引用本文： 戈霞暉, 張悅, 張國瑞, 白沖. 骨髓間充質干細胞通過半乳凝素-1 抑制小鼠急性哮喘模型氣道炎癥. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(5): 432-440. doi: 10.7507/1671-6205.201811058 復制
支氣管哮喘是一種全球范圍內的常見病、多發病，全世界約有 3 億哮喘患者，已成為嚴重威脅公眾健康的主要慢性疾病之一。支氣管哮喘是一類以炎癥因子表達異常為主的變態反應性疾病，其特點表現為氣道炎癥、氣道高反應性和可逆性氣道阻塞。本課題組前期研究表明移植骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）能減輕哮喘氣道炎癥程度且能調節哮喘炎癥因子的水平[1-3]，進一步通過體外 BMSC 與樹突狀細胞（dendritic cell，DC）共培養，結果提示 BMSC 分泌的半乳凝素-1（galectin-1，gal-1）作用于 DC 細胞，抑制 DC 細胞對 T 細胞的增殖活性，而且 BMSC 分泌的 gal-1 是通過 MAPK 通路影響 DC 的免疫功能[4]。迄今為止鮮有報道體內 BMSC 分泌的 gal-1 對哮喘的作用，本研究進一步探討體內 BMSC 分泌的 gal-1 對哮喘的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和戊巴比妥鈉（Sigma 公司）；DMEM/F 12（Gibco 公司）；gal-1 重組蛋白（Sigma 公司）；BMSC 專用培養基（Sciencell 公司）；成脂和成骨分化試劑盒（廣州賽業科技有限公司）；抗小鼠單抗 Anti-SCA-1-PE（eBioscience 公司）、抗小鼠單抗 Anti-CD11c-PE、Anti-CD117-PE（Biolegend 公司）、抗小鼠單抗 Anti-CD29-FITC 和 Anti-CD45-FITC（Biolegend 公司）；兔抗小鼠抗體 p-P38、Total-P38、p-ERK、Total-ERK、p-JNK、Total-JNK（Cell signaling 公司）；白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5 和 gal-1 酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Invitrogen 公司）；MS 分選柱、抗小鼠 MACS-CD11c+ 微珠（Miltenyi 公司）。倒置相差顯微鏡（Olympus 公司）；FACSCalibur 流式細胞儀（Beckton Dickson 公司）；37 ℃ 恒溫 CO2 孵箱（Heraeus 公司）；LeicaQwin 計算機圖像分析系統（Leica 公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物
清潔級健康 6 周齡雄性 BALB/c 小鼠 20 只，體重 16～18 g，用以 BMSC 分離培養；清潔級 8～10 周齡 BALB /c 雌性小鼠 85 只，體重 18～20 g，用于肺組織 DC 細胞提取以及哮喘模型干預實驗。小鼠均由上海西普爾–必凱實驗動物有限公司提供，飼養于新華醫院無特定病原級動物房。
1.2.2 BMSC 的分離及擴增培養
按照文獻[5]的方法并略作修改。取 6 周齡雄性 BALB/c 小鼠，斷頸處死。無菌條件下取出小鼠股骨，以 DMEM/F12 培養基沖出骨髓，1 500 r/min 離心 3 min，棄上清，用 DMEM/F12 完全培養基重懸細胞，用 70 μm 小篩子過濾細胞懸液。以 2×106/mL 細胞密度接種于 25 cm2 培養瓶中，置入 37 ℃、5% CO2 培養箱內培養。48 h 后首次全量換液，棄掉未貼壁細胞。之后每 3 d 換液 1 次，在倒置相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態、貼壁及生長狀況。按常規方法傳代，取第 3 代至第 5 代細胞用于實驗。
1.2.3 表面標志的鑒定
取融合達 90% 的第 3 代 BMSC，用胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌 3 遍，調整細胞濃度至 1×106/mL。每個樣本取 1.5 mL 細胞懸液分別加熒光標記的單抗 SCA-1-PE、CD29-FITC、CD117-PE、CD45-FITC、CD11c-PE 及其同型對照各 10 μL，4 ℃ 下避光反應 30 min，PBS 漂洗 2 遍后進行流式細胞儀檢測，同型 IgG 做為陰性對照。
1.2.4 BMSC 的成骨、成脂分化
（1）成脂分化：取第 3 代 BMSC，待細胞達到 80%～90% 融合時，消化并按每孔 2×104 個細胞接種于六孔板，每孔加 2 mL 干細胞完全培養液，放入 37 ℃、5% CO2 孵箱中培養。每 3 d 換液 1 次，待細胞融合達 100% 后再培養 3 d，移去舊的培養液，每孔加入 2 mL 成脂誘導液 A 開始誘導。3 d 后更換成脂誘導液 B 進行維持，24 h 后再更換為成脂誘導液 A 誘導，如此進行 3 個循環。當脂滴出現較多但較小時，可以用成脂誘導液 B 維持 3～5 d，使脂滴增大。取細胞爬片，甲醇 –20 ℃ 固定 2 min，50% 乙醇洗滌，加入新鮮配制油紅工作液染色 15 min，然后以 50% 乙醇洗滌，蘇木精襯染約 2 min，蒸餾水洗滌后以甘油明膠封片，鏡下觀察。（2）成骨分化：取第 3 代 BMSC，待細胞融合達 80%～90% 時，消化并按每孔 3×103 接種于六孔板，同上加干細胞完全培養液放孵箱培養。24 h 后，移去舊的培養液，每孔加入 2 mL成骨誘導液。每 3 d 換液，誘導 2～3 周后，鈣結節形成，進行 von Kossa 法染色，鏡下觀察。
1.2.5 急性哮喘模型的制備、分組及標本留取
取 40 只雌性 8～10 周齡 BALB/c 小鼠，隨機分為 5 組，每組各 8 只，分別為正常對照組、哮喘模型組、BMSC 治療組、gal-1 治療組及 BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組。除正常對照組所有小鼠均制備急性哮喘模型。急性哮喘模型的制備分致敏和激發兩階段。致敏階段，分別于第 0 d、第 7 d 和第 14 d 腹腔注射致敏液 0.2 mL（20 μg 的 OVA 0.1 mL 與等體積佐劑液態鋁混合）；激發階段，分別于第 28 d、第 29 d、第 30 d 以 1% 的 OVA 溶液霧化，每天 1 次，每次 30 min，第 31 d 取材[6]，行支氣管肺泡灌洗，將支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）離心并收集上清液，–70 ℃ 冷凍保存待測細胞因子，細胞則用于涂片。其中，正常對照組小鼠的致敏和激發階段均用 PBS 替代，第 27 d 不注射任何藥物或細胞；哮喘模型組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前自尾靜脈緩慢注射 0.1 mL 的 PBS；BMSC 治療組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前每只小鼠自尾靜脈移植 1×106 個 BMSC 0.1 mL；gal-1 治療組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前自尾靜脈緩慢注射等體積 gal-1 重組蛋白溶液（每只 3 μg）；BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前自尾靜脈緩慢注射 1×106 個 BMSC 與 gal-1 抑制劑硫代二半乳糖苷 240 mg/kg，共 0.1 mL。
1.2.6 ELISA 檢測血清和 BALF 炎癥因子及 BALF 細胞分類計數
將 BALF 以 1 500 r/min 離心 10 min，收集上清液，按小鼠 ELISA 試劑盒說明檢測 IL-4、IL-5、OVA 特異性 IgE（OVA specific IgE，OVA-IgE）和 gal-1。取 200 μL PBS 重懸細胞沉淀，制備細胞甩片 2 張，DIF-QUIK 染色，至少計數 200 個細胞作細胞分類計數。
1.2.7 肺組織病理學檢查
氣管及左肺浸入 4% 中性甲醛，常規石蠟切片，蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及過碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）染色，光鏡下觀察支氣管肺組織的病理變化。
1.2.8 磁珠分選肺組織 DC 及蛋白印跡法檢測 DC 細胞 MAPK 信號通路的表達
取 45 只雌性 8～10 周齡 BALB/c 小鼠，隨機分為 5 組，每組各 9 只，分組和干預方法與 1.2.5 相同。按照王宏偉等［7］方法制備肺組織單細胞懸液，收集培養皿中單細胞懸液并重懸于 10 mL 的 RPMI1640 培養基中，37 ℃ 孵育 60 min。加入抗小鼠 MACS-CD11c+ 微珠，混勻后 4 ℃ 孵育 30 min 行 MS 分選柱分選。對各組小鼠分選出的 DC 細胞行蛋白印跡法檢測。加入細胞裂解液，充分混勻，冰盒裂解；用 BCA 法進行蛋白定量，經 15% SDS-PAGE 凝膠電泳并轉膜剪取目標條帶，脫脂奶封閉 1 h 后，分別孵上兔抗小鼠 p-ERK、Total-ERK、p-P38、Total-P38、p-JNK、Total-JNK 的一抗，4 ℃ 搖床過夜。第 2 d 室溫下孵山羊抗兔二抗 2 h，用 TBST 洗 3 次，每次 5 min，暗室中加入加辣根過氧化物酶標記發光液，黑白膠片曝光顯影。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計軟件。對各組數據先進行正態檢驗和方差分析，對符合正態分布和方差齊性數據，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重組間比較采用 LSD 法；不符合正態分布和方差齊性數據，進行非參數多重秩和檢驗（Kruskal-Wallis 法），并進一步采用 Nemenyi 法進行組間兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 BMSC 分離培養
原代培養：48 h 首次換液后，可見較多細胞已貼壁，胞體呈圓形或多邊形，漂浮的不貼壁細胞大部分隨換液除去；原代培養 5 d，貼壁細胞形態漸變為梭形或紡錘形，呈成纖維細胞樣生長，形成大小不一的集落（圖 1a）。7 d 時細胞變成長梭形，基本形成明顯克隆。傳代培養：傳代的細胞初始呈圓形，2～4 h 貼壁伸展，大多數細胞呈梭形的成纖維細胞樣形態，均勻性分布生長，細胞增多匯合呈漩渦狀或輻射狀排列。傳代培養的 BMSC 在形態學上更加趨于一致，為成纖維細胞樣（圖 1b）。
圖1
BMSC 培養細胞鏡下大體觀及成脂、成骨分化檢查像
a. 原代培養第 5 d，大量貼壁細胞形態多為梭形或紡錘形，形成大小不一的集落；b. 第 3 代 BMSC 第 2 d，大多數細胞呈梭形，細胞均勻分布生長且形態更加趨于一致；c. 成骨分化（von Kossa ×200），細胞間出現致密的、呈片狀棕褐色或棕黑色物質；d. 成脂分化（油紅×200），細胞胞漿內出現紅色脂滴，可呈串珠狀、環狀或圍繞細胞核分布
2.2 BMSC 表面標志的鑒定
體外培養的第 3 代的 BMSC 表面標志物流式細胞術檢測結果顯示，分離的細胞高表達 SCA-1-PE 和 CD29-FITC，低表達 CD45-FITC、CD117-PE 和 CD11c-PE（圖 2）。表明從小鼠分離培養的細胞符合 BMSC 的表面標志。
圖2
培養細胞表面標志物的流式細胞術檢測結果
培養細胞高表達 CD29（a）和 SCA-1（b），低表達 CD11c（c）、CD45（d）和 CD117（e）
2.3 BMSC 的成骨、成脂分化
取融合達到 80%～90% 的第 3 代 BMSC，按成骨誘導試劑說明書誘導分化培養至 21 d，成骨誘導培養后經 von Kossa 法染色顯示細胞間出現致密的、呈片狀棕褐色或棕黑色物質，在集落中央可見明顯的黑色團塊的鈣結節（圖 1c），證明 BMSC 有成骨分化能力。取融合達到 80%～90% 的第 3 代 BMSC，加入成脂誘導培養液后，BMSC 生長速度減緩，成脂誘導 14 d 后，油紅染色顯示 BMSC 細胞胞漿內出現紅色脂滴，可呈串珠狀、環狀或圍繞細胞核分布，部分脂滴融合為較大團塊，將細胞核擠向一邊（圖 1d），證明 BMSC 有成脂分化能力。
2.4 BALF 細胞計數
正常對照組 BALF 內可見散在的支氣管上皮細胞，少許單核細胞及淋巴細胞；哮喘模型組 BALF 中可見大量的炎性細胞，細胞總數較正常對照組明顯增多，以嗜酸性粒細胞為主，單核細胞及中性粒細胞亦較正常對照組增多；BMSC 治療組或 gal-1 治療組細胞總數較哮喘模型組明顯減少，尤其嗜酸性粒細胞減少顯著；BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組細胞總數無顯著減少，細胞分類類似哮喘模型組，以嗜酸性粒細胞為主，伴單核細胞及中性粒細胞。結果見圖 3。
圖3
各組小鼠 BALF 細胞檢查像（DIF-QUIK×200）
正常對照組（a）：細胞數量少，以支氣管上皮細胞及少許單核細胞和淋巴細胞為主；哮喘模型組（b）和 BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組（e）：大量嗜酸性粒細胞及少許單核細胞、淋巴細胞；BMSC 治療組（c）和 gal-1 治療組（d）：少許嗜酸性粒細胞及單核細胞、淋巴細胞
2.5 各組小鼠肺組織 HE 和 PAS 染色病理
正常對照組小鼠支氣管、血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤及杯狀細胞增生；哮喘模型組小鼠支氣管、血管旁有大量炎性細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主，支氣管上皮黏膜有杯狀細胞增生；而 BMSC 治療組及 gal-1 治療組可見支氣管、血管周圍少許炎癥細胞浸潤，輕度杯狀細胞增生，較哮喘模型組炎癥程度明顯減輕； BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組可見類似哮喘模型組的炎癥反應，表現為支氣管、血管旁有大量炎性細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主，支氣管上皮黏膜有杯狀細胞增生。結果見圖 4、5。
圖4
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×400）
a. 正常對照組，肺組織支氣管、血管周圍無炎癥細胞浸潤；b. 哮喘模型組，肺組織細支氣管及血管周圍大量炎細胞浸潤，以胞漿粉染的嗜酸性粒細胞為主；c. BMSC 治療組，肺組織細支氣管周圍少許炎細胞浸潤，可見少許嗜酸性粒細胞；d. gal-1 治療組，肺組織細支氣管周圍少許炎細胞浸潤，可見少許嗜酸性粒細胞；e. BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組，肺組織細支氣管及血管周圍大量炎細胞浸潤，以胞漿粉染的嗜酸性粒細胞為主
圖5
各組小鼠肺組織病理檢查像（PAS×400）
a. 正常對照組，肺組織終末細支氣管上皮黏膜無紫紅色染色，無杯狀細胞增生；b. 哮喘模型組，肺組織終末細支氣管可見上皮黏膜有大量有紫紅色杯狀細胞增生；c. BMSC 治療組，肺組織終末細支氣管上皮黏膜少許紫紅色染色，杯狀細胞輕度增生；d. gal-1 治療組，肺組織終末細支氣管上皮黏膜少許紫紅色染色，杯狀細胞輕度增生；e. BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組，終末細支氣管可見上皮黏膜有大量有紫紅色杯狀細胞增生
2.6 ELISA 檢測小鼠血清 OVA-IgE、BALF 中 IL-4、IL-5 和 gal-1
結果見圖 6。其中，哮喘模型組 BALF 中 IL-4、IL-5 水平較正常對照組明顯增高，而 gal-1 水平較正常對照組低，差異有統計學意義。BMSC 治療組和 gal-1 治療組 BALF 中 IL-4、IL-5 水平較哮喘模型組顯著下降，gal-1 水平較哮喘模型組明顯增高；BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組 BALF 中 IL-4、IL-5 較正常對照組顯著增高，gal-1 水平較正常對照組顯著降低，而與哮喘模型組無顯著差異。各組小鼠血清 IgE 水平檢測結果提示，哮喘模型組 IgE 水平較正常對照組明顯增高，BMSC 治療組和 gal-1 治療組 IgE 水平顯著下降，而 BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組 IgE 水平較正常對照組顯著增高，與哮喘模型組無顯著差異。
圖6
小鼠血清 OVA-IgE 及 BALF 中 IL-4、IL-5 和 gal-1 的 ELISA 檢測結果
a. 各組血清 OVA-IgE 檢測結果；b. 各組 BALF 中 IL-4 檢測結果；c. 各組 BALF 中 IL-5 檢測結果；d. 各組 BALF 中 gal-1 檢測結果。正常對照組與哮喘模型組比較，*
2.7 蛋白印跡法檢測體內 BMSC 表達的 gal-1 對 DC 細胞 MAPK 信號通路的影響
結果見圖 7。正常小鼠肺組織 DC 細胞有一定程度 ERK 磷酸化表達，而哮喘模型組肺組織 DC 細胞 ERK 磷酸化表達顯著下降，gal-1 治療組和 BMSC 治療組肺組織 DC 細胞 ERK 磷酸化明顯增強，BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組肺組織 DC 細胞 ERK 磷酸化程度介于哮喘模型組與正常對照組之間。
圖7
體內 BMSC 表達的 gal-1 對 DC 細胞 MAPK 信號通路的影響
a. ERK1/2 通路。ERK 磷酸化表達從低至高排序：哮喘模型組<BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組<正常對照組<BMSC 治療組≈gal-1 治療組。b. P38 通路。P38 磷酸化表達從低至高排序：BMSC 治療組<gal-1 治療組<正常對照組<BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組<哮喘模型組。c. JNK 通路。各組 JNK 磷酸化表達無明顯差異
正常小鼠肺組織 DC 細胞有一定程度 P38 磷酸化表達，而哮喘模型組肺組織 DC 細胞 P38 磷酸化表達顯著增強，gal-1 治療組和 BMSC 治療組肺組織 DC 細胞 P38 磷酸化明顯下降，BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組肺組織 DC 細胞 P38 磷酸化表達程度介于哮喘模型組與正常對照組之間。進一步對 JNK 檢測提示各組 JNK 磷酸化表達無明顯差異。
3 討論
gal-1 是一種有免疫抑制作用的凝集素家族成員，其結構上含有約 135 個氨基酸的糖類識別區，能與糖蛋白和糖脂上的寡聚糖配體結合，參與細胞黏附、遷移、增殖和免疫調節等多種生物學功能。大量研究表明，gal-1 可通過抑制生長、誘導凋亡及下調促炎因子的表達等方式，抑制 T 細胞的活性[8]。體外 gal-1 還可抑制單核、巨噬細胞的功能[9]。Barrionuevo 等[9]報道 gal-1 可通過激活 ERK1/2 通路增加單核、巨噬細胞表面的 FcγRI 表達，同時抑制 MHC-Ⅱ類分子的表達及依賴 MHC-Ⅱ類分子的抗原提呈作用，抑制單核、巨噬細胞抗原遞呈及吞噬作用。
BMSC 能分泌多種細胞因子從而發揮免疫調節作用。近年報道 BMSC 可分泌具有免疫抑制作用的 gal-1，從而抑制 T 淋巴細胞的增生[10]。Gieseke 等[11]采用逆轉錄聚合酶鏈反應方法檢測到 BMSC 高表達 gal-1 mRNA，而 gal-1 蛋白在 BMSC 胞漿、細胞膜表面均有分布，并能在 BMSC 培養液中檢測到，下調 gal-1 在 BMSC 的表達則明顯降低 BMSC 對 T 細胞的抑制功能。本課題組前期體外研究提示，BMSC 與 DC 細胞共培養 BMSC 是通過分泌 gal-1 抑制未成熟 DC 對 T 細胞增殖活性，且促進了未成熟 DC 分泌 IL-12、IL-10 和 gal-1 免疫抑制細胞因子，其機制系 BMSC 通過促進 DC 細胞 ERK 磷酸化的表達且抑制 P38 磷酸化的表達而發揮作用[4]。
有學者檢測哮喘患者及正常對照組誘導痰中巨噬細胞 gal 的水平，發現哮喘患者誘導痰中巨噬細胞 gal-1 的表達水平較正常對照組明顯下降[12]。近年研究提示 gal-1 能抑制小鼠哮喘模型嗜酸性粒細胞向氣道趨化，通過促進嗜酸性粒細胞凋亡和細胞遷移抑制氣道炎癥[13]。本研究提示 gal-1 重組蛋白靜脈治療的小鼠急性哮喘模型 BALF 及氣道炎癥明顯減輕，尤其嗜酸性粒細胞減少顯著，杯狀細胞增生減輕，本研究結果亦提示 gal-1 可以抑制小鼠急性哮喘模型嗜酸性粒細胞性的氣道炎癥。
如前所述，BMSC 可分泌具有免疫抑制作用的 gal-1，而 gal-1 能抑制哮喘氣道炎癥，而 BMSC 是否通過 gal-1 抑制哮喘氣道炎癥鮮有報道。本研究提示 BMSC 治療的小鼠哮喘模型的 BALF 及氣道炎癥明顯減緩，突出表現為嗜酸性粒細胞減少且杯狀細胞增生減輕，而 BMSC 治療的小鼠哮喘模型血清 gal-1 表達較未治療的小鼠哮喘模型明顯增高，但在予 BMSC 治療的同時予以 gal-1 抑制劑則逆轉了 BMSC 對哮喘氣道炎癥的抑制作用，而且血清 gal-1 水平也明顯下降，提示體內 BMSC 通過分泌 gal-1 抑制急性哮喘的氣道炎癥。
既往研究提示 IL-5 在嗜酸性粒細胞的產生和過敏性炎癥中發揮重要作用[14]。對采用基因敲除 IL-5 的小鼠予以過敏原致敏和激發，不能導致嗜酸性粒細胞聚集和特異性 IgE 的產生[15-16]。而 IL-4 在哮喘嗜酸性粒細胞的趨化方面發揮著重要作用[17-18]。由此可見，Th2 細胞因子（IL-4、IL-5）促進了嗜酸性粒細胞的分化、聚集及 OVA-IgE 的產生，從而導致了嗜酸性粒細胞性氣道浸潤為主的哮喘病理變化。本研究亦提示小鼠哮喘模型的氣道及肺泡內大量嗜酸性粒細胞聚集，且 BALF 中 IL-4、IL-5 顯著增高，血清 OVA-IgE 明顯增高，而 BMSC 移植或 gal-1 注射后 IL-4、IL-5 和 IgE 明顯減少，且氣道及 BALF 中炎癥細胞明顯減少，尤其嗜酸性粒細胞顯著減少，提示 BMSC 主要通過分泌 gal-1 抑制 Th2 細胞因子的炎癥反應，從而抑制了嗜酸性粒細胞的產生和聚集。
本課題組前期研究觀察了 BMSC 移植對慢性哮喘模型的治療作用，結果提示 BMSC 移植可顯著抑制小鼠的氣道重塑和氣道炎癥，提高小鼠發病中 CD4+CD25+Treg 細胞下降的比例。研究期間采用免疫熒光染色檢測 EGFP-BMSC 移植后第 10 d 和第 50 d 分別在小鼠體內的分布，結果表明移植后第 10 d 在肺組織僅可見少量的 EGFP-BMSC，而心臟、肝臟和脾臟卻未見 EGFP-BMSC；移植后第 50 d BMSC 在肺組織的量較移植后第 10 d 明顯減少。因此 BMSC 可向病灶部位趨化，而其免疫保護作用并非 BMSC 在肺氣道局部組織的定植和再生作用[1]。隨后，本課題組觀察了 BMSC 分泌的 gal-1 對哮喘的作用，體外研究提示 BMSC 分泌的 gal-1 通過 DC 效應細胞發揮免疫抑制作用，這一結果推動課題組進一步探討體內 BMSC 對哮喘治療作用是否也是通過 BMSC 分泌的 gal-1 作用于 DC 效應細胞[4]。本研究通過磁珠分選各組小鼠肺組織 DC 并進一步檢測各組 MAPK 通路表達的差異，結果提示 BMSC 分泌的 gal-1 通過增強 ERK 磷酸化和降低 P38 磷酸化表達調控 DC 細胞的功能，由此免疫調節小鼠氣道的炎癥程度。迄今鮮有報道體內 BMSC 分泌的 gal-1 作用于 DC 的機制研究。本研究為 BMSC 體內對哮喘治療作用機制提供了新思路。
總之，本研究通過對小鼠急性哮喘模型移植 BMSC 或靜脈注射 gal-1 重組蛋白，發現小鼠氣道及 BALF 炎癥程度受到了顯著的抑制，尤其嗜酸性粒細胞明顯減少，同時 BALF 中 Th2 細胞因子（IL-4、IL-5）也顯著降低，gal-1 增高明顯，血清 OVA-IgE 也顯著降低；而通過磁珠分選各組肺組織 DC 細胞并行 MAPK 通路檢測提示 BMSC 或 gal-1 移植可調節 ERK 磷酸化和 P38 磷酸化。本研究提示 BMSC 分泌的 gal-1 可能是通過作用于肺組織 DC 細胞、調節其 MAPK 通路而發揮對急性哮喘的治療作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
支氣管哮喘是一種全球范圍內的常見病、多發病，全世界約有 3 億哮喘患者，已成為嚴重威脅公眾健康的主要慢性疾病之一。支氣管哮喘是一類以炎癥因子表達異常為主的變態反應性疾病，其特點表現為氣道炎癥、氣道高反應性和可逆性氣道阻塞。本課題組前期研究表明移植骨髓間充質干細胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSC）能減輕哮喘氣道炎癥程度且能調節哮喘炎癥因子的水平[1-3]，進一步通過體外 BMSC 與樹突狀細胞（dendritic cell，DC）共培養，結果提示 BMSC 分泌的半乳凝素-1（galectin-1，gal-1）作用于 DC 細胞，抑制 DC 細胞對 T 細胞的增殖活性，而且 BMSC 分泌的 gal-1 是通過 MAPK 通路影響 DC 的免疫功能[4]。迄今為止鮮有報道體內 BMSC 分泌的 gal-1 對哮喘的作用，本研究進一步探討體內 BMSC 分泌的 gal-1 對哮喘的作用及其機制。
1 材料與方法
1.1 材料
雞卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和戊巴比妥鈉（Sigma 公司）；DMEM/F 12（Gibco 公司）；gal-1 重組蛋白（Sigma 公司）；BMSC 專用培養基（Sciencell 公司）；成脂和成骨分化試劑盒（廣州賽業科技有限公司）；抗小鼠單抗 Anti-SCA-1-PE（eBioscience 公司）、抗小鼠單抗 Anti-CD11c-PE、Anti-CD117-PE（Biolegend 公司）、抗小鼠單抗 Anti-CD29-FITC 和 Anti-CD45-FITC（Biolegend 公司）；兔抗小鼠抗體 p-P38、Total-P38、p-ERK、Total-ERK、p-JNK、Total-JNK（Cell signaling 公司）；白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-5 和 gal-1 酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（Invitrogen 公司）；MS 分選柱、抗小鼠 MACS-CD11c+ 微珠（Miltenyi 公司）。倒置相差顯微鏡（Olympus 公司）；FACSCalibur 流式細胞儀（Beckton Dickson 公司）；37 ℃ 恒溫 CO2 孵箱（Heraeus 公司）；LeicaQwin 計算機圖像分析系統（Leica 公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物
清潔級健康 6 周齡雄性 BALB/c 小鼠 20 只，體重 16～18 g，用以 BMSC 分離培養；清潔級 8～10 周齡 BALB /c 雌性小鼠 85 只，體重 18～20 g，用于肺組織 DC 細胞提取以及哮喘模型干預實驗。小鼠均由上海西普爾–必凱實驗動物有限公司提供，飼養于新華醫院無特定病原級動物房。
1.2.2 BMSC 的分離及擴增培養
按照文獻[5]的方法并略作修改。取 6 周齡雄性 BALB/c 小鼠，斷頸處死。無菌條件下取出小鼠股骨，以 DMEM/F12 培養基沖出骨髓，1 500 r/min 離心 3 min，棄上清，用 DMEM/F12 完全培養基重懸細胞，用 70 μm 小篩子過濾細胞懸液。以 2×106/mL 細胞密度接種于 25 cm2 培養瓶中，置入 37 ℃、5% CO2 培養箱內培養。48 h 后首次全量換液，棄掉未貼壁細胞。之后每 3 d 換液 1 次，在倒置相差顯微鏡下逐日觀察細胞形態、貼壁及生長狀況。按常規方法傳代，取第 3 代至第 5 代細胞用于實驗。
1.2.3 表面標志的鑒定
取融合達 90% 的第 3 代 BMSC，用胰蛋白酶消化，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）洗滌 3 遍，調整細胞濃度至 1×106/mL。每個樣本取 1.5 mL 細胞懸液分別加熒光標記的單抗 SCA-1-PE、CD29-FITC、CD117-PE、CD45-FITC、CD11c-PE 及其同型對照各 10 μL，4 ℃ 下避光反應 30 min，PBS 漂洗 2 遍后進行流式細胞儀檢測，同型 IgG 做為陰性對照。
1.2.4 BMSC 的成骨、成脂分化
（1）成脂分化：取第 3 代 BMSC，待細胞達到 80%～90% 融合時，消化并按每孔 2×104 個細胞接種于六孔板，每孔加 2 mL 干細胞完全培養液，放入 37 ℃、5% CO2 孵箱中培養。每 3 d 換液 1 次，待細胞融合達 100% 后再培養 3 d，移去舊的培養液，每孔加入 2 mL 成脂誘導液 A 開始誘導。3 d 后更換成脂誘導液 B 進行維持，24 h 后再更換為成脂誘導液 A 誘導，如此進行 3 個循環。當脂滴出現較多但較小時，可以用成脂誘導液 B 維持 3～5 d，使脂滴增大。取細胞爬片，甲醇 –20 ℃ 固定 2 min，50% 乙醇洗滌，加入新鮮配制油紅工作液染色 15 min，然后以 50% 乙醇洗滌，蘇木精襯染約 2 min，蒸餾水洗滌后以甘油明膠封片，鏡下觀察。（2）成骨分化：取第 3 代 BMSC，待細胞融合達 80%～90% 時，消化并按每孔 3×103 接種于六孔板，同上加干細胞完全培養液放孵箱培養。24 h 后，移去舊的培養液，每孔加入 2 mL成骨誘導液。每 3 d 換液，誘導 2～3 周后，鈣結節形成，進行 von Kossa 法染色，鏡下觀察。
1.2.5 急性哮喘模型的制備、分組及標本留取
取 40 只雌性 8～10 周齡 BALB/c 小鼠，隨機分為 5 組，每組各 8 只，分別為正常對照組、哮喘模型組、BMSC 治療組、gal-1 治療組及 BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組。除正常對照組所有小鼠均制備急性哮喘模型。急性哮喘模型的制備分致敏和激發兩階段。致敏階段，分別于第 0 d、第 7 d 和第 14 d 腹腔注射致敏液 0.2 mL（20 μg 的 OVA 0.1 mL 與等體積佐劑液態鋁混合）；激發階段，分別于第 28 d、第 29 d、第 30 d 以 1% 的 OVA 溶液霧化，每天 1 次，每次 30 min，第 31 d 取材[6]，行支氣管肺泡灌洗，將支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）離心并收集上清液，–70 ℃ 冷凍保存待測細胞因子，細胞則用于涂片。其中，正常對照組小鼠的致敏和激發階段均用 PBS 替代，第 27 d 不注射任何藥物或細胞；哮喘模型組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前自尾靜脈緩慢注射 0.1 mL 的 PBS；BMSC 治療組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前每只小鼠自尾靜脈移植 1×106 個 BMSC 0.1 mL；gal-1 治療組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前自尾靜脈緩慢注射等體積 gal-1 重組蛋白溶液（每只 3 μg）；BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組小鼠在急性哮喘模型制備的第 27 d 霧化激發前自尾靜脈緩慢注射 1×106 個 BMSC 與 gal-1 抑制劑硫代二半乳糖苷 240 mg/kg，共 0.1 mL。
1.2.6 ELISA 檢測血清和 BALF 炎癥因子及 BALF 細胞分類計數
將 BALF 以 1 500 r/min 離心 10 min，收集上清液，按小鼠 ELISA 試劑盒說明檢測 IL-4、IL-5、OVA 特異性 IgE（OVA specific IgE，OVA-IgE）和 gal-1。取 200 μL PBS 重懸細胞沉淀，制備細胞甩片 2 張，DIF-QUIK 染色，至少計數 200 個細胞作細胞分類計數。
1.2.7 肺組織病理學檢查
氣管及左肺浸入 4% 中性甲醛，常規石蠟切片，蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及過碘酸希夫（periodic acid Schiff，PAS）染色，光鏡下觀察支氣管肺組織的病理變化。
1.2.8 磁珠分選肺組織 DC 及蛋白印跡法檢測 DC 細胞 MAPK 信號通路的表達
取 45 只雌性 8～10 周齡 BALB/c 小鼠，隨機分為 5 組，每組各 9 只，分組和干預方法與 1.2.5 相同。按照王宏偉等［7］方法制備肺組織單細胞懸液，收集培養皿中單細胞懸液并重懸于 10 mL 的 RPMI1640 培養基中，37 ℃ 孵育 60 min。加入抗小鼠 MACS-CD11c+ 微珠，混勻后 4 ℃ 孵育 30 min 行 MS 分選柱分選。對各組小鼠分選出的 DC 細胞行蛋白印跡法檢測。加入細胞裂解液，充分混勻，冰盒裂解；用 BCA 法進行蛋白定量，經 15% SDS-PAGE 凝膠電泳并轉膜剪取目標條帶，脫脂奶封閉 1 h 后，分別孵上兔抗小鼠 p-ERK、Total-ERK、p-P38、Total-P38、p-JNK、Total-JNK 的一抗，4 ℃ 搖床過夜。第 2 d 室溫下孵山羊抗兔二抗 2 h，用 TBST 洗 3 次，每次 5 min，暗室中加入加辣根過氧化物酶標記發光液，黑白膠片曝光顯影。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 23.0 統計軟件。對各組數據先進行正態檢驗和方差分析，對符合正態分布和方差齊性數據，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），多重組間比較采用 LSD 法；不符合正態分布和方差齊性數據，進行非參數多重秩和檢驗（Kruskal-Wallis 法），并進一步采用 Nemenyi 法進行組間兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 BMSC 分離培養
原代培養：48 h 首次換液后，可見較多細胞已貼壁，胞體呈圓形或多邊形，漂浮的不貼壁細胞大部分隨換液除去；原代培養 5 d，貼壁細胞形態漸變為梭形或紡錘形，呈成纖維細胞樣生長，形成大小不一的集落（圖 1a）。7 d 時細胞變成長梭形，基本形成明顯克隆。傳代培養：傳代的細胞初始呈圓形，2～4 h 貼壁伸展，大多數細胞呈梭形的成纖維細胞樣形態，均勻性分布生長，細胞增多匯合呈漩渦狀或輻射狀排列。傳代培養的 BMSC 在形態學上更加趨于一致，為成纖維細胞樣（圖 1b）。
圖1
BMSC 培養細胞鏡下大體觀及成脂、成骨分化檢查像
a. 原代培養第 5 d，大量貼壁細胞形態多為梭形或紡錘形，形成大小不一的集落；b. 第 3 代 BMSC 第 2 d，大多數細胞呈梭形，細胞均勻分布生長且形態更加趨于一致；c. 成骨分化（von Kossa ×200），細胞間出現致密的、呈片狀棕褐色或棕黑色物質；d. 成脂分化（油紅×200），細胞胞漿內出現紅色脂滴，可呈串珠狀、環狀或圍繞細胞核分布
2.2 BMSC 表面標志的鑒定
體外培養的第 3 代的 BMSC 表面標志物流式細胞術檢測結果顯示，分離的細胞高表達 SCA-1-PE 和 CD29-FITC，低表達 CD45-FITC、CD117-PE 和 CD11c-PE（圖 2）。表明從小鼠分離培養的細胞符合 BMSC 的表面標志。
圖2
培養細胞表面標志物的流式細胞術檢測結果
培養細胞高表達 CD29（a）和 SCA-1（b），低表達 CD11c（c）、CD45（d）和 CD117（e）
2.3 BMSC 的成骨、成脂分化
取融合達到 80%～90% 的第 3 代 BMSC，按成骨誘導試劑說明書誘導分化培養至 21 d，成骨誘導培養后經 von Kossa 法染色顯示細胞間出現致密的、呈片狀棕褐色或棕黑色物質，在集落中央可見明顯的黑色團塊的鈣結節（圖 1c），證明 BMSC 有成骨分化能力。取融合達到 80%～90% 的第 3 代 BMSC，加入成脂誘導培養液后，BMSC 生長速度減緩，成脂誘導 14 d 后，油紅染色顯示 BMSC 細胞胞漿內出現紅色脂滴，可呈串珠狀、環狀或圍繞細胞核分布，部分脂滴融合為較大團塊，將細胞核擠向一邊（圖 1d），證明 BMSC 有成脂分化能力。
2.4 BALF 細胞計數
正常對照組 BALF 內可見散在的支氣管上皮細胞，少許單核細胞及淋巴細胞；哮喘模型組 BALF 中可見大量的炎性細胞，細胞總數較正常對照組明顯增多，以嗜酸性粒細胞為主，單核細胞及中性粒細胞亦較正常對照組增多；BMSC 治療組或 gal-1 治療組細胞總數較哮喘模型組明顯減少，尤其嗜酸性粒細胞減少顯著；BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組細胞總數無顯著減少，細胞分類類似哮喘模型組，以嗜酸性粒細胞為主，伴單核細胞及中性粒細胞。結果見圖 3。
圖3
各組小鼠 BALF 細胞檢查像（DIF-QUIK×200）
正常對照組（a）：細胞數量少，以支氣管上皮細胞及少許單核細胞和淋巴細胞為主；哮喘模型組（b）和 BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組（e）：大量嗜酸性粒細胞及少許單核細胞、淋巴細胞；BMSC 治療組（c）和 gal-1 治療組（d）：少許嗜酸性粒細胞及單核細胞、淋巴細胞
2.5 各組小鼠肺組織 HE 和 PAS 染色病理
正常對照組小鼠支氣管、血管周圍無明顯炎癥細胞浸潤及杯狀細胞增生；哮喘模型組小鼠支氣管、血管旁有大量炎性細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主，支氣管上皮黏膜有杯狀細胞增生；而 BMSC 治療組及 gal-1 治療組可見支氣管、血管周圍少許炎癥細胞浸潤，輕度杯狀細胞增生，較哮喘模型組炎癥程度明顯減輕； BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組可見類似哮喘模型組的炎癥反應，表現為支氣管、血管旁有大量炎性細胞浸潤，以嗜酸性粒細胞為主，支氣管上皮黏膜有杯狀細胞增生。結果見圖 4、5。
圖4
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×400）
a. 正常對照組，肺組織支氣管、血管周圍無炎癥細胞浸潤；b. 哮喘模型組，肺組織細支氣管及血管周圍大量炎細胞浸潤，以胞漿粉染的嗜酸性粒細胞為主；c. BMSC 治療組，肺組織細支氣管周圍少許炎細胞浸潤，可見少許嗜酸性粒細胞；d. gal-1 治療組，肺組織細支氣管周圍少許炎細胞浸潤，可見少許嗜酸性粒細胞；e. BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組，肺組織細支氣管及血管周圍大量炎細胞浸潤，以胞漿粉染的嗜酸性粒細胞為主
圖5
各組小鼠肺組織病理檢查像（PAS×400）
a. 正常對照組，肺組織終末細支氣管上皮黏膜無紫紅色染色，無杯狀細胞增生；b. 哮喘模型組，肺組織終末細支氣管可見上皮黏膜有大量有紫紅色杯狀細胞增生；c. BMSC 治療組，肺組織終末細支氣管上皮黏膜少許紫紅色染色，杯狀細胞輕度增生；d. gal-1 治療組，肺組織終末細支氣管上皮黏膜少許紫紅色染色，杯狀細胞輕度增生；e. BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組，終末細支氣管可見上皮黏膜有大量有紫紅色杯狀細胞增生
2.6 ELISA 檢測小鼠血清 OVA-IgE、BALF 中 IL-4、IL-5 和 gal-1
結果見圖 6。其中，哮喘模型組 BALF 中 IL-4、IL-5 水平較正常對照組明顯增高，而 gal-1 水平較正常對照組低，差異有統計學意義。BMSC 治療組和 gal-1 治療組 BALF 中 IL-4、IL-5 水平較哮喘模型組顯著下降，gal-1 水平較哮喘模型組明顯增高；BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組 BALF 中 IL-4、IL-5 較正常對照組顯著增高，gal-1 水平較正常對照組顯著降低，而與哮喘模型組無顯著差異。各組小鼠血清 IgE 水平檢測結果提示，哮喘模型組 IgE 水平較正常對照組明顯增高，BMSC 治療組和 gal-1 治療組 IgE 水平顯著下降，而 BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組 IgE 水平較正常對照組顯著增高，與哮喘模型組無顯著差異。
圖6
小鼠血清 OVA-IgE 及 BALF 中 IL-4、IL-5 和 gal-1 的 ELISA 檢測結果
a. 各組血清 OVA-IgE 檢測結果；b. 各組 BALF 中 IL-4 檢測結果；c. 各組 BALF 中 IL-5 檢測結果；d. 各組 BALF 中 gal-1 檢測結果。正常對照組與哮喘模型組比較，*
2.7 蛋白印跡法檢測體內 BMSC 表達的 gal-1 對 DC 細胞 MAPK 信號通路的影響
結果見圖 7。正常小鼠肺組織 DC 細胞有一定程度 ERK 磷酸化表達，而哮喘模型組肺組織 DC 細胞 ERK 磷酸化表達顯著下降，gal-1 治療組和 BMSC 治療組肺組織 DC 細胞 ERK 磷酸化明顯增強，BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組肺組織 DC 細胞 ERK 磷酸化程度介于哮喘模型組與正常對照組之間。
圖7
體內 BMSC 表達的 gal-1 對 DC 細胞 MAPK 信號通路的影響
a. ERK1/2 通路。ERK 磷酸化表達從低至高排序：哮喘模型組<BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組<正常對照組<BMSC 治療組≈gal-1 治療組。b. P38 通路。P38 磷酸化表達從低至高排序：BMSC 治療組<gal-1 治療組<正常對照組<BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組<哮喘模型組。c. JNK 通路。各組 JNK 磷酸化表達無明顯差異
正常小鼠肺組織 DC 細胞有一定程度 P38 磷酸化表達，而哮喘模型組肺組織 DC 細胞 P38 磷酸化表達顯著增強，gal-1 治療組和 BMSC 治療組肺組織 DC 細胞 P38 磷酸化明顯下降，BMSC 聯合 gal-1 抑制劑組肺組織 DC 細胞 P38 磷酸化表達程度介于哮喘模型組與正常對照組之間。進一步對 JNK 檢測提示各組 JNK 磷酸化表達無明顯差異。
3 討論
gal-1 是一種有免疫抑制作用的凝集素家族成員，其結構上含有約 135 個氨基酸的糖類識別區，能與糖蛋白和糖脂上的寡聚糖配體結合，參與細胞黏附、遷移、增殖和免疫調節等多種生物學功能。大量研究表明，gal-1 可通過抑制生長、誘導凋亡及下調促炎因子的表達等方式，抑制 T 細胞的活性[8]。體外 gal-1 還可抑制單核、巨噬細胞的功能[9]。Barrionuevo 等[9]報道 gal-1 可通過激活 ERK1/2 通路增加單核、巨噬細胞表面的 FcγRI 表達，同時抑制 MHC-Ⅱ類分子的表達及依賴 MHC-Ⅱ類分子的抗原提呈作用，抑制單核、巨噬細胞抗原遞呈及吞噬作用。
BMSC 能分泌多種細胞因子從而發揮免疫調節作用。近年報道 BMSC 可分泌具有免疫抑制作用的 gal-1，從而抑制 T 淋巴細胞的增生[10]。Gieseke 等[11]采用逆轉錄聚合酶鏈反應方法檢測到 BMSC 高表達 gal-1 mRNA，而 gal-1 蛋白在 BMSC 胞漿、細胞膜表面均有分布，并能在 BMSC 培養液中檢測到，下調 gal-1 在 BMSC 的表達則明顯降低 BMSC 對 T 細胞的抑制功能。本課題組前期體外研究提示，BMSC 與 DC 細胞共培養 BMSC 是通過分泌 gal-1 抑制未成熟 DC 對 T 細胞增殖活性，且促進了未成熟 DC 分泌 IL-12、IL-10 和 gal-1 免疫抑制細胞因子，其機制系 BMSC 通過促進 DC 細胞 ERK 磷酸化的表達且抑制 P38 磷酸化的表達而發揮作用[4]。
有學者檢測哮喘患者及正常對照組誘導痰中巨噬細胞 gal 的水平，發現哮喘患者誘導痰中巨噬細胞 gal-1 的表達水平較正常對照組明顯下降[12]。近年研究提示 gal-1 能抑制小鼠哮喘模型嗜酸性粒細胞向氣道趨化，通過促進嗜酸性粒細胞凋亡和細胞遷移抑制氣道炎癥[13]。本研究提示 gal-1 重組蛋白靜脈治療的小鼠急性哮喘模型 BALF 及氣道炎癥明顯減輕，尤其嗜酸性粒細胞減少顯著，杯狀細胞增生減輕，本研究結果亦提示 gal-1 可以抑制小鼠急性哮喘模型嗜酸性粒細胞性的氣道炎癥。
如前所述，BMSC 可分泌具有免疫抑制作用的 gal-1，而 gal-1 能抑制哮喘氣道炎癥，而 BMSC 是否通過 gal-1 抑制哮喘氣道炎癥鮮有報道。本研究提示 BMSC 治療的小鼠哮喘模型的 BALF 及氣道炎癥明顯減緩，突出表現為嗜酸性粒細胞減少且杯狀細胞增生減輕，而 BMSC 治療的小鼠哮喘模型血清 gal-1 表達較未治療的小鼠哮喘模型明顯增高，但在予 BMSC 治療的同時予以 gal-1 抑制劑則逆轉了 BMSC 對哮喘氣道炎癥的抑制作用，而且血清 gal-1 水平也明顯下降，提示體內 BMSC 通過分泌 gal-1 抑制急性哮喘的氣道炎癥。
既往研究提示 IL-5 在嗜酸性粒細胞的產生和過敏性炎癥中發揮重要作用[14]。對采用基因敲除 IL-5 的小鼠予以過敏原致敏和激發，不能導致嗜酸性粒細胞聚集和特異性 IgE 的產生[15-16]。而 IL-4 在哮喘嗜酸性粒細胞的趨化方面發揮著重要作用[17-18]。由此可見，Th2 細胞因子（IL-4、IL-5）促進了嗜酸性粒細胞的分化、聚集及 OVA-IgE 的產生，從而導致了嗜酸性粒細胞性氣道浸潤為主的哮喘病理變化。本研究亦提示小鼠哮喘模型的氣道及肺泡內大量嗜酸性粒細胞聚集，且 BALF 中 IL-4、IL-5 顯著增高，血清 OVA-IgE 明顯增高，而 BMSC 移植或 gal-1 注射后 IL-4、IL-5 和 IgE 明顯減少，且氣道及 BALF 中炎癥細胞明顯減少，尤其嗜酸性粒細胞顯著減少，提示 BMSC 主要通過分泌 gal-1 抑制 Th2 細胞因子的炎癥反應，從而抑制了嗜酸性粒細胞的產生和聚集。
本課題組前期研究觀察了 BMSC 移植對慢性哮喘模型的治療作用，結果提示 BMSC 移植可顯著抑制小鼠的氣道重塑和氣道炎癥，提高小鼠發病中 CD4+CD25+Treg 細胞下降的比例。研究期間采用免疫熒光染色檢測 EGFP-BMSC 移植后第 10 d 和第 50 d 分別在小鼠體內的分布，結果表明移植后第 10 d 在肺組織僅可見少量的 EGFP-BMSC，而心臟、肝臟和脾臟卻未見 EGFP-BMSC；移植后第 50 d BMSC 在肺組織的量較移植后第 10 d 明顯減少。因此 BMSC 可向病灶部位趨化，而其免疫保護作用并非 BMSC 在肺氣道局部組織的定植和再生作用[1]。隨后，本課題組觀察了 BMSC 分泌的 gal-1 對哮喘的作用，體外研究提示 BMSC 分泌的 gal-1 通過 DC 效應細胞發揮免疫抑制作用，這一結果推動課題組進一步探討體內 BMSC 對哮喘治療作用是否也是通過 BMSC 分泌的 gal-1 作用于 DC 效應細胞[4]。本研究通過磁珠分選各組小鼠肺組織 DC 并進一步檢測各組 MAPK 通路表達的差異，結果提示 BMSC 分泌的 gal-1 通過增強 ERK 磷酸化和降低 P38 磷酸化表達調控 DC 細胞的功能，由此免疫調節小鼠氣道的炎癥程度。迄今鮮有報道體內 BMSC 分泌的 gal-1 作用于 DC 的機制研究。本研究為 BMSC 體內對哮喘治療作用機制提供了新思路。
總之，本研究通過對小鼠急性哮喘模型移植 BMSC 或靜脈注射 gal-1 重組蛋白，發現小鼠氣道及 BALF 炎癥程度受到了顯著的抑制，尤其嗜酸性粒細胞明顯減少，同時 BALF 中 Th2 細胞因子（IL-4、IL-5）也顯著降低，gal-1 增高明顯，血清 OVA-IgE 也顯著降低；而通過磁珠分選各組肺組織 DC 細胞并行 MAPK 通路檢測提示 BMSC 或 gal-1 移植可調節 ERK 磷酸化和 P38 磷酸化。本研究提示 BMSC 分泌的 gal-1 可能是通過作用于肺組織 DC 細胞、調節其 MAPK 通路而發揮對急性哮喘的治療作用。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
