PBS 洗 2～3 次后加入 Trizol 試劑 1 mL 裂解 15 min，加入三氯甲烷 1 mL，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min，加入等體積的異丙醇混合后，靜置 10 min，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min 后取沉淀，紫外分光光度計下檢測 RNA 純度，要求 A260/A280 在 0.8～1.0，按照 RT-QPCR 試劑盒操作檢測 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平。引物序列見表 1。
表1
引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。實驗結果以均數±標準差（
±s）表示，對組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用 Bonferoni 校正的 t 檢驗進行組間兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CDH1 沉默效率的鑒定
用 RT-QPCR 和 Western blot 檢測轉染后中 CDH1 的表達，結果顯示 Control 組中 CDH1 的 mRNA 和蛋白表達水平顯著高于 siRNA-CDH1 組，而 siRNA-NC 組中 CDH1 的蛋白和 mRNA 水平與 Control 組比較無顯著性差異（P>0.05），結果見圖 1。
圖1
siRNA 轉染后 CDH1 的表達水平（n=3，
）
a. Western blot 檢測結果；b. RT-QPCR 檢測結果
2.2 細胞活力的實驗結果
siRNA-CDH1 組細胞在 6、12、24、36、48 h 時間點檢測中，細胞活力逐漸上調，相比 Control 組和 siRNA-NC 組差異有統計學意義（P<0.05），而 Control 組和 siRNA-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 2。
圖2
A549 細胞活力檢測結果（n=3，
）
*與 Control 組比較，
2.3 細胞劃痕實驗結果
細胞培養 24 h 后三組細胞均有不同程度的遷移，從結果來看，Control 組和 siRNA-NC 組的遷移率無統計學差異（P>0.05），而 siRNA-CDH1 組細胞遷移率顯著高于 Control 組和 siRNA-NC 組（P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
A549 細胞遷移能力的實驗結果（n=3，
）
2.4 細胞侵襲實驗結果
Transwell 小室實驗結果顯示，Control 組和 siRNA-NC 組的侵襲能力無顯著性差異，而 siRNA-CDH1 中 A549 細胞侵襲能力顯著高于 Control 組和 siRNA-NC 組，可見 CDH1 沉默后 A549 細胞侵襲能力顯著上調。結果見圖 4。
圖4
A549 細胞侵襲實驗結果
Control 組和 siRNA-NC 組的侵襲能力無顯著性差異，而 siRNA-CDH1 中 A549 細胞侵襲能力顯著高于 Control 組和 siRNA-NC 組
2.5 細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平
Control 組和 siRNA-NC 組細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平比較無顯著性差異（P>0.05），而 siRNA-CDH1 組中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平相比 control 組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖 5。
圖5
細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平（n=3，
）
*與 Control 組比較，
2.6 細胞中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平
Control 組細胞和 siRNA-NC 組細胞中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平比較無顯著性差異（P>0.05），而 siRNA-CDH1 中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平相比 Control 組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖 6。
圖6
細胞中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平（n=3，
）
*與 Control 組比較，
3 討論
肺癌是常見的惡性腫瘤之一，而近年來肺癌的發病率和死亡率呈上升趨勢，尤其是我國目前城市中肺癌死亡率為 49.6/10 萬，農村為 39.6/10 萬，NSCLC 是肺癌中一個分類，目前發現的肺癌患者有一大部分屬于 NSCLC[5]。NSCLC 的發病發展是基于環境、遺傳等多方面共同作用的，研究發現，NSCLC 的發生和吸煙有著緊密的聯系，而 20% 的 NSCLC 和環境有關[6]。據現有的研究發現，細胞黏附相關的抑癌基因發生異常是腫瘤發生、擴散和轉移的重要因素，CDH1 作為黏附分子相關的重要基因，在 NSCLC 中也有重要的作用[7-8]。CDH1 位于人類染色體 16q22.1，屬于 cadherin 超家族，而 CDH1 的表達下調或者缺失與 NSCLC 分化、擴散和轉移密切相關，CDH1 的缺失會顯著增高胃癌、乳腺癌的發病[9]。MMPs 作為與 cadherin 密切相關的腫瘤轉移促進因子，其過表達可以導致 NSCLC 預后不良[10-12]，而關于 CDH1 基因與 NSCLC 明確的作用卻鮮有報道。
本研究采用 siRNA 技術沉默 A549 細胞中 CDH1 基因表達，從結果來看，轉染后細胞中 CDH1 的 mRNA 水平和蛋白水平表達顯著下調，CDH1 沉默后，A549 細胞活力顯著上調，且有明顯的時間依賴性，在劃痕實驗和 Transwell 小室實驗中發現 CDH1 沉默后細胞遷移和侵襲能力顯著增強，細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達上調，vimentin、N-cadherin 是細胞黏附的主要分子蛋白，與腫瘤細胞上皮間充質轉化有關，MMP-9 和 MMP-2 的表達增加可以促進腫瘤細胞周圍基質的降解，進一步促進腫瘤細胞的脫落和轉移。而基因水平檢測結果顯示，關鍵轉錄因子 Slug 和 Snail 的表達水平也顯著上調，Slug 和 Snail 是上皮間充質轉化發生的關鍵轉錄因子，其 mRNA 水平的表達增高可以說明細胞上皮間充質轉化能力增強，可以進一步促進細胞的侵襲和轉移，結果和上述 cadherin 和基質酶蛋白的水平結果相一致。
綜上，本研究發現 CDH1 在 A549 細胞中扮演著抑癌基因的角色，CDH1 的缺失可以導致 A549 細胞獲得較高的細胞活力，促進其轉移和侵襲，其作用機制和相關黏附蛋白低表達、基質酶高表達以及轉錄因子高表達有關。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
E-鈣黏蛋白（E-cadherin）是由 CDH1 基因編碼的一種鈣依賴性黏附分子，其表達水平和多種腫瘤的分化和侵襲能力有關[1]。E-cadherin 表達缺失可以增加腫瘤細胞增殖能力，細胞間隙增大，腫瘤細胞易脫落并獲得較強的上皮間充質轉化能力，因此 CDH1 可以作為一種抑癌基因[2]。由于 CDH1 的表達主要受到甲基化調控，相關研究集中在甲基化調控中[3]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）目前是發病率較高的惡性腫瘤之一，在臨床中以外科手術和放化療為主，目前已有相關的文獻報道 CDH1 基因甲基化水平增高與 NSCLC 的惡性程度和分期等相關[4]，但是 CDH1 在 NSCLC 中的確切作用機制還未見報道。本研究主要采用小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）技術沉默在人 NSCLC 細胞株 A549 細胞中的 CDH1 基因，研究其對 A549 轉移侵襲的作用。
1 材料與方法
1.1 材料
A549 細胞系購于上海細胞所，RPMI1640 完全培養基和 Opti-MEM 培養基（Gibco 公司），Lipofectamine2000 試劑（Invitrogen 公司），CDH1 基因的 siRNA 及其陰性對照（上海愛丁堡生物科技有限公司），Transwell 小室（康寧公司），實時定量 PCR（realtime quantitative PCR, RT-QPCR）試劑盒/SYBR Green Realtime PCR Master Mix（Sinobio 公司），總 RNA 提取試劑盒（TRIzol 法；BioTeKe 公司）。波形蛋白（vimentin）、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2、MMP-9 以及 N-cal 的一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗（Santa Cruz 公司），CCK-8 試劑盒（碧云天生物科技有限公司）。vimentin、MMP-2、MMP-9、Slug、Snail 的引物購于大連寶生物科技有限公司。
電子分析天平（梅特勒-托里多儀器有限公司，型號：ME204E）、DP11 顯微鏡（奧林巴斯公司）、PCR 儀（Bio-Rad 公司，型號：BS97MyCycler）、Western blot 電泳儀（Bio-Rad 公司，型號：1658001）、ChemiDoc MP 凝膠成像分析系統（Bio-Rad 公司）。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養及轉染
細胞復蘇后培養于 RPMI1640 完全培養基，37 ℃、5% CO2 飽和濕度下培養。每 3～5 天傳代一次。取對數期的細胞進行轉染。將細胞接種于 6 孔板內，待細胞長至 80% 左右進行轉染。設置對照組（Control）、siRNA 陰性對照組（siRNA-NC）和 CDH1 siRNA 組（siRNA-CDH1）。其中，Control 組常規培養細胞；siRNA-NC 組轉染無序 siRNA，作為對照；siRNA-CDH1 組轉染 CDH1 siRNA。siRNA 轉染的方法為：將 CDH1/NC-siRNA 溶解于 Opti-MEM 培養基中，室溫孵育 5 min，另外取 Lipofectamine2000 溶解于 Opti-MEM 培養基中，室溫孵育 5 min，混合兩種 Opti-MEM 液，孵育 5 min 后加入相應的細胞中，室溫孵育 6 h 后更換為正常的 DMEM 培養液進行培養。之后進行轉染效率的檢測。
1.2.2 RT-QPCR 檢測轉染后細胞中 CDH1 的 mRNA 表達水平
各組細胞在轉染后進行常規培養 48 h 后，收集細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗 2～3 次后加入 Trizol 試劑 1 mL 裂解 15 min，加入三氯甲烷 1 mL，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min，加入等體積的異丙醇混合后，靜置 10 min，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min 后取沉淀，紫外分光光度計下檢測 RNA 純度（吸光度在 0.8～1.0）。CDH1 的引物序列：上游引物 5’-ATTCTGTCCCCGGGGTGCTTGCT-3’，下游引物 5’-TGCGCGATTGCATGCGCGATGGC-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，GAPDH 的引物序列：上游引物 5’-TCGTCCCGTAGACAAAATGG-3’，下游引物 5’-TTGAGGTCAATGAAGGGGTC-3’。反應條件：95 ℃ 預變性 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s，循環 40 次。
1.2.3 CCK-8 檢測細胞活力
各組細胞在轉染后進行常規培養 6、12、24、36、48 h 后，加入 CCK-8 試劑 10 μL，孵育 4 h 后，在 480 nm 處檢測吸光度 A，每組細胞設置 3 個平行對照，計算細胞活力。細胞活力（%）=［（A 實驗組–A 空白）/（A 初始–A 空白）］ ×100%。
1.2.4 細胞劃痕實驗
將對數期的細胞接種在 6 孔板中，使其成為單層細胞，棄去常規培養基后用 10 μL 的移液槍在單層細胞上劃“一”字劃痕，PBS 清洗 3 次，棄去懸浮的細胞后，常規培養 24 h 后，在鏡下觀察細胞遷移的程度，利用 ImageJ 軟件進行實驗前后細胞遷移距離（S）測定和遷移能力的計算。遷移能力（%）=（1–S 實驗后/S 實驗前）×100%。
1.2.5 Transwell 小室檢測細胞的侵襲轉移能力
各組細胞在轉染后培養，取對數期的細胞加入 Transwell 小室，24 孔板下室加入完全培養基，待細胞貼壁后使用藥物干預，待培養 24 h 后取出小室，棄去培養基，甲醇固定后用 0.1% 的結晶紫染色，棉簽擦去上層未遷移的細胞后鏡下觀察。取視野下進行侵襲細胞的計數，分別選擇 3 個視野計算細胞數。
1.2.6 Western blot 檢測蛋白表達水平
收集各組細胞后加入 NP-40 裂解液冰上裂解 30 min，3 000 r/min 離心 30 min 后收集上清液，并使用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，調整各組蛋白濃度后進行上樣，經過 SDS-PAGE 凝膠電泳、PVDF 轉膜、脫脂牛奶封閉、一抗孵育、二抗標記后，ECL 發光液中激發熒光，顯影并定影。結果采用 ImageJ 灰度分析。以目的蛋白和內參蛋白 GAPDH 的相對表達量為結果。
1.2.7 RT-QPCR 檢測相關 mRNA 的表達水平
各組細胞在轉染后進行常規培養 48 h 后，收集細胞，PBS 洗 2～3 次后加入 Trizol 試劑 1 mL 裂解 15 min，加入三氯甲烷 1 mL，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min，加入等體積的異丙醇混合后，靜置 10 min，低溫下 12 000 r/min 離心 15 min 后取沉淀，紫外分光光度計下檢測 RNA 純度，要求 A260/A280 在 0.8～1.0，按照 RT-QPCR 試劑盒操作檢測 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平。引物序列見表 1。
表1
引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。實驗結果以均數±標準差（±s）表示，對組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并用 Bonferoni 校正的 t 檢驗進行組間兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CDH1 沉默效率的鑒定
用 RT-QPCR 和 Western blot 檢測轉染后中 CDH1 的表達，結果顯示 Control 組中 CDH1 的 mRNA 和蛋白表達水平顯著高于 siRNA-CDH1 組，而 siRNA-NC 組中 CDH1 的蛋白和 mRNA 水平與 Control 組比較無顯著性差異（P>0.05），結果見圖 1。
圖1
siRNA 轉染后 CDH1 的表達水平（n=3，）
a. Western blot 檢測結果；b. RT-QPCR 檢測結果
2.2 細胞活力的實驗結果
siRNA-CDH1 組細胞在 6、12、24、36、48 h 時間點檢測中，細胞活力逐漸上調，相比 Control 組和 siRNA-NC 組差異有統計學意義（P<0.05），而 Control 組和 siRNA-NC 組比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 2。
圖2
A549 細胞活力檢測結果（n=3，）
*與 Control 組比較，
2.3 細胞劃痕實驗結果
細胞培養 24 h 后三組細胞均有不同程度的遷移，從結果來看，Control 組和 siRNA-NC 組的遷移率無統計學差異（P>0.05），而 siRNA-CDH1 組細胞遷移率顯著高于 Control 組和 siRNA-NC 組（P<0.05）。結果見圖 3。
圖3
A549 細胞遷移能力的實驗結果（n=3，）
2.4 細胞侵襲實驗結果
Transwell 小室實驗結果顯示，Control 組和 siRNA-NC 組的侵襲能力無顯著性差異，而 siRNA-CDH1 中 A549 細胞侵襲能力顯著高于 Control 組和 siRNA-NC 組，可見 CDH1 沉默后 A549 細胞侵襲能力顯著上調。結果見圖 4。
圖4
A549 細胞侵襲實驗結果
Control 組和 siRNA-NC 組的侵襲能力無顯著性差異，而 siRNA-CDH1 中 A549 細胞侵襲能力顯著高于 Control 組和 siRNA-NC 組
2.5 細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平
Control 組和 siRNA-NC 組細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平比較無顯著性差異（P>0.05），而 siRNA-CDH1 組中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平相比 control 組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖 5。
圖5
細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達水平（n=3，）
*與 Control 組比較，
2.6 細胞中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平
Control 組細胞和 siRNA-NC 組細胞中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平比較無顯著性差異（P>0.05），而 siRNA-CDH1 中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平相比 Control 組，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖 6。
圖6
細胞中 vimentin、MMP-2、MMP-9 以及 Slug、Snail 的 mRNA 表達水平（n=3，）
*與 Control 組比較，
3 討論
肺癌是常見的惡性腫瘤之一，而近年來肺癌的發病率和死亡率呈上升趨勢，尤其是我國目前城市中肺癌死亡率為 49.6/10 萬，農村為 39.6/10 萬，NSCLC 是肺癌中一個分類，目前發現的肺癌患者有一大部分屬于 NSCLC[5]。NSCLC 的發病發展是基于環境、遺傳等多方面共同作用的，研究發現，NSCLC 的發生和吸煙有著緊密的聯系，而 20% 的 NSCLC 和環境有關[6]。據現有的研究發現，細胞黏附相關的抑癌基因發生異常是腫瘤發生、擴散和轉移的重要因素，CDH1 作為黏附分子相關的重要基因，在 NSCLC 中也有重要的作用[7-8]。CDH1 位于人類染色體 16q22.1，屬于 cadherin 超家族，而 CDH1 的表達下調或者缺失與 NSCLC 分化、擴散和轉移密切相關，CDH1 的缺失會顯著增高胃癌、乳腺癌的發病[9]。MMPs 作為與 cadherin 密切相關的腫瘤轉移促進因子，其過表達可以導致 NSCLC 預后不良[10-12]，而關于 CDH1 基因與 NSCLC 明確的作用卻鮮有報道。
本研究采用 siRNA 技術沉默 A549 細胞中 CDH1 基因表達，從結果來看，轉染后細胞中 CDH1 的 mRNA 水平和蛋白水平表達顯著下調，CDH1 沉默后，A549 細胞活力顯著上調，且有明顯的時間依賴性，在劃痕實驗和 Transwell 小室實驗中發現 CDH1 沉默后細胞遷移和侵襲能力顯著增強，細胞中 vimentin、MMP-9、MMP-2 以及 N-cadherin 的表達上調，vimentin、N-cadherin 是細胞黏附的主要分子蛋白，與腫瘤細胞上皮間充質轉化有關，MMP-9 和 MMP-2 的表達增加可以促進腫瘤細胞周圍基質的降解，進一步促進腫瘤細胞的脫落和轉移。而基因水平檢測結果顯示，關鍵轉錄因子 Slug 和 Snail 的表達水平也顯著上調，Slug 和 Snail 是上皮間充質轉化發生的關鍵轉錄因子，其 mRNA 水平的表達增高可以說明細胞上皮間充質轉化能力增強，可以進一步促進細胞的侵襲和轉移，結果和上述 cadherin 和基質酶蛋白的水平結果相一致。
綜上，本研究發現 CDH1 在 A549 細胞中扮演著抑癌基因的角色，CDH1 的缺失可以導致 A549 細胞獲得較高的細胞活力，促進其轉移和侵襲，其作用機制和相關黏附蛋白低表達、基質酶高表達以及轉錄因子高表達有關。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
